清香型白酒大曲中產(chǎn)酯化酶微生物分離篩選及鑒定

劉小改，馬美榮，李洪媛，馬東碩，王小偉，張 坤

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

中國(guó)白酒大曲制曲歷史悠久，自古就有“曲乃酒之骨”之說(shuō)?！稌?shū)經(jīng)·說(shuō)命篇》記載：“若作酒醴，爾惟曲蘗”，曲蘗就是酒曲的起源。大曲綜合物系、酶系、菌系于一體，是重要的微生物群落載體[1-2]。清香型大曲包含霉菌、酵母菌、細(xì)菌等各類微生物，在白酒釀造過(guò)程中起糖化、發(fā)酵、生香作用[3]。

乙酸乙酯是清香型白酒中主要呈味物質(zhì)，對(duì)改變酒體的風(fēng)味組成、賦予酒體濃郁香氣及促進(jìn)酒體豐滿協(xié)調(diào)具有重要作用，其含量高低決定著清香型白酒的風(fēng)格質(zhì)量[4-5]。研究資料表明，清香型酒中乙酸乙酯合成主要通過(guò)3 種途徑：乙醇與乙酸通過(guò)化學(xué)反應(yīng)合成；乙醇與乙酸在胞外酯化酶催化作用下合成；在酵母細(xì)胞中，乙醇與乙酰輔酶A 在醇?；D(zhuǎn)移酶（AATase）催化作用下合成。其中后兩者為生物學(xué)反應(yīng)[6-7]。

酯化酶在酶學(xué)分類上屬于酯酶（Esterase E.C.3.1.1.2）范疇，是由具有酸、醇酯化功能的特定種類微生物發(fā)酵產(chǎn)生[8]。研究表明[9]，酯酶大量存在于霉菌、酵母菌、細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，既可以水解酯類，也可以催化合成低級(jí)脂肪酸酯。

白酒釀造過(guò)程中霉菌、酵母菌、細(xì)菌多個(gè)種屬微生物均能產(chǎn)生酯化酶，催化乙酸與乙醇合成乙酸乙酯[10]。喬曉梅[11]進(jìn)行了酯化酶作用實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在乙酸、乙醇化學(xué)體系中，添加酯化酶可增加總酯含量，推測(cè)乙酸乙酯可由胞外酶催化合成。王旭亮等[12]為了提高清香型白酒品質(zhì)，以清香型汾酒發(fā)酵酒醅為篩選對(duì)象，篩選出了優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酯化酶的菌株。研究表明，產(chǎn)酯酵母在合成乙酸乙酯過(guò)程中需要環(huán)境體系存在一定量氧氣，白酒釀造體系為厭氧環(huán)境，釀酒酵母只有在無(wú)氧狀態(tài)下才可發(fā)酵生成乙醇[13-14]。在麩曲白酒釀造大生產(chǎn)過(guò)程中投糧量大、料醅緊實(shí)、間隙溶氧量小，因此，通過(guò)產(chǎn)酯酵母代謝合成乙酸乙酯存在一定局限性。

大曲中微生物菌系豐富，微生物種類繁多，本研究的目標(biāo)是從清香型白酒大曲中分離篩選獲得可分泌酯化酶的微生物菌株[15-16]，應(yīng)用于白酒釀造，以期提升白酒中乙酸乙酯含量，改善白酒品質(zhì)及口感。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

清香型大曲：北京紅星股份有限公司提供。

1.1.2 試劑及耗材

乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)樣，北京迪科馬科技有限公司；乙酸，北京化工廠；乙醇，北京紅星股份有限公司提供；蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉，北京化工廠；麥芽汁培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；麩皮、豆粕粉、酒糟、酒尾，北京紅星股份有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

平板篩選培養(yǎng)基[17]：將下述培養(yǎng)基成分1 與成分2按照4∶1（V/V）混合均勻，121 ℃滅菌20 min。

成分1：蛋白胨0.7 %，牛肉膏0.3 %，氯化鈉0.3%，瓊脂粉2%。

成分2：將濃度為3 %的聚乙烯醇溶液與三丁酸甘油酯按照9∶1（V/V）充分混合均勻呈乳化液狀態(tài)。

分離純化及斜面保藏培養(yǎng)基：

細(xì)菌[18]：蛋白胨1%，牛肉膏0.3 %，氯化鈉0.5%，瓊脂粉2%。

霉菌[19]：麥芽汁培養(yǎng)基。

細(xì)菌液體種子培養(yǎng)基[20]：蛋白胨1 %，牛肉膏0.3%，氯化鈉0.5%，121 ℃滅菌20 min。

霉菌種曲培養(yǎng)基[21]：麩皮19 g，豆粕粉1 g，蒸餾水20 mL，混合均勻，121 ℃滅菌40 min。

酯化發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮∶酒糟∶水按1∶1∶10 比例混合煮沸20 min 后過(guò)濾，收集濾液，121 ℃滅菌20 min，接種前加入濾液量10%的酒尾。

麩曲培養(yǎng)基：同霉菌種曲培養(yǎng)基。

1.1.4 儀器設(shè)備

GC-2010Pro 氣相色譜儀，日本島津公司；BX51 顯微鏡，奧林巴斯公司；LA230S 電子天平，賽多利斯公司；CJ-2DFS 凈化工作臺(tái)，天津市泰斯特儀器有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HY60S生物搖床，武漢匯誠(chéng)生物科技有限公司；JJ6000 型電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大曲中產(chǎn)酯化酶菌株的分離純化

大曲塊粉碎后，稱取大曲粉1 g，加入到裝有99 mL 生理鹽水和少量玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩混勻，制成菌懸液。按照10 倍稀釋梯度，以無(wú)菌水逐級(jí)稀釋。取10-3、10-4、10-5三個(gè)梯度稀釋液，各吸取0.2 mL涂布篩選平板培養(yǎng)基，每梯度做3個(gè)平行樣[20]。培養(yǎng)皿倒置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，觀察其生長(zhǎng)情況。

將周邊出現(xiàn)透明圈的菌落挑出，并重新劃線接種至分離純化平板培養(yǎng)基上，于35 ℃培養(yǎng)1～2 d，采用以上平板劃線法多次重復(fù)純化，直至分離純化得到不同形態(tài)微生物單純菌落[22]，轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，于4 ℃冰箱保藏。

1.2.2 細(xì)菌種子液培養(yǎng)

將分離純化得到的細(xì)菌菌株接種至液體種子培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)40 h[23]。

1.2.3 霉菌種曲培養(yǎng)將分離純化得到的霉菌菌株接種至種曲培養(yǎng)基中，32 ℃，靜置培養(yǎng)4 d，每日搖瓶2次。

1.2.4 菌株初篩

將培養(yǎng)完成后的細(xì)菌種子液以10 %接種量、霉菌種曲以3 %接種量分別接入酯化發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃靜置培養(yǎng)3 d，每日搖瓶2 次[24]。培養(yǎng)完成后，取100 mL 發(fā)酵液，加入100 mL 濃度70%vol乙醇，蒸餾提取100 mL 蒸餾液，使用氣相色譜儀測(cè)定蒸餾液中乙酸乙酯含量。

1.2.5 微生物麩曲培養(yǎng)

會(huì)議要求，要進(jìn)一步細(xì)化落實(shí)國(guó)務(wù)院辦公廳關(guān)于做好非洲豬瘟等動(dòng)物疫病防控工作通知的任務(wù)分工，完善聯(lián)防聯(lián)控工作機(jī)制。近期，要組成督查組，赴各地特別是重點(diǎn)省份開(kāi)展非洲豬瘟防控工作督查，聚焦責(zé)任落實(shí)、應(yīng)急處置、生豬調(diào)運(yùn)和餐廚剩余物監(jiān)管等重點(diǎn)工作。要壓實(shí)地方的屬地管理責(zé)任，督促地方各級(jí)人民政府對(duì)本地區(qū)防控工作負(fù)總責(zé)，切實(shí)落實(shí)有關(guān)防控措施，統(tǒng)籌做好養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全和肉品供給保障。

將培養(yǎng)完成后的初篩菌株細(xì)菌種子液以10%接種量、霉菌種曲以1 %接種量接入麩曲培養(yǎng)基中，分別于37 ℃、32 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，每日翻拌或搖瓶2次。

1.2.6 麩曲酯化力測(cè)定

稱取5 g 左右麩曲樣品，吸取1 mL 乙酸，加入到100 mL 濃度15 %vol 的酒精中，于30 ℃進(jìn)行酯化反應(yīng)6 d。酯化反應(yīng)液經(jīng)蒸餾提取得到50 mL 蒸餾液，使用氣相色譜儀測(cè)定蒸餾液中乙酸乙酯含量，計(jì)算微生物麩曲酯化力[25]。

色譜條件[26]：DM-WX 毛細(xì)管柱；分流比：10∶1；汽化室溫度230 ℃；程序升溫：初始70 ℃，以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保持10 min；檢測(cè)器為FID 檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度240 ℃；載氣流速：氮?dú)?5 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min。

其中：c——酯化蒸餾液中乙酸乙酯含量，mg/L；

m——細(xì)菌麩曲用量，g。

1.2.7 清香型白酒大曲高通量檢測(cè)及宏基因組測(cè)序

清香型大曲高通量檢測(cè)及宏基因組測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)大曲中微生物組成及功能貢獻(xiàn)進(jìn)行分析[27]，為菌株篩選方向提供理論參考依據(jù)。

微生物菌株基因測(cè)序由華大基因科技有限公司完成。采用16S rDNA 測(cè)序方法對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 清香型白酒大曲高通量及宏基因組檢測(cè)分析

分別對(duì)5 種不同來(lái)源清香型白酒大曲進(jìn)行高通量檢測(cè)。由結(jié)果分析可知，清香型白酒大曲中真菌（如圖1 所示）主要以黃曲霉、酵母菌、復(fù)膜孢酵母菌、念珠菌、伊薩酵母菌等微生物為主；細(xì)菌（如圖2 所示）主要以乳酸菌、糖多孢菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等微生物為主。

圖1 清香型白酒大曲真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖

圖2 清香型白酒大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布圖

應(yīng)用宏基因組測(cè)序?qū)η逑阈桶拙拼笄⑸锱c功能貢獻(xiàn)度進(jìn)行關(guān)聯(lián)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 清香型白酒大曲微生物物種與功能貢獻(xiàn)

由圖3 可知，糖多孢菌屬對(duì)組氨酸、絲氨酸等多種氨基酸代謝和長(zhǎng)碳鏈脂肪酸酯代謝存在貢獻(xiàn)；芽孢桿菌屬、橫梗霉屬、鏈霉菌屬對(duì)氨基酸代謝影響較為顯著；魏斯氏菌屬有助于長(zhǎng)碳鏈脂肪酸-輔酶A 連接酶、乙酰輔酶轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸合成酶的產(chǎn)生；畢赤酵母屬有助于羧肽酶、谷氨酸合成酶、β-半乳糖苷酶的生成；橫梗霉屬與根霉屬對(duì)羧肽酶、β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。

2.2 清香型白酒大曲產(chǎn)酯化酶微生物初步篩選

采用稀釋平板涂布法結(jié)合顯微鏡觀察，最終從大曲粉菌懸液中分離、純化獲得12 株不同種類、形態(tài)菌株，包括細(xì)菌7 株、霉菌5 株，分別編號(hào)為HXX1—HXX7、HXM1—HXM5。

將培養(yǎng)好的菌株接種至酯化發(fā)酵培養(yǎng)基中，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)完成后利用氣相色譜法對(duì)酯化發(fā)酵液提取樣品中乙酸乙酯含量進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及樣品分析色譜圖分別見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖5 酯化發(fā)酵液分析色譜圖

由圖5 可以看出，在選定的色譜條件下，乙酸乙酯與其他物質(zhì)分離效果良好，該色譜方法可以對(duì)乙酸乙酯含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

測(cè)定不同菌株發(fā)酵提取液中乙酸乙酯含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 分離菌株酯化發(fā)酵液檢測(cè)結(jié)果

由檢測(cè)結(jié)果可知，細(xì)菌菌株HXX2、HXX3、HXX7，霉菌菌株HXM3 發(fā)酵液中乙酸乙酯含量相對(duì)較高，均超過(guò)100 mg/L，說(shuō)明這些菌株可能具備分泌酯化酶的能力，具有酯化作用。對(duì)細(xì)菌菌株HXX2、HXX3、HXX7，霉菌菌株HXM3、HXM4 進(jìn)一步開(kāi)展篩選實(shí)驗(yàn)。

2.3 清香型白酒大曲產(chǎn)酯化酶微生物復(fù)篩結(jié)果

將初篩所得HXX2、HXX3、HXX7、HXM3、HXM4 菌株分別培養(yǎng)成麩曲。以空白反應(yīng)液為對(duì)照，測(cè)定各菌株麩曲酯化力，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同麩曲酯化力檢測(cè)結(jié)果

從圖6 可看出，初篩所得的5 株微生物麩曲酯化力差異明顯，表明不同微生物產(chǎn)酯化酶能力不同，其中細(xì)菌HXX7 麩曲酯化力較高，可達(dá)20.6 mg/g，催化合成乙酸乙酯能力較強(qiáng)。

2.4 高產(chǎn)酯化酶細(xì)菌菌株形態(tài)觀察

對(duì)篩選所得高產(chǎn)酯化酶微生物菌株HXX7 菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)特征進(jìn)行觀察，HXX7 菌落（如圖7 所示）呈乳白色，圓形，表面光滑，光澤度差，邊緣整齊；通過(guò)顯微鏡觀察該菌微觀形態(tài)，菌體細(xì)胞形態(tài)為短桿狀，經(jīng)革蘭氏染色后菌體呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。

圖7 菌株HXX7的菌落（a）及細(xì)胞形態(tài)（b）

2.5 高產(chǎn)酯化酶細(xì)菌菌株分子生物學(xué)鑒定

對(duì)細(xì)菌菌株HXX7 進(jìn)行16S rDNA 序列測(cè)定，將所測(cè)得核酸序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株HXX7 與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilissubsp.inaquosorum strain BGSC 3A28 的16S rDNA 序列相似度為100%，因此確定HXX7 為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

利用MEGA7.0.26 軟件中的NJ 法構(gòu)建菌株HXX7的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 菌株HXX7的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論

本研究從清香型白酒大曲中分離篩選得到1株具有產(chǎn)酯化酶能力的細(xì)菌菌株HXX7，其麩曲酯化力達(dá)20.6 mg/g，可催化乙酸、乙醇合成乙酸乙酯，該菌株應(yīng)用于白酒釀造生產(chǎn)中，在增加清香型白酒乙酸乙酯含量方面具有良好的應(yīng)用前景，對(duì)清香型白酒生產(chǎn)及酒質(zhì)提升具有重要意義。

本研究?jī)H初步篩選出了高酯化力微生物菌株，對(duì)其在白酒釀造過(guò)程中的應(yīng)用情況評(píng)估、確定應(yīng)用條件及方案以及探究乙酸乙酯含量提高對(duì)紅星二鍋頭白酒品質(zhì)改善的促進(jìn)作用還需要進(jìn)一步進(jìn)行深入研究，最終為生產(chǎn)提供理論依據(jù)。