畢赤酵母外源蛋白分泌及折疊途徑的改良進(jìn)展

路澤群 劉寧 張紅蓮 王苑 黃火清

摘要：工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域常用的活性蛋白和工業(yè)酶大多數(shù)通過異源表達(dá)系統(tǒng)獲得。畢赤酵母（Pichiapastoris）是優(yōu)秀的外源蛋白表達(dá)宿主之一，以畢赤酵母為宿主的表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳穩(wěn)定性好、翻譯后修飾、蛋白表達(dá)和分泌水平高及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但在高效表達(dá)過程中外源蛋白過量聚集會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)蛋白不能正確折疊和有效分泌，從而影響蛋白表達(dá)水平。概述了通過信號(hào)肽優(yōu)化、分子伴侶優(yōu)化以及融合蛋白表達(dá)等分泌及折疊途徑的改良，從而促進(jìn)外源蛋白高效表達(dá)的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：畢赤酵母；分泌折疊途徑；分泌信號(hào)肽；分子伴侶；融合表達(dá)

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0160

中圖分類號(hào)：S182；TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）01001810

目前，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域所需要的活性蛋白大多通過外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)獲得。常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)包括微生物表達(dá)系統(tǒng)、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。微生物表達(dá)系統(tǒng)主要包括大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)以及絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)。相較于其他表達(dá)系統(tǒng)，微生物表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳操作便捷、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)基營養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、蛋白表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)[1]。其中，畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)還具有蛋白質(zhì)分泌表達(dá)和蛋白翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)[2]，使其在外源蛋白的表達(dá)中備受青睞。

影響外源蛋白在畢赤酵母中高效表達(dá)的因素較多，常見的包括外源基因的轉(zhuǎn)錄水平、分泌信號(hào)肽（signal peptide，SP）的選擇、外源蛋白的折疊和外源蛋白的穩(wěn)定性。目前，針對(duì)外源基因轉(zhuǎn)錄水平的優(yōu)化研究較多，可以通過優(yōu)化外源基因密碼子[3]、增加基因拷貝數(shù)和選擇啟動(dòng)子來改善[4]；而針對(duì)外源蛋白分泌及折疊途徑的改良相對(duì)較少。畢赤酵母細(xì)胞外源蛋白分泌是被廣泛報(bào)道的“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體”蛋白分泌途徑，此途徑中新生肽鏈構(gòu)象的維持和轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白的正確折疊和修飾是蛋白合成分泌的關(guān)鍵[56]，可以優(yōu)化改良表達(dá)載體及宿主來提高外源蛋白的表達(dá)。哺乳動(dòng)物真核表達(dá)系統(tǒng)成本過高，原核表達(dá)系統(tǒng)沒有翻譯后修飾，近年來畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)因具有遺傳穩(wěn)定性好、翻譯后修飾、蛋白表達(dá)和分泌水平高及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，受到越來越多的關(guān)注。但該系統(tǒng)仍面臨很多蛋白難以在其中高效表達(dá)的困境，其主要原因是在高效表達(dá)過程中外源蛋白過量聚集導(dǎo)致目標(biāo)蛋白不能正確折疊和有效分泌，從而影響蛋白表達(dá)水平。研究者在改良蛋白質(zhì)分泌和折疊途徑方面已做了很多嘗試，已經(jīng)通過改良實(shí)現(xiàn)了大量難以表達(dá)的外源蛋白的高效表達(dá)。本文綜述了近年來畢赤酵母外源蛋白分泌及折疊途徑的改良進(jìn)展，概述了包括分泌信號(hào)肽、分子伴侶以及融合表達(dá)在內(nèi)的分泌和折疊途徑優(yōu)化以提高畢赤酵母外源蛋白表達(dá)的研究進(jìn)展，為在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)更多外源蛋白的高效表達(dá)提供新的思路。

1 分泌信號(hào)肽優(yōu)化

畢赤酵母自身分泌蛋白較少，外源蛋白分泌表達(dá)后易于純化，其中分泌信號(hào)肽的選擇和優(yōu)化對(duì)于外源蛋白高效分泌到胞外至關(guān)重要（后續(xù)介紹的信號(hào)肽均為分泌信號(hào)肽）。在信號(hào)肽的選擇中，首先需要關(guān)注外源蛋白的特性，部分蛋白可以在自身信號(hào)肽的引導(dǎo)下完成分泌表達(dá)，這些蛋白可以選擇用自身的信號(hào)肽，而大部分蛋白需要外源分泌信號(hào)肽實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，外源蛋白可以利用信號(hào)肽分析軟件分析其自身信號(hào)肽序列，大多數(shù)蛋白需要去除其自身分泌信號(hào)肽，使用畢赤酵母系統(tǒng)中常用的高效分泌信號(hào)肽[7-9]。畢赤酵母系統(tǒng)中使用的大多數(shù)信號(hào)肽是由18～30個(gè)氨基酸殘基組成的肽段，一般將序列加在外源蛋白的N端。如果存在前導(dǎo)肽，會(huì)在其后帶上畢赤酵母內(nèi)源蛋白酶酶切位點(diǎn)，以便在外源蛋白成熟并被引導(dǎo)到囊泡的過程中被切除分離，而外源蛋白通過胞吐分泌至胞外[1011]。目前，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的信號(hào)肽有釀酒酵母來源的α交配因子（α-mating factor，α-MF）信號(hào)肽、糖化酶信號(hào)肽STA1和蔗糖酶（sucrase 2，SUC2）信號(hào)肽，畢赤酵母本身的酸性磷酸酶（phosphatase1，PHO1；phosphatase5，PHO5）信號(hào)肽和絮凝因子（flocculation protein 10，F(xiàn)LO10）信號(hào)肽等[12]。近年來，越來越多的研究者嘗試對(duì)現(xiàn)有信號(hào)肽進(jìn)行改良和優(yōu)化[13]，或發(fā)掘新的信號(hào)肽[14]。Ito 等[15] 對(duì)α-MF信號(hào)肽的20個(gè)單氨基酸進(jìn)行替換以探究其對(duì)外源蛋白分泌的影響，結(jié)果表明，α-MF信號(hào)肽中的8 個(gè)單氨基酸突變（V50A、V38A、G40D、L42S、L63S、L64S、F65S和I66T）與野生型α-MF信號(hào)肽相比，抗溶菌酶單鏈抗體的分泌水平顯著增加（超過5倍）。Duan等[16]根據(jù)已報(bào)道的畢赤酵母的分泌組和基因組預(yù)測(cè)了4個(gè)畢赤酵母內(nèi)源性信號(hào)肽（Dan4、Gas1、Msb2和Fre2），通過對(duì)3個(gè)蛋白的表達(dá)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，4個(gè)內(nèi)源信號(hào)肽序列的活性均高于釀酒酵母α-MF信號(hào)肽，其中Msb2信號(hào)肽提高了所有蛋白分泌表達(dá)水平（1.5～8.0倍），而Dan4對(duì)測(cè)試蛋白分泌表達(dá)水平的提升不如Msb2，但有效地增加了所有測(cè)試蛋白的總產(chǎn)量（胞內(nèi)加胞外）。信號(hào)肽的選擇和優(yōu)化對(duì)外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的影響見表1。

2 分子伴侶選擇和優(yōu)化

新生成的蛋白質(zhì)肽鏈主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）進(jìn)行加工和折疊，如果外源蛋白生成過快過多，遠(yuǎn)超過ER本身輔助折疊的能力，會(huì)導(dǎo)致大量蛋白錯(cuò)誤折疊或未折疊，這些錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白大量聚集，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成壓力并觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（unfoldedprotein response，UPR）[23]。分子伴侶是一類能協(xié)助細(xì)胞內(nèi)分子組裝及蛋白質(zhì)折疊的蛋白質(zhì)，但其本身不成為最后功能結(jié)構(gòu)中的組分。上調(diào)表達(dá)分子伴侶中的促折疊酶可以促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊，降低ER中錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的水平，從而消除UPR 壓力[24]。不能正確折疊的蛋白質(zhì)最終會(huì)通過ER相關(guān)降解（endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD）途徑降解。另外，當(dāng)錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)超過ER折疊能力時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)反饋抑制促折疊蛋白的活性，增強(qiáng)ERAD途徑，緩解系統(tǒng)的壓力，過多蛋白質(zhì)被ERAD途徑降解會(huì)直接影響外源蛋白的表達(dá)水平[2526]。當(dāng)外源基因在畢赤酵母內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平超過畢赤酵母本身的折疊能力時(shí)，過表達(dá)促折疊分子伴侶能很好地促進(jìn)外源蛋白質(zhì)的正確折疊，減少UPR壓力，從而提高外源蛋白表達(dá)水平。Wang等[27]首先嘗試增加基因拷貝數(shù)來提高殼聚糖酶的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)在含4個(gè)殼聚糖酶基因時(shí)殼聚糖酶酶活性最高，繼續(xù)增加基因拷貝數(shù)，酶活性反而降低，隨后在含4個(gè)殼聚糖酶基因菌株中過表達(dá)組合分子伴侶Pdi/Ero1、Ssa4/Sse1 和Ydj1/Sso2，酶活性分別提高61%、31%、42%，最后構(gòu)建了同時(shí)過表達(dá)6個(gè)分子伴侶的菌株，并在此基礎(chǔ)上繼續(xù)增加基因拷貝數(shù)來提高酶活性，使酶活性提高了約7倍。這就為優(yōu)化外源基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)提供了一種策略，通過過表達(dá)分子伴侶或其調(diào)節(jié)蛋白，提高外源蛋白質(zhì)的折疊，降低ER的壓力，從而促進(jìn)外源蛋白的表達(dá)。

目前，在畢赤酵母系統(tǒng)中能促進(jìn)外源蛋白表達(dá)水平的分子伴侶或調(diào)節(jié)蛋白主要有調(diào)節(jié)蛋白（Hac1）、二硫化物異構(gòu)酶（protein disulfideisomerase，Pdi）、氧化還原酶1（endoplasmicreticulum oxidoreductin 1，Ero1）和重鏈結(jié)合蛋白（heavy-chain binding protein，Bip）等。其中，Hac1是能激活分子伴侶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)Hac1能間接增加伴侶蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)外源蛋白質(zhì)的折疊和分泌[28]。Liu等[29]構(gòu)建篩選獲得了過表達(dá)Hac1 的菌株，發(fā)現(xiàn)利用該菌株作為宿主菌，能使人源溶菌酶的產(chǎn)量提高約20%，達(dá)到目前搖瓶發(fā)酵中的最高水平。Bip屬于熱休克蛋白70（heat shock proteins 70，HSP70）家族，主要功能是促進(jìn)目的蛋白和其他分子伴侶結(jié)合[3031]，Sallada等[32]通過在畢赤酵母中過表達(dá)Bip 使生物表面活性劑HFBI的表達(dá)量增加了大約20倍。Ero1能調(diào)節(jié)Pdi 的活性，而Pdi 主要催化二硫鍵形成[33]。Wang等[34]過表達(dá)Pdi，杜邦嗜熱菌來源的脂肪酶表達(dá)量提高了1.46倍；Huang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Pdi 使脂肪酶產(chǎn)量提高1 倍；Shen 等[36]通過過表達(dá)Ero1 提高了腈化酶的表達(dá)水平。研究表明，過表達(dá)與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的分子伴侶可以提高重組蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)水平或蛋白活性（表2），但分子伴侶的選擇由目的蛋白的性質(zhì)決定。

分子伴侶中最大的一類是熱休克蛋白（heatshock proteins，HSP）家族，根據(jù)其分子量大小，大致將熱休克蛋白分為HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和小分子熱休克蛋白（small heat shockproteins，sHSP）。熱休克蛋白發(fā)揮功能需要具有其他功能（結(jié)合目的蛋白、運(yùn)輸目的蛋白）的分子伴侶，各個(gè)家族之間共同協(xié)作蛋白質(zhì)的折疊與運(yùn)輸[42]。畢赤酵母源的Ssa1和釀酒酵母源Sis1伴侶蛋白屬于HSP40家族，能幫助新生肽鏈維持正確構(gòu)象 [43]。Deng等[44]在畢赤酵母中過表達(dá)了Ssa1-Sis1 組合伴侶，顯著提高了可溶性豬生長激素（pGH）蛋白的產(chǎn)量，達(dá)到70 mg·L-1。Ydi1p（HSP40家族）和Sec63（輔助分子伴侶）均是分泌蛋白在跨膜易位過程中的關(guān)鍵伴侶蛋白[4546]。

Zhang等[47]過表達(dá)了Ydj1p和Sec63的組合伴侶，使重組激素蛋白G-CSF的產(chǎn)量提高了7.6倍。上述研究表明，HSP家族的分子伴侶及其輔助分子伴侶能促進(jìn)外源蛋白的表達(dá)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為高等真核細(xì)胞，其分子伴侶系統(tǒng)更加完善，可以用來表達(dá)醫(yī)藥領(lǐng)域所需要的活性蛋白，但其成本高、操作難度大，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。而這些活性蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差，使其在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中難以表達(dá)[48]，因此可以借助高等真核細(xì)胞來源的分子伴侶幫助其在畢赤酵母中表達(dá)。此外，畢赤酵母中大部分的分子伴侶在哺乳動(dòng)物中有功能同源物，如酵母源Sec63與人源SEC63有53% 的同源性[49]，酵母源Sis1 和人源DNAJB6 是功能同源物[50]。Bankefa等[51]比較了畢赤酵母、釀酒酵母、里氏木霉和人源的Hac1p 同源物PpHac1p、ScHac1p、TrHac1p 和HsXbp1 對(duì)畢赤酵母外源蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HsXbp1 使β-甘露聚糖酶產(chǎn)量提高48.6%，而過表達(dá)其余3種Hac1p 同源物對(duì)β-甘露聚糖酶產(chǎn)量無明顯影響。因此，高等真核細(xì)胞來源的促折疊因子能促進(jìn)外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)，可以嘗試將其導(dǎo)入畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，幫助活性蛋白表達(dá)。

3 融合表達(dá)技術(shù)

融合表達(dá)技術(shù)是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常用的一種促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)的策略，融合蛋白能幫助目標(biāo)蛋白正確折疊以降低外源蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的壓力，能促進(jìn)外源蛋白的可溶表達(dá)，從而增加外源蛋白的表達(dá)量。目前在大腸桿菌中常用的融合標(biāo)簽包括麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）、小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier protein，SUMO）、硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）、肝片蟲8 kD 抗原（fasciola hepatica 8kDantigen，F(xiàn)h8）和N-Utilization substance A（NusA）等。但融合標(biāo)簽的存在可能會(huì)影響蛋白質(zhì)本身的活性，所以在設(shè)計(jì)融合蛋白時(shí)需要根據(jù)外源蛋白的性質(zhì)考慮后續(xù)融合標(biāo)簽切除的問題[52]。融合表達(dá)技術(shù)在畢赤酵母中的應(yīng)用不如在大腸桿菌中廣泛，但近幾年受到的關(guān)注越來越多，下文對(duì)畢赤酵母系統(tǒng)中應(yīng)用到的融合表達(dá)策略進(jìn)行概述，部分融合表達(dá)技術(shù)在畢赤酵母中的應(yīng)用見表3。

3.1 小泛素相關(guān)修飾物

SUMO（11.6 kD）是泛素相關(guān)蛋白家族的成員，具有調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)功能、提高融合蛋白的表達(dá)量、促進(jìn)靶蛋白正確折疊、提高重組蛋白可溶性等作用[53]。融合表達(dá)后可以使用特定的SUMO蛋白酶將其從融合蛋白上切割分離，不影響目的蛋白的活性[54]。Zhan 等[55]對(duì)抗菌肽LL37 活性中心氨基酸進(jìn)行了置換，并和6×His-SUMO 標(biāo)簽結(jié)合，成功表達(dá)了融合蛋白，標(biāo)簽切割后具有很強(qiáng)的抗菌活性。Wang 等[56]使用人源SUMO3 與抗菌肽NZ17074融合表達(dá)，并通過去除融合標(biāo)簽，首次在畢赤酵母中高水平發(fā)酵得到具有抑菌活性的抗菌肽NZ17074，產(chǎn)量達(dá)到4.1 mg·L-1。Zhang 等[57]將黑曲霉來源的酸性脂肪酶（acidic lipase fromAspergillus niger，ANL）與SUMO融合表達(dá)，成功獲得其融合蛋白SANL，融合蛋白不需要切割就具有ANL活性，活性比母體ANL高1.85倍，且融合蛋白對(duì)胃蛋白酶具有抗性，在pH 3.0～6.0時(shí)對(duì)三油酸甘油酯具有高水解活性。上述研究表明，在畢赤酵母中采用SUMO 標(biāo)簽與外源蛋白融合策略，能促進(jìn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)，甚至增強(qiáng)了某些蛋白的生物活性。

3.2 麥芽糖結(jié)合蛋白

麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP，42 kD）是最常用的融合標(biāo)簽之一，可增強(qiáng)目標(biāo)蛋白的可溶性，并具有類似分子伴侶的功能，同時(shí)它被認(rèn)為可與未折疊蛋白中的疏水性氨基酸殘基相互作用，以防止蛋白質(zhì)聚集或水解[58]。已有研究表明，MBP可以增強(qiáng)畢赤酵母中外源蛋白的分泌，MBP在融合蛋白中的位置會(huì)調(diào)節(jié)畢赤酵母分泌途徑[59]。D?lken等[60]將人源顆粒酶B（GrB）與MBP 融合表達(dá)，并在二者之間加入酵母內(nèi)源性蛋白酶識(shí)別序列，結(jié)果在培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到單獨(dú)的MBP和GrB，MBP的融合顯著提高了分泌到培養(yǎng)上清液中的GrB 含量，且GrB具有正?；钚?。

3.3 木聚糖酶

木聚糖酶是水解酶家族的一員，能夠降解植物細(xì)胞壁中的木聚糖，在食品、農(nóng)業(yè)、紡織業(yè)和工業(yè)等生產(chǎn)中都有廣泛應(yīng)用[61]，目前木聚糖酶能夠在多個(gè)微生物表達(dá)系統(tǒng)中穩(wěn)定高效表達(dá)[18，6263]。瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum 來源的木聚糖酶富含酸性氨基酸，是優(yōu)質(zhì)的融合標(biāo)簽選擇對(duì)象，且在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)水平很高。Huang等[64]將木聚糖酶XynCDBFV作為融合標(biāo)簽與生長抑素融合表達(dá)，成功表達(dá)出了具有雙功能的融合蛋白，既有生長抑素的活性，又具備木聚糖酶的活性。Cui等[65]將木聚糖酶XynCDBFV作為融合標(biāo)簽與雞蛋清溶菌酶（hen egg white lysozyme，HEWL）融合表達(dá)，并在二者間加入包含內(nèi)源性蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列，成功表達(dá)了HEWL，產(chǎn)量達(dá)到3.5 g·L-1，活性達(dá)到1.5×105 U·L-1，是目前重組表達(dá)的最高水平。上述研究表明，木聚糖酶作為融合標(biāo)簽的策略可以有效提高一些難表達(dá)蛋白的產(chǎn)量。

3.4 人血清白蛋白

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）半衰期長、免疫功能少，在不切割的情況下一般不影響目的蛋白的特性，是一種優(yōu)秀的融合標(biāo)簽，通常與一些醫(yī)藥蛋白融合表達(dá)，可改善重組醫(yī)藥蛋白的生物活性[66]。Naseem 等[67]將HSA 和干擾素在畢赤酵母中融合表達(dá)，得到了具有生物活性的融合蛋白（86 mg·L-1），且延長了干擾素的半衰期；黃甜甜等[68]將HSA和人成纖維細(xì)胞生長因子在畢赤酵母中融合表達(dá)，得到了具有生物活性的融合蛋白（0.94 mg·mL-1），且使人成纖維細(xì)胞生長因子的半衰期延長了27.6 倍。上述研究表明，HSA作為融合標(biāo)簽?zāi)軒椭鞍椎谋磉_(dá)，更能延長部分醫(yī)藥蛋白的半衰期，是醫(yī)藥蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的優(yōu)質(zhì)融合標(biāo)簽選擇對(duì)象。關(guān)于HSA作為融合標(biāo)簽在畢赤酵母中融合表達(dá)的應(yīng)用見表3。

3.5 連接肽

在融合表達(dá)技術(shù)的應(yīng)用中，因目的蛋白和融合標(biāo)簽的不同特性，二者之間的連接肽（linker）可能對(duì)表達(dá)水平產(chǎn)生不同的影響，因此linker的選擇也十分重要。Linker主要包括柔性linker和剛性linker。柔性linker 通常由甘氨酸與絲氨酸或蘇氨酸組成，通過保持功能性蛋白質(zhì)之間的距離來發(fā)揮作用；剛性linker 通常由谷氨酸、丙氨酸和賴氨酸組成，能準(zhǔn)確分割功能域，方便增加伴侶蛋白之間的安全距離[69]。重組融合蛋白一般是以融合標(biāo)簽-目的蛋白結(jié)合在一起的形式表達(dá)，這種形式可能會(huì)因?yàn)槿诤蠘?biāo)簽的存在影響目的蛋白的活性，因此，可以在linker后加入一段特定序列，使融合標(biāo)簽?zāi)軌蚝湍康牡鞍追蛛x，這段序列通常選擇能夠被特定蛋白酶識(shí)別的位點(diǎn)[69]。畢赤酵母本身會(huì)分泌一些能識(shí)別特定位點(diǎn)的蛋白酶[70]，因此可以選擇畢赤酵母內(nèi)源性蛋白酶，例如Kex2[71]和STE13[72]，也可以選擇一些外源特異性蛋白酶，例如腸激酶（enterokinase，EK）[73]和煙草蝕紋病毒（tobacco etch virus，TEV）蛋白酶[74]。

4 結(jié) 語

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過幾十年的發(fā)展逐漸成熟，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了千余種外源蛋白的表達(dá)，但目前仍有很多蛋白未能在其中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，因此仍有改良的空間。信號(hào)肽在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的外源蛋白分泌過程中扮演了重要角色，使用外源蛋白本身的信號(hào)肽往往不能達(dá)到很高的分泌表達(dá)水平，目前主要是利用畢赤酵母中常用的高效分泌信號(hào)肽來實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效分泌[80]。伴隨畢赤酵母基因組測(cè)序完成，其自身越來越多的信號(hào)肽被發(fā)現(xiàn)，有些已經(jīng)驗(yàn)證對(duì)外源蛋白分泌有良好的效果，后續(xù)根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，可以有選擇的利用信號(hào)肽，并對(duì)其進(jìn)行改造優(yōu)化以提高目的蛋白的產(chǎn)量。目的蛋白在合適信號(hào)肽引導(dǎo)下經(jīng)過正確途徑分泌表達(dá)，可能會(huì)由于轉(zhuǎn)錄水平較高，導(dǎo)致大量蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積壓無法正確折疊，共表達(dá)分子伴侶是解決該問題的一個(gè)良好策略 [81]。目前，分子伴侶在外源蛋白折疊過程中的作用已被確證，但作用機(jī)制尚不清楚，主要是通過大量的嘗試來驗(yàn)證各個(gè)分子伴侶對(duì)外源蛋白表達(dá)的影響，未來可以聚焦分子伴侶的協(xié)同作用機(jī)制，更有針對(duì)性地理性改造分子伴侶系統(tǒng)，最終實(shí)現(xiàn)更多外源蛋白的高效表達(dá)。部分蛋白在分泌表達(dá)后不穩(wěn)定，會(huì)被降解，利用融合表達(dá)技術(shù)可以提高其穩(wěn)定性，從而促進(jìn)外源蛋白的高效表達(dá)[67]，目前該技術(shù)在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用還不廣泛，但已經(jīng)顯現(xiàn)良好的效果，部分外源蛋白已經(jīng)通過該技術(shù)達(dá)到了較高的產(chǎn)量，未來隨著融合標(biāo)簽的豐富，可以有更多的選擇來實(shí)現(xiàn)難表達(dá)的外源蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)的高效表達(dá)。

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（責(zé)任編輯：胡立霞）