基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)探討芍藥甘草湯合桃紅四物湯治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機(jī)制

劉瑩，林旋，2，張玨，姚南珍，趙一涵

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第八臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 佛山 528000

2. 佛山市第一人民醫(yī)院，廣東 佛山 528000

3. 佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000

糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，早期可見(jiàn)四肢麻木、感覺(jué)異常、疼痛，晚期以感覺(jué)喪失為特征，若病情進(jìn)一步發(fā)展，可導(dǎo)致足部潰瘍、壞死，甚至需要截肢、危及生命，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量并帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)DPN 以對(duì)因?qū)ΠY治療為主，包括調(diào)控血糖、改善循環(huán)、抗氧化應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、止痛等[1]，這些針對(duì)DPN 單一發(fā)病機(jī)制采取的治療措施并不能達(dá)到令人滿意的臨床療效，治療存在一定局限性。中醫(yī)認(rèn)識(shí)及治療疾病強(qiáng)調(diào)從整體出發(fā)，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下形成的中藥復(fù)方對(duì)DPN 的防治具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的綜合優(yōu)勢(shì)，可標(biāo)本兼治，有效改善臨床癥狀[2]。臨床研究表明，芍藥甘草湯合桃紅四物湯治療DPN 有確切療效[3-4]，但作用機(jī)制的分析探討尚未見(jiàn)報(bào)道。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)可通過(guò)構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)基因-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)、整體地分析中藥復(fù)方中多成分對(duì)疾病的作用機(jī)制，其特點(diǎn)與中醫(yī)整體觀、辨證施治原則相吻合[5]。本研究通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對(duì)接技術(shù)，分析芍藥甘草湯合桃紅四物湯治療DPN 的作用機(jī)制，以期能為芍藥甘草湯合桃紅四物湯的臨床應(yīng)用及后期的深入研究提供依據(jù)與方向。

1 研究方法

1.1 芍藥甘草湯合桃紅四物湯化學(xué)成分信息及靶點(diǎn)基因獲取 以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，從中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索白芍、甘草、桃仁、紅花、川芎、熟地黃與當(dāng)歸，篩選出各藥物的活性成分并下載對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）將上述中藥活性成分的靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因。

1.2 DPN 靶點(diǎn)基因獲取 以“diabetic peripheral neuropathy” 為關(guān)鍵詞， 分別從DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.drugbank.ca/）、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.pharmgkb.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//db.idrblab.net/ttd/）檢索靶點(diǎn)基因，并對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、去重，獲得DPN 相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

1.3 芍藥甘草湯合桃紅四物湯活性成分-DPN 共同靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 運(yùn)用韋恩圖（Venn diagram）得到芍藥甘草湯合桃紅四物湯活性成分與DPN 的共同靶點(diǎn)基因，即潛在治療靶點(diǎn)基因。運(yùn)用Cytoscape 3.9.1 軟件對(duì)藥物活性成分與潛在治療靶點(diǎn)基因之間的關(guān)系進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖像可視化處理?；钚猿煞峙c靶點(diǎn)基因以節(jié)點(diǎn)呈現(xiàn)，節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系以邊表示。以“Degree”為標(biāo)準(zhǔn)將藥物活性成分進(jìn)行排序，篩選出芍藥甘草湯合桃紅四物湯治療DPN 的核心活性成分。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（https：//string-db.org），將置信度調(diào)整為≥0.900，生物種類限制為“Homo sapiens”，獲取芍藥甘草湯合桃紅四物湯活性成分與DPN 共同靶點(diǎn)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。下載PPI 關(guān)系參數(shù)，將之導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，應(yīng)用“CytoNCA”插件篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，根據(jù)介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）、接近中心性（Closeness Centrality）、度中心性（Degree Centrality）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality）、局部平均連通性（Local Average Centrality）篩選出核心靶點(diǎn)基因。

1.5 基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 運(yùn)用R 語(yǔ)言軟件對(duì)芍藥甘草湯合桃紅四物湯活性成分與DPN 的共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析。設(shè)置P＜0.05 為條件，篩選并輸出富集分析結(jié)果排名靠前的10條GO生物功能和30條KEGG信號(hào)通路，并根據(jù)結(jié)果繪制柱狀圖、氣泡圖。

1.6 核心活性成分與核心靶點(diǎn)基因分子對(duì)接 以1.3 項(xiàng)及1.4項(xiàng)中篩選得到的核心活性成分與核心靶點(diǎn)基因分別作為配體、受體進(jìn)行分子對(duì)接。首先通過(guò)Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取核心活性成分的小分子配體2D結(jié)構(gòu)，再利用Chem3D 軟件將之轉(zhuǎn)換為3D 結(jié)構(gòu)。在布魯克海文蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB）獲取核心靶點(diǎn)基因蛋白受體的三維結(jié)構(gòu)，并借助Pymol 軟件進(jìn)行去水分子及原配體操作。再通過(guò)AutoDockTools 軟件將配體和受體轉(zhuǎn)換為PDBQT 格式及確定活性口袋。最后通過(guò)AutoDock Vina 軟件將小分子配體和蛋白受體進(jìn)行分子對(duì)接，并將對(duì)接結(jié)果可視化。

2 研究結(jié)果

2.1 芍藥甘草湯合桃紅四物湯活性成分及靶點(diǎn)基因 從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到芍藥甘草湯合桃紅四物湯共有161 個(gè)活性成分，其中白芍13 個(gè)，甘草92個(gè)，熟地黃2個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，川芎7個(gè)，桃仁23個(gè)，紅花22 個(gè)。將上述活性成分的靶點(diǎn)蛋白經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換為靶點(diǎn)基因，共241個(gè)。

2.2 DPN 靶點(diǎn)獲取 通過(guò)DrugBank、PharmGKB、GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得與DPN相關(guān)的靶點(diǎn)基因共5 596 個(gè)（DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)116 個(gè)、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(kù)225個(gè)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)5 118個(gè)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)135 個(gè)、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)2 個(gè)），綜合各數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果，去重后獲得DPN 靶點(diǎn)基因共5 303 個(gè)，見(jiàn)圖1。將DPN 的5 303 個(gè)靶點(diǎn)基因與芍藥甘草湯合桃紅四物湯的241 個(gè)靶點(diǎn)基因取交集，最終獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)基因184個(gè)，見(jiàn)圖2。

圖1 各數(shù)據(jù)庫(kù)中DPN相關(guān)靶點(diǎn)基因的分布

圖2 芍藥甘草湯合桃紅四物湯與DPN的共同靶點(diǎn)基因

2.3 芍藥甘草湯合桃紅四物湯活性成分-DPN 共同靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)芍藥甘草湯合桃紅四物湯活性成分與DPN 的共同靶點(diǎn)基因，反向篩選得到作用于DPN 的相關(guān)活性成分125 個(gè)。通過(guò)Cytoscape 3.9.1 軟件將芍藥甘草湯合桃紅四物湯活性成分-DPN 共同靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)可視化處理，見(jiàn)圖3。活性成分-DPN 共同靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖中共有309個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中活性成分125 個(gè)，靶點(diǎn)基因184 個(gè)。圖中央呈矩陣排列的圓圈代表DPN 潛在的治療靶點(diǎn)基因，四周圓形排列的圓圈代表芍藥甘草湯合桃紅四物湯活性成分，不同顏色代表不同藥物的活性成分，連線代表活性成分與靶點(diǎn)基因間的相互作用。以“Degree”為標(biāo)準(zhǔn)，將活性成分進(jìn)行排序，排名前5 的核心活性成分為MOL000098（槲皮素）、MOL000006（木犀草素）、MOL000422（山奈酚）、MOL004328（柚皮素）、MOL003896（7-甲氧基-2-甲基異黃酮），作用靶點(diǎn)基因分別為111、45、42、29、27個(gè)，可推測(cè)這些活性成分可能是芍藥甘草湯合桃紅四物湯治療DPN 的核心活性成分。

圖3 芍藥甘草湯合桃紅四物湯活性成分-DPN共同靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將184 個(gè)共同靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并通過(guò)Cytoscape 3.9.1 軟件將PPI 數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，見(jiàn)圖4。圖中靶點(diǎn)基因以節(jié)點(diǎn)呈現(xiàn)，節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系以邊表示。共有160 個(gè)節(jié)點(diǎn)和739 條邊，Degree 值的大小與節(jié)點(diǎn)的大小、顏色深淺呈正相關(guān)。調(diào)整相關(guān)參數(shù)（Betweenness Centrality≥65.871 454 98；Closeness Centrality≥0.092 928 239 5；Degree Centrality≥7；Eigenvector Centrality≥0.040 539 527 5；Local Average Centrality≥2.291 666 666 5）保留大于中位值的靶點(diǎn)基因，對(duì)靶點(diǎn)基因進(jìn)行篩選，得到48 個(gè)靶點(diǎn)基因。對(duì)這48 個(gè)靶點(diǎn)基因再次進(jìn)行篩選，條件為：Betweenness Centrality≥18.852 097 12；Closeness Centrality≥0.546 511 628； Degree Centrality≥11； Eigenvector Centrality≥0.106 636 494 5；Local Average Centrality≥5.25，最終得到19 個(gè)靶點(diǎn)基因，分別是：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A（CDKN1A）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、白細(xì)胞介素-6（IL6）、原癌基因（FOS）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、熱休克蛋白90α 家族A 類成員1（HSP90AA1）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、雌激素受體1（ESR1）、核內(nèi)癌基因（MYC）、缺氧誘導(dǎo)因子1 亞基α（HIF1A）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）、腫瘤蛋白p53（TP53）、連環(huán)蛋白β1（CTNNB1）、V-rel網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞病毒癌基因同源物A（RELA）。以“Degree”為標(biāo)準(zhǔn)，將以上19 個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行排序，排名前5 的核心靶點(diǎn)基因?yàn)镾TAT3、 MAPK3、 HSP90AA1、MAPK1、RELA，篩選圖見(jiàn)圖5。

圖4 芍藥甘草湯合桃紅四物湯與DPN共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 芍藥甘草湯合桃紅四物湯治療DPN靶點(diǎn)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析及篩選圖

2.5 GO 功能富集分析結(jié)果 利用R 語(yǔ)言軟件對(duì)184個(gè)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 功能富集分析，富集結(jié)果包括生物進(jìn)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF），分別為2 595、127、218 個(gè)GO 條目，共2 940 個(gè)。BP主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)活性氧的反應(yīng)，對(duì)肽、脂多糖（LPS）的反應(yīng)，對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)等；CC主要涉及膜筏、囊泡腔、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、神經(jīng)元細(xì)胞體；MF 主要涉及核受體活性、核類固醇受體活性、G 蛋白耦聯(lián)受體（GPCRs）活性、轉(zhuǎn)錄輔激活因子結(jié)合等。取各組排名前10的GO條目繪制柱狀圖，見(jiàn)圖6。

圖6 GO功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG 通路富集分析結(jié)果 利用R 語(yǔ)言軟件對(duì)184 個(gè)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共得到信號(hào)通路182條。包括脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路等。富集分析結(jié)果提示上述信號(hào)通路可能為芍藥甘草湯合桃紅四物湯治療DPN的關(guān)鍵通路。根據(jù)P值大小進(jìn)行排序，取排在前30 條的KEGG信號(hào)通路繪制氣泡圖，見(jiàn)圖7。

圖7 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 核心活性成分與核心靶點(diǎn)基因分子對(duì)接 選取核心靶點(diǎn)基因 STAT3、 MAPK3、 HSP90AA1、MAPK1、RELA 的蛋白受體與核心活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮的小分子配體進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)合能數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。對(duì)接結(jié)果顯示，此5 種核心活性成分小分子配體與核心靶點(diǎn)基因蛋白受體的最低結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，表明芍藥甘草湯合桃紅四物湯的核心活性成分與核心靶點(diǎn)基因有較好對(duì)接活性，結(jié)合能力較強(qiáng)。其中木犀草素與HSP90AA1 對(duì)接結(jié)合能最低，為-10.3 kcal/mol，提示結(jié)合活性最好。5 個(gè)核心活性成分與靶點(diǎn)基因HSP90AA1對(duì)接的結(jié)合情況見(jiàn)圖8。

表1 核心活性成分與核心靶點(diǎn)基因的對(duì)接結(jié)合能 kcal/mol

圖8 5種核心活性成分與靶點(diǎn)基因HSP90AA1對(duì)接示意圖

3 討論

3.1 芍藥甘草湯合桃紅四物湯與DPN DPN 可歸屬于中醫(yī)學(xué)消渴痹證、消渴痿證等疾病范疇，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。普遍認(rèn)為DPN 的發(fā)病機(jī)制多因消渴日久，燥熱傷陰耗氣，致氣陰兩虛，氣虛則無(wú)以推動(dòng)血行，陰虛則生內(nèi)熱，虛火久蒸，損耗陰液，干血內(nèi)結(jié)，導(dǎo)致血運(yùn)遲緩，氣血運(yùn)行不暢，四肢筋脈失于氣血溫潤(rùn)濡養(yǎng)，不榮則痛；久病入絡(luò)，脈絡(luò)痹阻，不通則痛，出現(xiàn)肢體麻木、疼痛、感覺(jué)異常等癥狀[6]。陰虛燥熱是發(fā)生DPN 的關(guān)鍵，瘀血是造成此病的重要原因，故應(yīng)治以滋陰活血、柔筋緩急。

桃紅四物湯出自《醫(yī)宗金鑒》，由桃仁、紅花、川芎、熟地黃、白芍、當(dāng)歸6味藥組成，具有養(yǎng)血活血之功效。現(xiàn)代藥理研究結(jié)果證實(shí)，桃紅四物湯有降血脂、擴(kuò)血管、抗疲勞、耐缺氧、補(bǔ)充微量元素、抗氧化損傷、抗炎、提高免疫力、神經(jīng)保護(hù)等作用[7]。芍藥甘草湯則出自《傷寒論》，由白芍、炙甘草2味藥組成，具有滋陰養(yǎng)血、緩急止痛之功效?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，白芍的有效成分芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、白芍總苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、降糖降脂、抗抑郁、保肝、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[8]；炙甘草中黃酮類成分含量較高，具有抗炎、抗氧化、抗心律失常、調(diào)節(jié)免疫和抗菌等藥理作用[9]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，芍藥甘草湯可用于治療痙攣性、疼痛性疾病，對(duì)緩解四肢平滑肌的攣急效果顯著[10-11]。兩方合用，奏滋陰活血、柔筋緩急之效，標(biāo)本兼治。

3.2 芍藥甘草湯合桃紅四物湯治療DPN 的核心活性成分及靶點(diǎn)基因 本研究結(jié)果提示，芍藥甘草湯合桃紅四物湯的125 個(gè)活性成分中，Degree 值排名前5 的是槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮。上述5 種核心活性成分皆為黃酮類化合物，由此可見(jiàn)，黃酮類化合物在DPN 的治療中可能發(fā)揮著重要的作用。槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、心血管保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、血糖調(diào)節(jié)等藥理作用[12]；有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)傳導(dǎo)，從而改善糖尿病大鼠的神經(jīng)病理性疼痛，且在體內(nèi)外可通過(guò)減輕線粒體損傷，對(duì)高血糖誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變有神經(jīng)保護(hù)作用[13-14]。木犀草素具有抗氧化、抗炎、改善胰島素抵抗、保護(hù)神經(jīng)的作用，能防止人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP-1）巨噬細(xì)胞焦亡，減輕線粒體損傷，抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，減少神經(jīng)元凋亡，可抑制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。山奈酚具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡的作用，可通過(guò)減少晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）形成，增加β 細(xì)胞中胰島素的產(chǎn)生和分泌，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，促進(jìn)骨骼肌葡萄糖代謝和抑制肝糖異生而降低血糖[17-18]。柚皮素具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、降血脂等廣泛的生物活性[19]。有研究發(fā)現(xiàn)柚皮素可提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，緩解DPN，其作用機(jī)制可能是抑制核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，緩解高糖損傷雪旺細(xì)胞過(guò)程中的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]。因此，芍藥甘草湯合桃紅四物湯的活性成分可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗炎、調(diào)節(jié)血糖以及保護(hù)神經(jīng)等作用，延緩DPN 病程進(jìn)展，達(dá)到治療的目的。

本研究所獲得的核心程度最高的5個(gè)核心靶點(diǎn)基因?yàn)镾TAT3、MAPK3、HSP90AA1、MAPK1、RELA。作為STATs家族的一員，STAT3是連接癌癥、免疫及炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)分子，能夠激活JAK 激酶/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（JAK/STAT）信號(hào)通路，與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[21-22]。MAPK1、MAPK3同屬于MAPK家族，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及炎癥反應(yīng)等多種生理病理活動(dòng)，與葡萄糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元再生受損及神經(jīng)病變密切相關(guān)[23]。HSP90AA1 是熱休克家族的重要成員，可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)鍵因子[24]，是DPN形成的重要分子之一。RELA 基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子p65 是NF-κB家族中的一個(gè)重要成員，可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞在免疫炎癥反應(yīng)中相關(guān)基因的表達(dá)水平，參與DPN 的發(fā)生、發(fā)展[25]。由此可見(jiàn)，上述核心靶點(diǎn)基因與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞代謝、神經(jīng)元功能的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，而這些因素均可影響DNP 的發(fā)生、發(fā)展，故可為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供方向及參考。

3.3 芍藥甘草湯合桃紅四物湯治療DPN 可能的作用機(jī)制 本研究的GO 功能富集分析結(jié)果提示，芍藥甘草湯合桃紅四物湯治療DPN 可能通過(guò)膜筏、囊泡腔、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、神經(jīng)元細(xì)胞體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)核受體活性、核類固醇受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、GPCRs 活性、DNA 與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能，影響氧化應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)活性氧族的反應(yīng)、對(duì)肽與LPS的反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)等生物進(jìn)程。其中，高血糖引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可激活多元醇通路、己糖胺途徑、AGEs 形成，引發(fā)和放大神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致線粒體功能障礙，神經(jīng)元及周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷、凋亡[26]。此外，氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的過(guò)量活性氧在神經(jīng)毒性方面亦起著重要作用[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，維生素和抗氧化補(bǔ)充劑可顯著提高DPN 患者腓腸神經(jīng)、正中神經(jīng)的神經(jīng)傳導(dǎo)速度，改善臨床癥狀，延緩DPN 的進(jìn)展[28]。LPS來(lái)自革蘭氏陰性腸道菌群，可合成和釋放多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，高脂肪飲食喂養(yǎng)的小鼠，其血漿LPS 的循環(huán)濃度增加、體質(zhì)量增加、空腹血糖升高，發(fā)生炎癥，誘導(dǎo)了代謝性疾病的發(fā)生，這與在正常飲食喂養(yǎng)的小鼠中注射LPS引起的代謝反應(yīng)在一定程度上相似，其機(jī)制可能是LPS/CD14系統(tǒng)設(shè)置了高脂肪飲食誘導(dǎo)代謝性疾病發(fā)生的閾值[29]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持的水平與DPN 的發(fā)病關(guān)聯(lián)密切，神經(jīng)功能障礙和神經(jīng)血液灌注減少，可導(dǎo)致神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良，最終導(dǎo)致神經(jīng)損傷[30]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等，可減輕神經(jīng)元損傷程度，促進(jìn)神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)和周圍神經(jīng)的恢復(fù)，在周圍神經(jīng)中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用[31]。GPCRs 可通過(guò)與糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等配體結(jié)合并發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路[32-33]，是治療糖尿病及其并發(fā)癥的新型藥物靶點(diǎn)之一。細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激、細(xì)胞外刺激的反應(yīng)，可激活絲裂原活化蛋白激酶和多種磷脂酶，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)應(yīng)激原的抵抗力，拮抗細(xì)胞凋亡及激活炎癥細(xì)胞[34]。

本研究的KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，芍藥甘草湯合桃紅四物湯干預(yù)DPN 的信號(hào)通路主要涉及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt 信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等。PI3K-Akt 通路能夠通過(guò)調(diào)節(jié)雪旺細(xì)胞促進(jìn)髓鞘形成、修復(fù)神經(jīng)纖維，改善高糖環(huán)境下的細(xì)胞氧化應(yīng)激水平[35]，對(duì)DPN 的治療有重要意義。長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致AGEs 在周圍神經(jīng)組織蓄積過(guò)多，與AGEs 受體（RAGE）結(jié)合后激活A(yù)GE-RAGE 信號(hào)通路，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子釋放增加、激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成神經(jīng)損傷[36-37]，加速DPN 的發(fā)生、發(fā)展。IL-17 是重要的促炎癥細(xì)胞，參與炎癥和自身免疫性疾病的調(diào)控[38]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17 信號(hào)通路可通過(guò)影響棕色和米色脂肪組織的產(chǎn)熱作用促進(jìn)產(chǎn)熱和能量消耗，抑制肥胖和胰島素抵抗的發(fā)展[39]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是TNF 信號(hào)通路中具有代表性的炎癥因子，不僅對(duì)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有毒性作用，還會(huì)加重血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[40]。有研究發(fā)現(xiàn)，DPN 患者的TNF-α 水平升高，與正中神經(jīng)、腓神經(jīng)的神經(jīng)傳導(dǎo)速度呈負(fù)相關(guān)，提示TNF-α 可能是DPN 患者神經(jīng)傳導(dǎo)異常的影響因素[41]。HIF-1α 是HIF-1 的亞單位，是應(yīng)答缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[42]。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 可通過(guò)促進(jìn)新血管生成、擴(kuò)張血管，進(jìn)而改善糖尿病周圍神經(jīng)組織缺血缺氧，起到保護(hù)神經(jīng)的作用[43]。筆者認(rèn)為，芍藥甘草湯合桃紅四物湯可能通過(guò)調(diào)控上述信號(hào)通路來(lái)改善胰島素抵抗、抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，達(dá)到治療DPN的目的。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，芍藥甘草湯合桃紅四物湯的5 個(gè)核心藥物活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮與核心靶點(diǎn)基 因 STAT3、 MAPK3、 HSP90AA1、 MAPK1、RELA 均有較好對(duì)接活性，結(jié)合能力較強(qiáng)，其中木犀草素與HSP90AA1 結(jié)合作用最好，驗(yàn)證了芍藥甘草湯合桃紅四物湯的核心活性成分與DPN 核心靶點(diǎn)基因有較好的親和力。在今后的基礎(chǔ)試驗(yàn)中可探究這些活性成分對(duì)DPN 的作用機(jī)制，為臨床治療提供思路。

綜上所述，通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對(duì)接技術(shù)，本研究發(fā)現(xiàn)芍藥甘草湯合桃紅四物湯中的黃酮類主要活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮可能是治療DPN 的主要成分。芍藥甘草湯合桃紅四物湯治療DPN 以STAT3、MAPK3、HSP90AA1、MAPK1、RELA 等為核心靶點(diǎn)基因，涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)肽與LPS的反應(yīng)、對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)等多個(gè)生物過(guò)程，并通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt 信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等關(guān)鍵信號(hào)通路起治療作用。在后續(xù)研究中，可對(duì)芍藥甘草湯合桃紅四物湯的活性成分進(jìn)行鑒別，并對(duì)篩選出的核心靶點(diǎn)基因及通路進(jìn)行驗(yàn)證，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。