柴達(dá)木地區(qū)患根腐病枸杞根際土壤微生物多樣性分析

方泰軍 侯璐 白露超

摘要：為了解枸杞受根腐病菌侵染后植株根組織與根際土壤中真菌與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及多樣性，采用高通量測序技術(shù)對柴達(dá)木地區(qū)患根腐病枸杞的根組織和根際土壤樣本進(jìn)行分析。結(jié)果表明，根際土壤中的細(xì)菌群落豐度略高于根組織，而真菌多樣性和豐度在根際土壤和根組織樣本中無顯著差異。在門水平，細(xì)菌群落中變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度較高，真菌群落中子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）的相對豐度較高；在屬水平，細(xì)菌中以假單胞菌（Pseudomonas）為主，真菌中以枝孢屬（Cladosporium）和被孢霉屬（Mortierella）為主。相關(guān)性分析顯示，細(xì)菌群落在根組織和根際土壤樣本中差異較大，而真菌群落在根組織和根際土壤樣本間相關(guān)性較高；枝孢屬（Cladosporium）和被孢霉屬（Mortierella）的相對豐度在根組織和根際土壤中均顯著上調(diào)，初步推測這2屬真菌可能與枸杞根腐病發(fā)病相關(guān)。

關(guān)鍵詞：枸杞；根腐病；高通量測序；微生物多樣性

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0530

中圖分類號：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2024）01013307

枸杞（Lycium barbarum）是茄科枸杞屬的多年生落葉灌木。在中國，其主要分布在青海至山西的黃河兩側(cè)，以及青海省的柴達(dá)木盆地和甘肅的河西走廊[1]。柴達(dá)木盆地的高海拔和強(qiáng)光照為枸杞提供了良好的生長條件[2]。然而，在枸杞規(guī)?；N植過程中，隨著年限的增加，根腐病愈發(fā)嚴(yán)重，導(dǎo)致枸杞大面積死亡，枸杞果實(shí)的質(zhì)量和產(chǎn)量嚴(yán)重下降[3]。根腐病常發(fā)生于植物根部，發(fā)病初期，根韌皮部褐化變黑，病斑沿根部向莖桿擴(kuò)散；發(fā)病后期，韌皮部腐爛脫落，造成整株死亡[45]。

土傳病原體影響土壤健康和糧食產(chǎn)量，其對作物造成的嚴(yán)重破壞是世界性難題[6]。研究表明，隱花疫霉會(huì)影響酪氨酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致非洲菊患根腐病[7]。茄病鐮刀菌也是土傳病原菌，可導(dǎo)致胡椒患根腐病，降低其產(chǎn)量[8]。大多數(shù)土傳病原體通常具有廣泛的宿主范圍[9-11]。植物根腐病的發(fā)生往往由多種病原共同作用所致，因此，研究植物根系微生物的多樣性對于綜合考慮植物發(fā)病原因具有重要意義[12]。Natacha等[13]通過研究擬南芥根際和周圍土壤中的細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)土壤中含有與擬南芥生長相互作用的微生物。這一發(fā)現(xiàn)也為枸杞根腐病從傳統(tǒng)藥劑防治到生物防治提供了新的思路。因此，本研究通過高通量測序研究患病枸杞根組織和根際土壤中的微生物多樣性及群落組成，明確患根腐病后枸杞根組織和根際土壤中的微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)，為枸杞根腐病的病因探索以及防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及測序

于2020 年7 月在青海省都蘭縣諾木洪農(nóng)場（36°20′—36°30′N，96°15′—96°35′E）枸杞種植區(qū)隨機(jī)選擇相同樹齡、長勢一致且患根腐病的植株6株，將其挖出，采集細(xì)根作為根樣品，并將附著在根部表面0～4 mm土壤用滅菌后的鑷子和毛刷進(jìn)行收集，作為根際土樣品。將采集到的根樣品和土壤樣品用無菌塑封袋保存，干冰運(yùn)送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增以及高通量測序。土壤樣品編號分別為S1、S2、S3、S4、S5和S6；根系樣品編號分別為R1、R2、R3、R4、R5和R6。其中，土壤樣品S5在試驗(yàn)過程中意外受損，未納入后續(xù)分析。

1.2 數(shù)據(jù)處理

測序得到的原始數(shù)據(jù)通過FLASH v1.2.7軟件進(jìn)行拼接，得到原始序列（raw tags），然后利用Trimmomatic v0.33軟件對原始序列進(jìn)行過濾，獲得優(yōu)化序列（clean tags），并用UCHIME v4.2軟件，鑒定去除嵌合體序列，得到有效序列（effectivetags）。最后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理各階段的序列數(shù)、平均序列長度（average length，Avglen）、GC 含量、Q30質(zhì)量值以及有效序列占雙端reads 數(shù)的比例（Effective）等參數(shù)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

樣品中細(xì)菌測序結(jié)果如表1所示，11個(gè)樣本測序得到90 044～230 942個(gè)PE reads；對每個(gè)樣本reads 進(jìn)行拼接，獲得80 035～184 074 個(gè)原始序列；經(jīng)過濾后，獲得76 309～174 566個(gè)優(yōu)化序列；去除嵌合體后，獲得了76 237～174 494個(gè)有效序列。樣本平均序列長度為232～287 bp，GC含量≥45.60%，Q30≥97.20%，有效序列占比≥75.56%。

樣品中真菌測序結(jié)果如表2所示，11個(gè)樣本測序得到60 696～80 299 個(gè)PE Reads；對所有reads進(jìn)行拼接，獲得56 920～75 989個(gè)原始序列；經(jīng)過濾后，獲得50 780～68 622個(gè)優(yōu)化序列；去除嵌合體后，獲得了50 403～66 482個(gè)有效序列。樣本平均序列長度為410～425 bp，GC含量≥51.42%，Q30≥93.30%，有效序列占比≥76.66%。

2.2 α 多樣性分析

由圖1可知，隨著樣品測序數(shù)量的增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩，在增加測序深度后，操作分類單位（operational taxonomic units， OTUs）數(shù)量并沒有明顯的增加，由此表明測序結(jié)果已涵蓋樣本絕大多數(shù)物種信息。

細(xì)菌α多樣性結(jié)果如表3所示，11個(gè)樣本聚類得到564～1 258 個(gè)OTUs，覆蓋率達(dá)99.45% 以上，Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)顯示S1、S2、S4樣本的物種豐度較高，即土壤樣本細(xì)菌在物種豐度上略高于根組織樣本；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在土壤和根組織樣本間無明顯差異。

真菌α多樣性結(jié)果如表4所示，11個(gè)樣本聚類得到140～238個(gè)OTUs，覆蓋率在99.97%以上，其中S1、S2、S4、R6樣本的覆蓋率為100%，表明測序結(jié)果基本覆蓋11組樣本的真菌種類。S4樣品的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)最高，且該樣品的Simpson指數(shù)最小，表明該樣品中真菌群落的豐度及多樣性均較高，其余樣品間差異較小。

2.3 群落組成分析

2.3.1 門水平 對OTUs 進(jìn)行注釋和差異分析，結(jié)果（ 圖2）表明，在細(xì)菌中，變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）在土壤和根組織中相對豐度較高（圖2A）；在真菌中，子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和被孢霉菌門（Mortierellomycota）在土壤和根組織中相對豐度較高。R2、R3、R4和R6樣品中變形菌門的相對豐度最高；S1、R1、R5 和R6 樣品中的藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）的相對豐度高于其他樣品（圖2B）。細(xì)菌中，變形菌門的相對豐度（Proteobacteria）在根系和土壤中差異較大，擬桿菌門（Bacteroidetes）次之；真菌中，子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度在土壤和根中差異較大，其次是擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。

2.3.2 屬水平 在屬水平，共鑒定了263個(gè)細(xì)菌屬和106個(gè)真菌屬，分別有44和32個(gè)屬在根組織和土壤間存在顯著差異。在細(xì)菌中，假單胞菌（Pseudomonas）在R2和S3樣品中的相對豐度較高（圖3A）；在真菌中，枝孢屬（Cladosporium）、被孢霉屬（Mortierella）、鏈格孢屬（Alternaria）、赤霉菌屬（Gibberrlla）和球腔菌屬（Mycosphaerella）的相對豐度較高（圖3B）。

2.4 β 多樣性分析

主成分分析結(jié)果（圖4）顯示，細(xì)菌群落在根和土壤樣品間組成差異較大（PC1 解釋了屬內(nèi)20.8%的變異）；真菌群落在根和土壤樣品間差異較小（PC1解釋了群落中25.3%的變異）。由此表明，患根腐病枸杞根組織和土壤樣本的真菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。

3 討論

根腐病給枸杞產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14]，因此，尋找主要病原菌對防治根腐病具有重要意義。本研究利用高通量測序分析了青海省柴達(dá)木地區(qū)患根腐病枸杞根和土壤中細(xì)菌和真菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)。11個(gè)樣品的真菌測序結(jié)果共獲得50 403 至66 482 個(gè)有效序列，細(xì)菌測序獲得76 237至174 494個(gè)有效序列；稀釋曲線結(jié)果表明測序深度能夠反映樣本內(nèi)物種信息?；谡婢蛄械闹鞒煞址治鼋Y(jié)果表明，根組織和土壤樣品中真菌的群落結(jié)構(gòu)相似性較高，推斷柴達(dá)木地區(qū)枸杞根腐病可能是由1種或多種真菌造成。

真菌的孢子可以通過空氣、水或土壤遠(yuǎn)距離傳播[15]。在生命周期的大部分時(shí)間，生活在土壤中的真菌被稱為兼性腐生真菌[16]。大多數(shù)植物病原菌屬于子囊菌屬和擔(dān)子菌屬，本研究表明，根組織及其根際土壤中，子囊菌門和擔(dān)子菌門的相對豐度較高，且在不同樣本間差異顯著。研究指出，立枯絲核菌、鐮刀菌、腐霉菌和擬盤多毛孢菌等真菌是草莓黑根病的主要病原菌[17]。

研究表明，枝孢屬真菌作為常見的病原菌可對柚子、雪松等植物造成病害[1819]；被孢霉屬真菌在楊梅衰弱病植株根際土中的相對豐度高于健康植株[20]。這2種真菌在本研究中的相對豐度也較高，推測它們以無性菌絲、分生孢子的形式在土壤和病株中越冬，待條件合適時(shí)，分生孢子萌發(fā)并產(chǎn)生芽管侵入傷口，然后產(chǎn)生孢子，從而進(jìn)行多次再感染，致使枸杞植株感病。

參考文獻(xiàn)

［1］ YAO R， HEINRICH M， ZOU Y， et al .. Quality variation of gouji（fruits of Lycium spp.） in China： a comparative morphologicaland metabolomic analysis [J/OL]. Front Pharmacol.， 2018， 9：151 [2022-05-10]. https：//doi.org/10.3389/fphar.2018.00151.

［2］ CHEN C， SHAO Y， LI Y， et al.. Trace elements in Lyciumbarbarum L. leaves by inductively coupled plasma massspectrometry after microwave assisted digestion and multivariateanalysis [J]. Spectrosc. Lett.， 2015， 48：775-780.

［3］ 王鳳寶，付金鋒，董立峰，等.多倍體菜用枸杞新品種天精 3號選育[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27（6）：723-730.

WANG F B， FU J F， DONG L F， et al.. Selection and breeding ofthe new mixoploid lycium chinense miller variety Tianjing 3 [J]. J.Nucl. Agric. Sci.， 2013， 27（6）：723-730.

［4］ CORRADO C， MINCUZZI A， SCHENA L， et al .. First report ofcollar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lyciumbarbarum [J/OL]. J. Plant Pathol.， 2018， 100： 361 [2022-05-10]. https：//doi.org/10.1007/s42161-018-0076-0.

［5］ 任如紅，胡毅敏，李紅葉，等.楊梅根腐病的早期診斷[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2000（1）：117-121.

REN R H， HU Y M， LI H Y， et al.. Early diagnosis of root rot inChinese strawberry [J]. J. Zhejiang For. Coll.， 2000（1）：117-121.

［6］ WANG L， LI X. Steering soil microbiome to enhance soilsystem resilience [J]. Crit. Rev. Microbiol.， 2019， 45： 5-6，743-753.

［7］ MUNIR N， CHENG C Z， XIA C S， et al .. RNA-Seq analysisreveals an essential role of tyrosine metabolism pathway inresponse to root-rot infection in Gerbera hybrida [J/OL]. PloSOne， 2019， 14（10）： 223519 [2022-05-10]. https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0223519.

［8］ MOREIRA E C， PINHEIRO D G， GORDO S， et al ..Transcriptional profiling by RNA sequencing of black pepper（Piper nigrum L.） roots infected by Fusarium solani f. sp.piperis [J/OL]. Acta Physiol. Plant， 2017， 39（10）：239 [2022-05-10]. https：//doi.org/10.1007/s11738-017-2538-y.

［9］ MANTIRI F R， SAMUELS G J， RAHE J E， et al .. Phylogeneticrelationships in Neonectria species having Cylindrocarponanamorphs inferred from mitochondrial ribosomal DNAsequences [J]. Can. J. Bot.， 2001， 79：334-340.

［10］ MAVRODI O V， WALTER N， ELATEEK S， et al.. Suppression ofrhizoctonia and pythium root rot of wheat by new strains ofPseudomonas [J]. Biol. Control， 2012， 62（2）：13-25.

［11］ TEWOLDEMEDHIN Y T， MAZZOLA M， BOTHA W J， et al ..Characterization of fungi （Fusarium and Rhizoctonia） andoomycetes （Phytophthora and Pythium） associated with appleorchards in South Africa [J]. Eur. J. Plant Pathol.， 2011， 130（2）：215-229.

［12］ WU Z， HAO Z， SUN Y， et al .. Comparison on the structure andfunction of the rhizosphere microbial community betweenhealthy and root-rot Panax notoginseng [J]. Appl. Soil Ecol.，2016， 107：99-107.

［13］ NATACHA B， HORTON M W， BERGELSON J， et al.. Bacterialcommunities associated with the leaves and the roots of Arabidopsisthaliana [J/OL]. PloS One， 2013， 8：e56329 [2022-05-10]. https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0056329.

［14］ CAO Y T， LIU J L. Review on the diseases and insects ofLycium barbarum L. [J]. Plant Dis. Pests， 2014， 5（6）：8-12.

［15］ ROCHON D. Fungal transmission of plant viruses [J]. Annu.Rev. Phytopathol.， 2009， 34（1）：87-108.

［16］ LIU Y， SUN Q， LI J， et al .. Bacterial diversity among the fruitbodies of ectomycorrhizal and saprophytic fungi and theircorresponding hyphosphere soils [J]. Sci. Rep.， 2018， 8（1）：1-10.

［17］ DINLER H， BENLIOGLU S， BENLIOGLU K. Rhizoctoniafragariae causes black root rot on strawberry seedlings inTurkey [J]. Australas. Plant Dis. Notes， 2018， 13（1）：1-3.

［18］ 呂靖雯，劉蕊，李國華，等.柚果面枝孢菌斑點(diǎn)病病原鑒定[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2018，44（6）：687-694.

LYU J W， LIU R， LI G H， et al .. Identification of pathogenscausing fruit spot disease on Citrus grandis [J]. J. ZhejiangUniv. （Agric. Life Sci.）， 2018， 44（6）：687-694.

［19］ 雷桂林，劉云龍，劉雪峰，等.雪松針葉枯斑病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究[J].林業(yè)科學(xué)研究， 2003（4）：453-458.

LEI G L， LIU Y L， LIU X F， et al .. Determination of necroticspot pathogen on needle of Cedrus deodara and the biologicalcharacteristics of the pathogen [J]. For. Res.， 2003（4）：453-458.

［20］ 任海英，王程安，俞浙萍，等.楊梅衰弱病根際土壤真菌的定量檢測與分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2022，52（4）：529-536.

REN H Y， WANG C A， YU Z P， et al .. Quantitative detectionand analysis of rhizospheric soil fungi in decline disease ofMyrica rubra [J]. Acta Phytopathol. Sin.， 2022， 52（4）：529-536.

（責(zé)任編輯：張冬玲）