劉小改,馬美榮,李洪媛,馬東碩,王小偉,張 坤
(北京紅星股份有限公司,北京 101400)
中國(guó)白酒大曲制曲歷史悠久,自古就有“曲乃酒之骨”之說(shuō)?!稌?shū)經(jīng)·說(shuō)命篇》記載:“若作酒醴,爾惟曲蘗”,曲蘗就是酒曲的起源。大曲綜合物系、酶系、菌系于一體,是重要的微生物群落載體[1-2]。清香型大曲包含霉菌、酵母菌、細(xì)菌等各類微生物,在白酒釀造過(guò)程中起糖化、發(fā)酵、生香作用[3]。
乙酸乙酯是清香型白酒中主要呈味物質(zhì),對(duì)改變酒體的風(fēng)味組成、賦予酒體濃郁香氣及促進(jìn)酒體豐滿協(xié)調(diào)具有重要作用,其含量高低決定著清香型白酒的風(fēng)格質(zhì)量[4-5]。研究資料表明,清香型酒中乙酸乙酯合成主要通過(guò)3 種途徑:乙醇與乙酸通過(guò)化學(xué)反應(yīng)合成;乙醇與乙酸在胞外酯化酶催化作用下合成;在酵母細(xì)胞中,乙醇與乙酰輔酶A 在醇?;D(zhuǎn)移酶(AATase)催化作用下合成。其中后兩者為生物學(xué)反應(yīng)[6-7]。
酯化酶在酶學(xué)分類上屬于酯酶(Esterase E.C.3.1.1.2)范疇,是由具有酸、醇酯化功能的特定種類微生物發(fā)酵產(chǎn)生[8]。研究表明[9],酯酶大量存在于霉菌、酵母菌、細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中,既可以水解酯類,也可以催化合成低級(jí)脂肪酸酯。
白酒釀造過(guò)程中霉菌、酵母菌、細(xì)菌多個(gè)種屬微生物均能產(chǎn)生酯化酶,催化乙酸與乙醇合成乙酸乙酯[10]。喬曉梅[11]進(jìn)行了酯化酶作用實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在乙酸、乙醇化學(xué)體系中,添加酯化酶可增加總酯含量,推測(cè)乙酸乙酯可由胞外酶催化合成。王旭亮等[12]為了提高清香型白酒品質(zhì),以清香型汾酒發(fā)酵酒醅為篩選對(duì)象,篩選出了優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酯化酶的菌株。研究表明,產(chǎn)酯酵母在合成乙酸乙酯過(guò)程中需要環(huán)境體系存在一定量氧氣,白酒釀造體系為厭氧環(huán)境,釀酒酵母只有在無(wú)氧狀態(tài)下才可發(fā)酵生成乙醇[13-14]。在麩曲白酒釀造大生產(chǎn)過(guò)程中投糧量大、料醅緊實(shí)、間隙溶氧量小,因此,通過(guò)產(chǎn)酯酵母代謝合成乙酸乙酯存在一定局限性。
大曲中微生物菌系豐富,微生物種類繁多,本研究的目標(biāo)是從清香型白酒大曲中分離篩選獲得可分泌酯化酶的微生物菌株[15-16],應(yīng)用于白酒釀造,以期提升白酒中乙酸乙酯含量,改善白酒品質(zhì)及口感。
1.1.1 材料
清香型大曲:北京紅星股份有限公司提供。
1.1.2 試劑及耗材
乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)樣,北京迪科馬科技有限公司;乙酸,北京化工廠;乙醇,北京紅星股份有限公司提供;蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;氯化鈉,北京化工廠;麥芽汁培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司;麩皮、豆粕粉、酒糟、酒尾,北京紅星股份有限公司提供。
1.1.3 培養(yǎng)基
平板篩選培養(yǎng)基[17]:將下述培養(yǎng)基成分1 與成分2按照4∶1(V/V)混合均勻,121 ℃滅菌20 min。
成分1:蛋白胨0.7 %,牛肉膏0.3 %,氯化鈉0.3%,瓊脂粉2%。
成分2:將濃度為3 %的聚乙烯醇溶液與三丁酸甘油酯按照9∶1(V/V)充分混合均勻呈乳化液狀態(tài)。
分離純化及斜面保藏培養(yǎng)基:
細(xì)菌[18]:蛋白胨1%,牛肉膏0.3 %,氯化鈉0.5%,瓊脂粉2%。
霉菌[19]:麥芽汁培養(yǎng)基。
細(xì)菌液體種子培養(yǎng)基[20]:蛋白胨1 %,牛肉膏0.3%,氯化鈉0.5%,121 ℃滅菌20 min。
霉菌種曲培養(yǎng)基[21]:麩皮19 g,豆粕粉1 g,蒸餾水20 mL,混合均勻,121 ℃滅菌40 min。
酯化發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮∶酒糟∶水按1∶1∶10 比例混合煮沸20 min 后過(guò)濾,收集濾液,121 ℃滅菌20 min,接種前加入濾液量10%的酒尾。
麩曲培養(yǎng)基:同霉菌種曲培養(yǎng)基。
1.1.4 儀器設(shè)備
GC-2010Pro 氣相色譜儀,日本島津公司;BX51 顯微鏡,奧林巴斯公司;LA230S 電子天平,賽多利斯公司;CJ-2DFS 凈化工作臺(tái),天津市泰斯特儀器有限公司;LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HY60S生物搖床,武漢匯誠(chéng)生物科技有限公司;JJ6000 型電子天平,常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。
1.2.1 大曲中產(chǎn)酯化酶菌株的分離純化
大曲塊粉碎后,稱取大曲粉1 g,加入到裝有99 mL 生理鹽水和少量玻璃珠的錐形瓶中,充分振蕩混勻,制成菌懸液。按照10 倍稀釋梯度,以無(wú)菌水逐級(jí)稀釋。取10-3、10-4、10-5三個(gè)梯度稀釋液,各吸取0.2 mL涂布篩選平板培養(yǎng)基,每梯度做3個(gè)平行樣[20]。培養(yǎng)皿倒置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2 d,觀察其生長(zhǎng)情況。
將周邊出現(xiàn)透明圈的菌落挑出,并重新劃線接種至分離純化平板培養(yǎng)基上,于35 ℃培養(yǎng)1~2 d,采用以上平板劃線法多次重復(fù)純化,直至分離純化得到不同形態(tài)微生物單純菌落[22],轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基,于4 ℃冰箱保藏。
1.2.2 細(xì)菌種子液培養(yǎng)
將分離純化得到的細(xì)菌菌株接種至液體種子培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)40 h[23]。
1.2.3 霉菌種曲培養(yǎng)將分離純化得到的霉菌菌株接種至種曲培養(yǎng)基中,32 ℃,靜置培養(yǎng)4 d,每日搖瓶2次。
1.2.4 菌株初篩
將培養(yǎng)完成后的細(xì)菌種子液以10 %接種量、霉菌種曲以3 %接種量分別接入酯化發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30 ℃靜置培養(yǎng)3 d,每日搖瓶2 次[24]。培養(yǎng)完成后,取100 mL 發(fā)酵液,加入100 mL 濃度70%vol乙醇,蒸餾提取100 mL 蒸餾液,使用氣相色譜儀測(cè)定蒸餾液中乙酸乙酯含量。
1.2.5 微生物麩曲培養(yǎng)
會(huì)議要求,要進(jìn)一步細(xì)化落實(shí)國(guó)務(wù)院辦公廳關(guān)于做好非洲豬瘟等動(dòng)物疫病防控工作通知的任務(wù)分工,完善聯(lián)防聯(lián)控工作機(jī)制。近期,要組成督查組,赴各地特別是重點(diǎn)省份開(kāi)展非洲豬瘟防控工作督查,聚焦責(zé)任落實(shí)、應(yīng)急處置、生豬調(diào)運(yùn)和餐廚剩余物監(jiān)管等重點(diǎn)工作。要壓實(shí)地方的屬地管理責(zé)任,督促地方各級(jí)人民政府對(duì)本地區(qū)防控工作負(fù)總責(zé),切實(shí)落實(shí)有關(guān)防控措施,統(tǒng)籌做好養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全和肉品供給保障。
將培養(yǎng)完成后的初篩菌株細(xì)菌種子液以10%接種量、霉菌種曲以1 %接種量接入麩曲培養(yǎng)基中,分別于37 ℃、32 ℃靜置培養(yǎng)3~5 d,每日翻拌或搖瓶2次。
1.2.6 麩曲酯化力測(cè)定
稱取5 g 左右麩曲樣品,吸取1 mL 乙酸,加入到100 mL 濃度15 %vol 的酒精中,于30 ℃進(jìn)行酯化反應(yīng)6 d。酯化反應(yīng)液經(jīng)蒸餾提取得到50 mL 蒸餾液,使用氣相色譜儀測(cè)定蒸餾液中乙酸乙酯含量,計(jì)算微生物麩曲酯化力[25]。
色譜條件[26]:DM-WX 毛細(xì)管柱;分流比:10∶1;汽化室溫度230 ℃;程序升溫:初始70 ℃,以10 ℃/min 升溫至230 ℃,保持10 min;檢測(cè)器為FID 檢測(cè)器,檢測(cè)器溫度240 ℃;載氣流速:氮?dú)?5 mL/min,氫氣40 mL/min,空氣400 mL/min。
其中:c——酯化蒸餾液中乙酸乙酯含量,mg/L;
m——細(xì)菌麩曲用量,g。
1.2.7 清香型白酒大曲高通量檢測(cè)及宏基因組測(cè)序
清香型大曲高通量檢測(cè)及宏基因組測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)大曲中微生物組成及功能貢獻(xiàn)進(jìn)行分析[27],為菌株篩選方向提供理論參考依據(jù)。
微生物菌株基因測(cè)序由華大基因科技有限公司完成。采用16S rDNA 測(cè)序方法對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定[28]。
分別對(duì)5 種不同來(lái)源清香型白酒大曲進(jìn)行高通量檢測(cè)。由結(jié)果分析可知,清香型白酒大曲中真菌(如圖1 所示)主要以黃曲霉、酵母菌、復(fù)膜孢酵母菌、念珠菌、伊薩酵母菌等微生物為主;細(xì)菌(如圖2 所示)主要以乳酸菌、糖多孢菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等微生物為主。
圖1 清香型白酒大曲真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖
圖2 清香型白酒大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布圖
應(yīng)用宏基因組測(cè)序?qū)η逑阈桶拙拼笄⑸锱c功能貢獻(xiàn)度進(jìn)行關(guān)聯(lián)預(yù)測(cè)分析,結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 清香型白酒大曲微生物物種與功能貢獻(xiàn)
由圖3 可知,糖多孢菌屬對(duì)組氨酸、絲氨酸等多種氨基酸代謝和長(zhǎng)碳鏈脂肪酸酯代謝存在貢獻(xiàn);芽孢桿菌屬、橫梗霉屬、鏈霉菌屬對(duì)氨基酸代謝影響較為顯著;魏斯氏菌屬有助于長(zhǎng)碳鏈脂肪酸-輔酶A 連接酶、乙酰輔酶轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸合成酶的產(chǎn)生;畢赤酵母屬有助于羧肽酶、谷氨酸合成酶、β-半乳糖苷酶的生成;橫梗霉屬與根霉屬對(duì)羧肽酶、β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。
采用稀釋平板涂布法結(jié)合顯微鏡觀察,最終從大曲粉菌懸液中分離、純化獲得12 株不同種類、形態(tài)菌株,包括細(xì)菌7 株、霉菌5 株,分別編號(hào)為HXX1—HXX7、HXM1—HXM5。
將培養(yǎng)好的菌株接種至酯化發(fā)酵培養(yǎng)基中,以空白培養(yǎng)基為對(duì)照,培養(yǎng)完成后利用氣相色譜法對(duì)酯化發(fā)酵液提取樣品中乙酸乙酯含量進(jìn)行測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及樣品分析色譜圖分別見(jiàn)圖4、圖5。
圖4 乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖
圖5 酯化發(fā)酵液分析色譜圖
由圖5 可以看出,在選定的色譜條件下,乙酸乙酯與其他物質(zhì)分離效果良好,該色譜方法可以對(duì)乙酸乙酯含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。
測(cè)定不同菌株發(fā)酵提取液中乙酸乙酯含量,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 分離菌株酯化發(fā)酵液檢測(cè)結(jié)果
由檢測(cè)結(jié)果可知,細(xì)菌菌株HXX2、HXX3、HXX7,霉菌菌株HXM3 發(fā)酵液中乙酸乙酯含量相對(duì)較高,均超過(guò)100 mg/L,說(shuō)明這些菌株可能具備分泌酯化酶的能力,具有酯化作用。對(duì)細(xì)菌菌株HXX2、HXX3、HXX7,霉菌菌株HXM3、HXM4 進(jìn)一步開(kāi)展篩選實(shí)驗(yàn)。
將初篩所得HXX2、HXX3、HXX7、HXM3、HXM4 菌株分別培養(yǎng)成麩曲。以空白反應(yīng)液為對(duì)照,測(cè)定各菌株麩曲酯化力,結(jié)果見(jiàn)圖6。
圖6 不同麩曲酯化力檢測(cè)結(jié)果
從圖6 可看出,初篩所得的5 株微生物麩曲酯化力差異明顯,表明不同微生物產(chǎn)酯化酶能力不同,其中細(xì)菌HXX7 麩曲酯化力較高,可達(dá)20.6 mg/g,催化合成乙酸乙酯能力較強(qiáng)。
對(duì)篩選所得高產(chǎn)酯化酶微生物菌株HXX7 菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)特征進(jìn)行觀察,HXX7 菌落(如圖7 所示)呈乳白色,圓形,表面光滑,光澤度差,邊緣整齊;通過(guò)顯微鏡觀察該菌微觀形態(tài),菌體細(xì)胞形態(tài)為短桿狀,經(jīng)革蘭氏染色后菌體呈紫色,為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
圖7 菌株HXX7的菌落(a)及細(xì)胞形態(tài)(b)
對(duì)細(xì)菌菌株HXX7 進(jìn)行16S rDNA 序列測(cè)定,將所測(cè)得核酸序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast搜索比對(duì),發(fā)現(xiàn)菌株HXX7 與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilissubsp.inaquosorum strain BGSC 3A28 的16S rDNA 序列相似度為100%,因此確定HXX7 為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
利用MEGA7.0.26 軟件中的NJ 法構(gòu)建菌株HXX7的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖8。
圖8 菌株HXX7的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
本研究從清香型白酒大曲中分離篩選得到1株具有產(chǎn)酯化酶能力的細(xì)菌菌株HXX7,其麩曲酯化力達(dá)20.6 mg/g,可催化乙酸、乙醇合成乙酸乙酯,該菌株應(yīng)用于白酒釀造生產(chǎn)中,在增加清香型白酒乙酸乙酯含量方面具有良好的應(yīng)用前景,對(duì)清香型白酒生產(chǎn)及酒質(zhì)提升具有重要意義。
本研究?jī)H初步篩選出了高酯化力微生物菌株,對(duì)其在白酒釀造過(guò)程中的應(yīng)用情況評(píng)估、確定應(yīng)用條件及方案以及探究乙酸乙酯含量提高對(duì)紅星二鍋頭白酒品質(zhì)改善的促進(jìn)作用還需要進(jìn)一步進(jìn)行深入研究,最終為生產(chǎn)提供理論依據(jù)。