基于VIGS技術(shù)的烤煙煙堿調(diào)控及對煙堿含量的影響

楊再軍 張麗 張福強(qiáng) 張權(quán) 昝建朋 田舉要 白茂軍 徐世曉

摘要：在對烤煙原料要求煙堿含量低的中煙工業(yè)企業(yè)中，煙堿含量過高的煙葉難以在原料配方中適配，導(dǎo)致工業(yè)可用性較低。為了降低煙葉中煙堿的含量，通過病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)（virus induced gene silencing，VIGS）構(gòu)建煙堿合成過程中4個關(guān)鍵基因（NtA622、NtPMT、NtBBL、NtMYB305a）的靶向沉默體系，探究瞬時沉默對基因相對表達(dá)量及煙堿含量的影響，并對不同載體的沉默效率與煙堿降低率進(jìn)行貢獻(xiàn)度分析。結(jié)果表明，通過目標(biāo)序列靶片段成功構(gòu)建了基于VIGS技術(shù)的沉默載體；T2處理沉默NtPMT基因后，最大沉默效率為55.23%，T3處理沉默NtBBL基因后，沉默效率為50.78%，兩者差異不顯著；各處理沉默相應(yīng)基因后，不僅表現(xiàn)出對應(yīng)基因表達(dá)量的下調(diào)，同時對本研究中其他基因的表達(dá)量也有影響；煙堿降低最多的是T3處理，降低率達(dá)到39.34%，同時T3處理沉默NtBBL基因的沉默效率對煙堿降低的貢獻(xiàn)度最大，為0.775。本研究建立的VIGS技術(shù)體系有效沉默目的基因的表達(dá)，沉默NtBBL基因的T3處理沉默效率較高，煙堿含量較低，為調(diào)控?zé)焿A含量提供了一種新思路與方法。

關(guān)鍵詞：VIGS；煙堿；載體構(gòu)建；相對基因表達(dá)量；病毒誘導(dǎo)的基因沉默

中圖分類號：TS44⁺1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0061-07

收稿日期：2023-09-29

基金項目：貴州省煙草公司安順市公司項目（編號：2023520400240038）；廣西壯族自治區(qū)煙草公司百色市公司項目（編號：202245100020409）。

作者簡介：楊再軍（1998—），男，貴州甕安人，碩士研究生，主要研究方向為煙草遺傳育種。E-mail：yangzaijun528.163.com。

通信作者：徐世曉，博士，副教授，從事煙草遺傳育種研究。E-mail：xushixiao@henau.edu.cn。

煙堿是煙草中最重要的一類生物堿，它不僅是煙草品質(zhì)的重要構(gòu)成要素，還是衡量煙草煙葉品質(zhì)、卷煙產(chǎn)品質(zhì)量的一項重要指標(biāo)。煙堿含量占煙草生物堿總量的90%～95%^[1]，并且煙草只有根系具有合成煙堿的能力，其中根尖皮層、表皮細(xì)胞及圍繞維管束的薄壁細(xì)胞是煙堿合成的主要部位，煙草其他組織和器官并不能合成煙堿^[2]。煙草煙堿的代謝途徑由吡啶環(huán)的形成、吡咯環(huán)的形成和兩環(huán)結(jié)合3個步驟組成，目前該過程已基本明確^[3]。

在煙堿合成代謝途徑中，腐胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶（putrescine N-methyl transferase，PMT）是煙堿合成的關(guān)鍵控制酶^[4-5]，PMT基因只在煙草根部表達(dá)，煙堿生物合成的第1步是腐胺在腐胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）的催化作用下生成S-腺苷甲硫氨酸、N-甲基腐胺^[6]。有研究表明，在煙草中利用消減雜交技術(shù)能一起分離得到PMT、A622^[7]，A622是一個異類黃酮還原酶基因；小檗堿橋狀酶（berberine bridge enzyme-like，BBL）基因家族在細(xì)菌、真菌和植物中廣泛存在^[8]；在煙堿代謝途徑的最后步驟（吡啶環(huán)和吡咯環(huán)結(jié)合）需要PIP家族異類黃酮還原酶類蛋白A622和小檗堿橋連酶類蛋白BBL的共同參與^[9-10]。NtMYB305a是R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，其分子進(jìn)化關(guān)系與擬南芥中的AtMYB21、AtMYB24分子進(jìn)化最接近^[11]，NtMYB305a的功能是通過結(jié)合在 AT-rich元件上來協(xié)同調(diào)控?zé)焿A代謝途徑中部分基因的表達(dá)，其中包括NtPMT、NtBBL、NtA622基因的表達(dá)，另外，NtMYB305a基因表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)都會顯著影響煙草植株葉片中的煙堿含量^[12]。在煙堿代謝的調(diào)控上，雖然減少施氮量、打頂留葉等栽培措施已被證實對煙草煙堿含量具有調(diào)節(jié)作用，但是還存在實際生產(chǎn)應(yīng)用中因人工勞務(wù)量重或經(jīng)濟(jì)效益差等原因?qū)е碌膽?yīng)用不夠廣泛等問題^[13]。諸多研究在探究煙堿合成途徑中的基因功能時，也有使用RNAi或者基因敲除的方式研究基因功能，但同時對不同基因沉默作用于煙堿含量的結(jié)果進(jìn)行橫向比較的報道較少。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是利用RNA介導(dǎo)的植物防御病毒免疫機(jī)制而發(fā)展起來的一項詮釋植物基因功能的反向遺傳學(xué)技術(shù)，其內(nèi)在的分子基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）^[14]。VIGS載體具有多種選擇，其中煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）載體以沉默效率高、沉默時效長、對接種植株不會造成明顯傷害等優(yōu)點(diǎn)而成為病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)中選擇率較高的載體^[15]。目前VIGS在煙草多方面均得到應(yīng)用，如郭玉鴿等構(gòu)建GS同工酶基因沉默體系，有效降低了氮代謝關(guān)鍵酶活性和含氮化合物含量^[16]；姚怡帆等沉默煙草NtPPO8基因，降低了PPO活性，提高煙葉耐烤性和降低煙葉褐變比例^[17]。國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于降低煙堿含量方面開展了大量研究，但是目前以VIGS技術(shù)沉默不同基因來調(diào)控?zé)焿A合成的還鮮見報道。本試驗構(gòu)建3個合成關(guān)鍵基因（NtPMT、NtA622、NtBBL）與1個轉(zhuǎn)錄因子NtMYB305a的沉默載體，以利用VIGS技術(shù)分別進(jìn)行沉默，探究基因相對表達(dá)量與煙堿含量的關(guān)系，以及各載體沉默效率對煙堿降低率的貢獻(xiàn)度，篩選出沉默效率較好的靶向沉默載體，以期為降低烤煙煙堿含量提供理論依據(jù)，從而提高烤煙煙葉工業(yè)可用性。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

本試驗于2023年4月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)煙草基地大棚內(nèi)進(jìn)行，材料采用盆栽種植，供試品種為云煙87，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院育種實驗室提供。pTRV2載體購自武漢淼靈生物科技公司，根癌農(nóng)桿菌GV3101與pTRV1購自北京擎科生物科技有限公司。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 選取沉默靶片段根據(jù)NCBI上已登錄的NtPMT（登錄號：107771646）、NtA622（登錄號：107784748）、NtBBL（登錄號：107791775）、NtMYB305a（登錄號：107821652）的序列，通過與鄭州煙草研究院自建云煙87與K326的全基因組數(shù)據(jù)庫對比，選取序列對比結(jié)果中的保守區(qū)段構(gòu)建VIGS載體，根據(jù)目標(biāo)序列合成30條引物。

1.2.2? VIGS載體構(gòu)建利用合成的30條引物在高保真PCR聚合酶（PV2）的作用下進(jìn)行PCR，以獲取克隆目標(biāo)序列。擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)條帶單一，而后參考Axygen產(chǎn)品說明書純化回收目的片段，同時用BamHⅠ/XhoⅠ對pTRV2-ve質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，獲得線性化載體，將純化回收的目的片段和pTRV2-ve線性化載體在重組酶作用下進(jìn)行重組連接。酶連后轉(zhuǎn)入大腸桿菌并進(jìn)行菌液涂布試驗，37? ℃溫育過夜。挑取平板中的單菌落，電泳鑒定陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序和酶切驗證。用驗證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，參照農(nóng)桿菌GV3101使用說明方法，挑取菌落培養(yǎng)在YEP液體培養(yǎng)基（25 mg/L利福平+50 mg/L 卡那霉素+25 mg/L 慶大霉素）中，取1 μL培養(yǎng)菌液進(jìn)行PCR鑒定后分別擴(kuò)繁。

1.2.3? 農(nóng)桿菌接種體系構(gòu)建制備LB培養(yǎng)基（50 μg/mL 利福平+50 μg/mL卡那霉素），將構(gòu)建成功的含病毒載體pTRV1、pTRV2、pTRV2-NtPMT、pTRV2-NtA622、pTRV2-NtBBL和pTRV2-NtMYB305a的農(nóng)桿菌菌株分別接種到LB培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)24 h，用分光光度計調(diào)整菌液濃度（D_{600 nm}）為0.8～1.0，用pTRV1分別與pTRV2、pTRV2-NtPMT、pTRV2-NtA622、pTRV2-NtBBL 和pTRV2-NtMYB305a等體積混合，取混合液50 mL轉(zhuǎn)入離心管中高速離心，棄上清液，而后加入等體積的農(nóng)桿菌浸染緩沖液（50 mmol/L氯化鈉、50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸、0.1 mmol/L乙酰丁香酮）中。避光2 h后，用1 mL注射器吸取含病毒載體的浸染液對6葉1心煙苗采用注射接種法浸染，注射部位為煙株嫩葉背面，主脈左右，避開支脈，每株煙苗注射左右對稱的2張葉片，每張葉片注射面直徑約1 cm。

1.3? 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置6個處理，處理如下：CK，不注射煙株；CK1空載，注射接種含pTRV2的侵染液（空載體對照）；T1，注射接種含pTRV2-NtA622的侵染液；T2，注射接種含pTRV2-NtPMT的侵染液；T3，注射接種含pTRV2-NtBBL的侵染液；T4，注射接種含pTRV2-NtMYB305a的侵染液。每個處理選取10株長勢均勻一致的煙苗進(jìn)行注射接種，每株煙苗接種4 mL。其他盆栽管理措施保持一致。

1.4? 測定指標(biāo)

1.4.1? 目的基因相對表達(dá)量的測定分別在接種后15 d取各處理煙株根部不定根，用清水洗凈后用脫脂棉吸干水分，充分消毒后經(jīng)液氮冷凍，取3份樣品作生物學(xué)重復(fù)。樣本按照RNA試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，根據(jù)選取的靶片段序列設(shè)計擴(kuò)增引物（表2）。參照Quant qRT-PCR kit（S Y B RGreen） （TIANGEN公司）使用說明，在Quant Studio Tnl 6 Flex熒光定量PCR儀（ABI公司）上進(jìn)行各目的基因的qRT-PCR檢測，以煙草26S rRNA為內(nèi)參基因，作3次技術(shù)重復(fù)。根據(jù)檢測結(jié)果中的C_T值，采用2^-ΔΔC_T法分析各目的基因的相對表達(dá)量。以對照組CK基因表達(dá)量為1，沉默效率的計算公式如下：沉默效率=（1-試驗組相對基因表達(dá)量）×100%。

1.4.2? 煙堿含量的測定同時取新生葉片作殺青樣，每個處理取3份樣品作生物學(xué)重復(fù)，將烘箱溫度升至105 ℃后，放入葉片樣品殺青30 min，然后將烘箱溫度調(diào)至60 ℃，使葉片充分脫水并烘干至恒定干重，去除主脈、支脈，研磨過60目篩，采用連續(xù)流動化學(xué)分析儀（AA3，德國Seal公司）測定煙堿含量。煙堿含量降低率的計算公式：降低率=（對照組煙堿含量-試驗組煙堿含量）/對照組煙堿含量×100%；

沉默效率對煙堿含量降低的貢獻(xiàn)度計算公式：貢獻(xiàn)度=煙堿含量降低率/基因沉默效率。

1.5? 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010、DPS 7.05軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Duncans新復(fù)極差法比較不同處理間各種指標(biāo)之間的差異。

2? 結(jié)果與分析

2.1? VIGS載體的構(gòu)建

2.1.1? 目標(biāo)序列的克隆將基因NtPMT、NtA622、NtBBL、NtMYB305a序列通過引物合成、PCR方法融合并克隆入載體pTRV2-ve。根據(jù)目標(biāo)序列合成30條引物，通過PCR獲取克隆目標(biāo)序列，克隆鑒定每個載體的2個條帶，結(jié)果見圖1。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物的驗證結(jié)果見圖2。

2.1.2? 載體的重組連接用BamHⅠ/XhoⅠ處理pTRV2-ve質(zhì)粒，進(jìn)行膠回收，在重組酶的作用下將目標(biāo)序列克隆的膠回收產(chǎn)物進(jìn)行重組連接。重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行涂布試驗，每個基因隨機(jī)挑選2個陽性菌進(jìn)行驗證，結(jié)果見圖3，提取驗證正確的質(zhì)粒測序并進(jìn)行酶切驗證，結(jié)果見圖4。

2.1.3? 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后取1 μL培養(yǎng)菌液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見圖5。檢測引物（位于目的片段插入位置的上、下游）序列：TRV-F，5′-CATTAGCGACATCTAAATAGG-3′；TRV-R，5′-AACCTAAAACTTCAGACACG-3′。

2.2? 各處理的基因沉默效率分析

由圖6可知，在接種后15 d，各基因在CK與CK1中的相對基因表達(dá)量差異不顯著，各處理對應(yīng)的基因相對表達(dá)量與CK、CK1相比均表現(xiàn)下調(diào)，且與CK間差異顯著。相較于CK，T1處理沉默NtA622基因后，NtA622基因的相對表達(dá)量最高，與其他處理差異顯著，基因沉默效率最低，為26.54%。

T2處理沉默NtPMT基因后，NtPMT基因的相對表達(dá)量最低，沉默效率最高，為55.23%，與T1、T4處理差異顯著。T3處理沉默NtBBL基因后，沉默效率為50.78%，與T2處理間差異不顯著。根據(jù)各處理基因相對表達(dá)量結(jié)果，沉默效果較好的是T2、T3處理。

2.3? 沉默后相關(guān)基因表達(dá)量差異分析

由圖7-a可知，在T1處理下對NtA622基因進(jìn)行沉默后，與CK相比，NtPMT、NtMYB305a基因的相對表達(dá)量下調(diào)，且差異顯著，NtBBL基因的相對表達(dá)量上調(diào)，但差異不顯著。NtPMT、NtBBL、NtMYB305a基因之間相對表達(dá)量差異顯著，相對基因表達(dá)量較高的是NtBBL基因，相對基因表達(dá)量較低的是NtPMT基因。

由圖7-b可知，在T2處理下對NtPMT基因進(jìn)行沉默后，NtA622、NtBBL、NtMYB305a基因的相對表達(dá)量與CK間差異顯著，NtA622基因的相對表達(dá)量上調(diào)，NtBBL、NtMYB305a的相對表達(dá)量均下調(diào)。在T2處理下，NtPMT、NtBBL、NtMYB305a基因之間相對表達(dá)量均存在差異，相對基因表達(dá)量較高的是NtA622基因，相對基因表達(dá)量較低的是NtMYB305a基因。

由圖7-c可知，在T3處理沉默NtBBL基因后，相較于對照組CK，NtA622基因的相對表達(dá)量上調(diào)，NtMYB305a基因的相對表達(dá)量下調(diào)，均差異顯著，NtPMT基因的相對表達(dá)量變化不大，差異并不顯著。NtA622、NtBBL、NtMYB305a在T3處理中的相對表達(dá)量均差異顯著，相對表達(dá)量較高的是NtA622基因，相對表達(dá)量較低的是NtMYB305a基因。

由圖7-d可知，T4處理沉默NtMYB305a基因后，NtA622、NtPMT、NtBBL基因的相對表達(dá)量均下調(diào)，且與CK差異顯著。但在T4處理中，NtA622、NtPMT、NtBBL基因相對表達(dá)量的差異并不顯著。

2.4? 沉默后各處理煙堿含量的變化

煙葉煙堿含量是沉默目的基因后的最終結(jié)果，由圖8可知，接種后15 d，各處理的煙堿含量較CK、CK1都有不同程度的下降。CK、CK1的煙堿含量變化無明顯差異，其他處理的煙堿含量均與CK差異顯著，其中煙堿含量降低最多的是T3處理，煙堿含量為0.50%，降幅為39.34%；其次為T2處理，煙堿含量為0.60%；煙堿含量降低最少的是T4處理，煙堿含量為0.78%，降幅為10.82%。

2.5? 各處理沉默效率對煙堿含量降低的貢獻(xiàn)度分析

由圖9可知，T2處理的基因沉默效率最高，顯著高于T1、T4處理，但與T3處理對應(yīng)基因的沉默效率間差異不顯著。各處理對應(yīng)的煙堿含量有顯著差異，其中煙堿含量降幅最高的是T3處理，顯著高于其他處理。T3處理的沉默效率對煙堿含量降低的貢獻(xiàn)度最高，為0.775，T4處理的沉默效率對煙堿含量降低的貢獻(xiàn)度最低，為0.307；基因沉默效率與煙堿含量降低率越高，說明對煙堿含量降低的貢

獻(xiàn)度越大，兩者成正比關(guān)系。

3? 討論

烤煙煙堿含量過高的問題一直是工業(yè)企業(yè)原料配方不適配、可用性低的重要影響因素，其中烤煙上部葉煙堿含量偏高的問題尤為突出。在烤煙大田生產(chǎn)中，常常通過調(diào)整移栽期、種植密度、打頂高度、留葉數(shù)、氮肥施用量等^[18-19]栽培措施調(diào)控?zé)?/p>

堿含量，但往往與烤煙形成的品質(zhì)互相矛盾。任夢娟研究發(fā)現(xiàn)，用嫁接技術(shù)對煙草進(jìn)行換根，可顯著降低煙堿生物合成，生產(chǎn)無煙堿或煙堿水平極低的煙葉^[20]，但煙堿含量過低的煙葉勁頭小、香氣量少、煙氣淡而無味且無法滿足工業(yè)需求^[21]。馮吉等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對煙堿合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的5個基因進(jìn)行基因編輯，獲得4種低煙堿純合基因型T2代煙草植株^[22]，但該技術(shù)存在易脫靶、無法對多拷貝基因編輯問題。張明月利用RNA干擾技術(shù)調(diào)控?zé)焿A合成，但只是通過PMT基因的沉默來進(jìn)行研究，載體單一^[23]。

本研究利用生物學(xué)技術(shù)調(diào)控?zé)焿A生物合成，通過大量文獻(xiàn)調(diào)研，篩選出煙堿合成中的3個關(guān)鍵基因（NtPMT、NtA622、NtBBL）與1個轉(zhuǎn)錄因子NtMYB305a。通過基因序列比對，選擇基因保守片段作為靶序列，通過PCR克隆沉默目標(biāo)序列，重組連接載體，獲得正確的質(zhì)粒，并用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，成功構(gòu)建了基于VIGS技術(shù)的4個基因沉默載體，利用4個載體成功沉默了相應(yīng)基因，降低了葉片中的煙堿含量。

煙堿生物合成是代謝途徑中多基因共同作用的結(jié)果^[24-25]，降低合成過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)量，可以降低葉片中的煙堿含量。本研究結(jié)果表明，利用VIGS技術(shù)體系對煙堿合成關(guān)鍵基因的沉默是有效的。各處理沉默后對應(yīng)基因相對表達(dá)量均顯著降低，其中T2處理沉默NtPMT基因后，其相對基因表達(dá)量降低得最多，沉默效率最大，為55.23%；T3處理沉默NtBBL基因后，沉默效率為50.78%，兩者差異并不顯著。在本研究建立的VIGS體系下，各處理沉默對應(yīng)基因均得到明顯的沉默效果，但相互之間的沉默效果均存在差異，這與郭玉鴿等的研究結(jié)果^[26]相似。其中以NtPMT、NtBBL基因的沉默效率較高。

在本研究中，各處理沉默相應(yīng)基因后，不僅表現(xiàn)出對應(yīng)基因表達(dá)量的下調(diào)，同時對本研究中其他基因的相對表達(dá)量也有影響，這與郭玉鴿等的研究結(jié)果^[16]相似。T1處理沉默基因NtA622后，NtPMT、NtMYB305a基因的相對表達(dá)量下調(diào)；T2處理沉默NtPMT基因后，NtA622的相對表達(dá)量上調(diào)，NtBBL、NtMYB305a基因的相對表達(dá)量下調(diào)；前人研究發(fā)現(xiàn)，A622參與所有生物堿合成所需的煙酸衍生物前體的形成，同時參與吡啶環(huán)、吡咯環(huán)的縮合反應(yīng)^[9]。而在PMT抑制表達(dá)的植株中，煙堿合成所需的N-甲基吡咯啉陽離子的豐度降低，而煙酸衍生的吡啶環(huán)代謝物的積累增多^[27]，這可能是因為這些基因的功能不同，所參與的代謝物質(zhì)形成具有相互調(diào)節(jié)作用。T3處理沉默NtBBL基因后，NtPMT基因表達(dá)量差異不顯著，NtMYB305a基因表達(dá)量下調(diào)，NtA622基因表達(dá)量上調(diào)。前人研究發(fā)現(xiàn)，BBL蛋白參與煙堿形成的最后階段，BBL的作用階段在吡啶環(huán)和 N-甲基-吡咯環(huán)起始縮合之后^[28]，而PMT基因主要作用是催化腐胺能夠生成S-腺苷甲硫氨酸、N-甲基腐胺^[5]，所以當(dāng)NtBBL基因沉默后，并不會太影響NtPMT的表達(dá)，而NtA622基因表達(dá)上調(diào)，原因是可能存在煙堿合成的次要途徑，不涉及BBL活動^[29]。T4處理沉默NtMYB305a基因后，NtA622、NtPMT、NtBBL基因的相對表達(dá)量均下調(diào)。前人研究發(fā)現(xiàn)，NtMYB305a對NtA622，NtPMT，NtBBL基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用^[30]，在茉莉酸信號途徑中，可能還存在其他未知的調(diào)控因子與NtMYB305a共同參與調(diào)控?zé)焿A代謝功能基因的表達(dá)^[31]。

煙堿含量是葉片中重要組成成分，也是本研究中不同沉默載體的直接作用結(jié)果。結(jié)果表明，各處理的煙堿含量均降低，且差異顯著。各處理基因沉默后對應(yīng)基因表達(dá)量趨勢與煙堿含量變化趨勢基本一致，其中煙堿降低最多的是T3處理，降低率達(dá)到39.34%。分析各處理基因沉默效率與煙堿降低率的關(guān)系時，貢獻(xiàn)度可以表示不同的沉默效率對煙堿降低多少的影響，其中T3處理沉默NtBBL基因的沉默效率對煙堿降低的貢獻(xiàn)度最高，為0.775。

本研究建立的VIGS技術(shù)體系具有成本低、方法操作簡單等優(yōu)點(diǎn)^[32]，可有效沉默目標(biāo)基因的表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到葉片煙堿含量顯著降低的目的。有研究發(fā)現(xiàn)，VIGS技術(shù)通過灌根接種法＋葉部注射法對根部的特異表達(dá)基因沉默效率高達(dá)80%^[33]。而本研究未采用灌根接種法，是考慮到煙堿是煙草特有化合物，對烤煙品質(zhì)十分重要，過高過低都會影響到烤煙品質(zhì)。下一步將繼續(xù)研究同時沉默不同目標(biāo)基因載體對煙堿含量的影響，以達(dá)到降低煙堿含量到適中的目的，以期用于大田生產(chǎn)實際提供理論基礎(chǔ)。

4? 結(jié)論

本研究建立的沉默NtBBL基因的VIGS體系能夠有效沉默目標(biāo)基因的表達(dá)，基因沉默效率達(dá)50.78%，成功降低了葉片中煙堿含量，降低率達(dá)39.34%，并且該基因沉默效率對煙堿降低的貢獻(xiàn)度達(dá)0.775，為烤煙煙堿調(diào)控提供了新的思路與方法，對優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)具有一定理論與實際意義。

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