飼料中添加蠶豆對吉富羅非魚肝臟組織結(jié)構(gòu)、抗氧化能力、脂肪代謝及糖代謝的影響

■ 彭 凱 符 兵，2 彭 振 李 玲 韋木蓮 黃 文 曹俊明，2 陳 冰*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；2.廣東海洋大學(xué)，廣東湛江 524088；3.茂名市農(nóng)業(yè)科技推廣中心,廣東茂名 525000；4.佛山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東佛山 528145）

吉富羅非魚（tilapia,Oreochromis niloticus），具有生長快、繁殖力強(qiáng)、食性雜、易馴化等特點(diǎn)，且背寬肉厚，出肉率高，富含多種不飽和脂肪酸，是我國南方養(yǎng)殖主要的經(jīng)濟(jì)魚種之一。研究和生產(chǎn)表明，蠶豆（faba bean,Vicia fabaL.）可顯著提高羅非魚肉質(zhì)硬度、彈性、咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性和肌肉耐折力等物理特性，降低肌肉粗脂肪[1-3]，促進(jìn)淡水魚肌肉“脆化”[4]。但未經(jīng)處理或加工的蠶豆含有胰蛋白抑制劑、溶血素、蠶豆凝集素、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子[5]，會在脆化過程中致使魚體出現(xiàn)腫身、脂肪積蓄及變性、肝臟腫大、肝細(xì)胞膜損傷等問題[6-7]，而經(jīng)高溫膨化后的蠶豆抗?fàn)I養(yǎng)因子含量大大降低[8-9]。有關(guān)蠶豆對魚類脂質(zhì)代謝的影響已在草魚上報(bào)道[6，10]，但蠶豆對羅非魚肝臟糖代謝影響鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以吉富羅非魚為研究對象，研究飼料中添加不同水平的蠶豆對吉富羅非魚肝臟組織結(jié)構(gòu)、抗氧化能力以及糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)的影響，進(jìn)一步探討蠶豆作用于羅非魚肝臟糖脂代謝的機(jī)理，以期為蠶豆及其膨化飼料在羅非魚脆化過程的高效養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以含豆粕和菜粕的飼料作為基礎(chǔ)飼料，在基礎(chǔ)飼料上分別添加0（C0，對照組）、15%（C15 組）、30%（C30 組）和60%（C60 組）的蠶豆，制成4 種等氮等脂試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)用蠶豆購于湖北合盈合作社，營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）：蛋白質(zhì)28.5%、脂肪0.8%、水分11.1%、灰分3.4%、淀粉43.0%、蛋氨酸0.2%、賴氨酸2.0%。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。所有飼料原料經(jīng)粉碎并通過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，混合均勻后通過T52水產(chǎn)飼料膨化機(jī)制成粒徑為3 mm 的膨化飼料（膨化溫度為110 ℃），噴油后經(jīng)55 ℃烘干，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ)，%)

1.2 試驗(yàn)用魚及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

吉富羅非魚由廣東羅非魚良種場提供，在暫養(yǎng)池馴養(yǎng)1 周后，選取健康、活潑、初始體重為（500.23±0.34） g 的吉富羅非魚600 尾，隨機(jī)分為4 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)50 尾魚，飼養(yǎng)試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家科技園區(qū)白云基地池塘網(wǎng)箱中進(jìn)行，網(wǎng)箱規(guī)格為1.5 m×1.5 m×2 m。每天分別在08：30 和17：00 投喂1次，采用表觀飽食投喂。養(yǎng)殖期間24 h供氧，溶氧量＞6.0 mg/L，氨氮＜0.05 mg/L，亞硝酸鹽＜0.01 mg/L，溫度26～33 ℃。每天記錄試驗(yàn)魚死亡數(shù)量、飼料投喂量及水質(zhì)情況。試驗(yàn)期100 d。

1.3 樣本采集

每個重復(fù)取3 尾魚，經(jīng)MS-22 麻醉后，用2 mL無菌注射器從吉富羅非魚尾靜脈采血，4 ℃靜置2 h，3 800 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃保存，用于生理生化測定。取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 規(guī)格的肝臟組織固定于4%甲醛溶液，用于組織切片。取約10 g 的肝臟組織于-80 ℃保存，用于生理生化指標(biāo)測定。

1.4 測定方法

1.4.1 肝臟組織切片

肝臟組織在4%多聚甲醛中固定24 h 后，按照乙醇梯度脫水、二甲苯透明組織塊、包埋、切片、脫蠟、染色、分化、切片脫水復(fù)染、封片步驟制作組織切片，用光學(xué)顯微鏡掃描肝臟組織，觀察并記錄特性。

1.4.2 生理生化指標(biāo)的測定

血清生化指標(biāo)采用日立7600 全自動生化分析儀（株式會社日立高新技術(shù)公司）測定，指標(biāo)包括血糖（GLU）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、膽固醇（CHOL）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等。

肝臟樣本解凍后，以生理鹽水1：9體積比進(jìn)行稀釋，獲得肝臟組織勻漿，4 ℃，2 500 r/min離心10 min，仔細(xì)收集上清液，測定丙酮酸激酶（PK，比色法）、脂蛋白脂酶（LPL，比色法）和肝脂酶（HL，比色法）活性；以提取液1：10 體積比進(jìn)行稀釋，獲得肝臟組織勻漿，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，仔細(xì)收集上清液，測定果糖磷酸激酶（PFK，分光光度法）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK，分光光度法）和己糖激酶（HK，分光光度法）活性，具體操作方法及計(jì)算方法參照南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒說明書；以磷酸鹽緩沖液（PBS）1：9 體積比進(jìn)行稀釋，獲得肝臟組織勻漿，4 ℃、2 800 r/min 離心20 min，仔細(xì)收集上清液，測定脂肪酸合成酶（FAS，干粉法），具體操作方法及計(jì)算方法參照南京建成生物工程研究所有限公司Elisa試劑盒說明書。

血清和肝臟過氧化氫酶（CAT，鉬酸銨法）和丙二醛（MDA，硫代巴比妥酸法）活性的測定采用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21 統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析（oneway ANOVA）和Duncan’s 均值多重比較法對試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性進(jìn)行分析處理。先對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若不滿足方差齊性，則采用dunnett-t3檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）”表示，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加蠶豆對吉富羅非魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖1 可知，對照組肝細(xì)胞排列緊密，未見明顯色素巨噬細(xì)胞中心，胰腺細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞未見腫脹。C15 組和C30 組肝細(xì)胞排列緊密，少量肝細(xì)胞胞漿疏松或呈空泡狀（紅色箭頭），胰腺細(xì)胞形態(tài)正常，肝胰臟內(nèi)可見少量色素巨噬細(xì)胞中心（黑色箭頭）。C60 組肝細(xì)胞排列緊密，少量肝細(xì)胞胞漿疏松或呈空泡狀（紅色箭頭），胰腺細(xì)胞形態(tài)正常，肝胰臟內(nèi)可見多處色素巨噬細(xì)胞中心（黑色箭頭）。

圖1 飼料中添加蠶豆對吉富羅非魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響（H.E.染色，200×）

2.2 飼料中添加蠶豆對吉富羅非魚血清糖代謝和脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

由表2可知，與C0組相比，C30組和C60組GLU含量顯著降低（P＜0.05），C60 組TG 含量顯著降低（P＜0.05），HDL-C 含量顯著升高（P＜0.05）。C15、C30組和C60組AST和MDA含量顯著高于C0組（P＜0.05）。各組間ALT、CHOL 和LDL-C 含量無顯著差異（P＞0.05）。C15、C30組和C60組CAT含量顯著低于C0組（P＜0.05）。

表2 飼料中添加蠶豆對吉富羅非魚血清生化指標(biāo)的影響

2.3 飼料中添加蠶豆對羅非魚肝臟糖代謝和脂類代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

2.3.1 飼料中添加蠶豆對羅非魚肝臟糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由表3 可知，與C0 組相比，C15、C30 組和C60 組PK 和HK 活性顯著升高（P＜0.05），C15、C30 組和C60組PEPCK 活性顯著降低（P＜0.05）。各組間PFK 活性無顯著差異（P＞0.05）。

表3 飼料中添加蠶豆對羅非魚肝臟糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.3.2 飼料中添加蠶豆對羅非魚肝臟脂代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

由表4 可知，與C0 組相比，C60 組脂肪酸合成酶和過氧化氫酶活性顯著降低（P＜0.05）。各組間丙二醛含量、脂蛋白脂酶和肝脂酶活性無顯著差異（P＞0.05）。

表4 飼料中添加蠶豆對羅非魚肝臟脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 投喂蠶豆對吉富羅非魚肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

當(dāng)肝臟吸收和利用的能量不均衡時(shí)，TG 會在肝臟內(nèi)蓄積，形成脂肪肝。有研究報(bào)道，變性后的肝臟外觀腫大發(fā)黃，具有油膩感[6，11]，可通過透射電鏡、油紅O 染色和H.E.染色等技術(shù)觀察到蠶豆組草魚肝細(xì)胞明顯腫脹，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯自噬小體、脂滴和空泡。本試驗(yàn)肝臟H.E.染色結(jié)果與上述研究結(jié)果類似，各蠶豆組肝細(xì)胞均出現(xiàn)空泡和巨噬細(xì)胞中心。當(dāng)肝臟發(fā)生損傷后，肝臟中固有的枯否細(xì)胞在大量增殖的同時(shí)，也會募集循環(huán)中的單核細(xì)胞衍生為巨噬細(xì)胞[12]。巨噬細(xì)胞中心的形成表明蠶豆誘導(dǎo)肝臟出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)，并伴隨著一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）等細(xì)胞毒性介質(zhì)的產(chǎn)生[13]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，空泡可能是細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損壞和失去糖原物質(zhì)的肝細(xì)胞、脂滴或是正在溶解的脂滴構(gòu)成[14]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，大量與脂肪代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶在脂滴上表達(dá)，說明細(xì)胞內(nèi)脂滴在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝和平衡起重要作用[5]，空泡的形成可能意味著肝臟脂肪代謝發(fā)生了紊亂。

3.2 投喂蠶豆對吉富羅非魚糖代謝的影響

在糖代謝中，糖酵解和糖異生兩者相互作用，維持著血糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)。調(diào)節(jié)魚類糖酵解的關(guān)鍵酶為HK、PFK、PK、葡萄糖激酶（GK）等，調(diào)節(jié)糖異生的關(guān)鍵酶為PEPCK 、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）等[15]。

魚類對糖的吸收、代謝能力較差，糖的攝入量會直接影響著魚體內(nèi)糖原的合成及肝功能。而羅非魚屬雜食性，對糖的耐受力較高[16-17]。有研究認(rèn)為，糖水平在31%～37%時(shí)，能誘導(dǎo)草魚HK、GK 和PK 等活性的提高[15]。吳宏玉[18]發(fā)現(xiàn)，羅非魚肝臟PFK 活性在攝入20%～40%的淀粉后無顯著變化。陳俊行[19]的研究也表明，淀粉水平在33.8%時(shí)，羅非魚肝臟糖酵解pfkma和gck基因相對表達(dá)量與對照組差異不顯著。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C15（23.5%淀粉水平）、C30 組（25.9%淀粉水平）和C60 組（36.5%淀粉水平）肝臟HK 和PK 活性均高于對照組，血清GLU 含量均低于對照組，說明飼料中添加15%、30%和60%蠶豆均可促進(jìn)羅非魚肝臟糖酵解途徑。一方面可能歸因于蠶豆雖經(jīng)高溫膨化處理，但仍存在較高濃度的多酚類物質(zhì)，下調(diào)了肝臟中葡萄糖分解利用相關(guān)基因的表達(dá)以及糖酵解通路相關(guān)酶的活性[20-21]。另一方面也可能是各蠶豆組不同數(shù)量巨噬細(xì)胞的形成，消耗了葡萄糖，導(dǎo)致C30組和C60組GLU 含量顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，促炎性巨噬細(xì)胞的形成需要以葡萄糖為底物進(jìn)行糖酵解，并會產(chǎn)生NO 和ROS 等細(xì)胞毒性介質(zhì)[22-23]，這也與各蠶豆添加組抗氧化能力的降低和MDA 的升高相符。本試驗(yàn)中，糖異生關(guān)鍵酶PEPCK 活性隨蠶豆添加水平的升高而降低，這與李建[24]、梅玲玉等[25]在斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）、異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）上的結(jié)果類似，蠶豆可能抑制羅非魚肝臟的糖異生途徑。

3.3 投喂蠶豆對吉富羅非魚脂肪代謝的影響

肝臟作為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物代謝與儲存的主要場所，在維持代謝穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。研究表明，HDL-C 能將動脈中的CHOL 轉(zhuǎn)至肝臟，并降低LDL-C 的氧化作用[11]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在等脂的情況下，各蠶豆組血清中HDL-C 活性均高于對照組，TG含量均低于對照組且在C60 組顯著降低。說明經(jīng)膨化處理的蠶豆會誘導(dǎo)加速吉富羅非魚血脂代謝，加快TG 的分解，這可能是蠶豆中的熱穩(wěn)性活性物質(zhì)激活了脂肪酸的β-氧化通路，也可能是C60 組FAS 活性顯著降低所致。FAS 是脂肪酸合成的主要調(diào)節(jié)酶，能夠催化乙酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 生成長鏈脂肪酸[26]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂蠶豆會降低羅非魚肝臟和血清中CAT 活性。這與陳度煌[7]、靳雅琦等[27]的研究結(jié)果一致。CAT 在血紅素的催化下可將H2O2高效地轉(zhuǎn)化為水和氧氣，并清除超氧自由基[28]。血清中AST和ALT 活性可作為評價(jià)肝臟功能和肝臟受損的重要指標(biāo),其活性的升高標(biāo)志著肝細(xì)胞膜受到破壞，肝功能損傷[29-30]。本試驗(yàn)中各蠶豆組AST 活性的升高意味著添加蠶豆誘導(dǎo)肝臟發(fā)生了氧化應(yīng)激，造成了氧化損傷。MDA含量能直接反映組織過氧化水平[31]，添加蠶豆各組血清和肝臟中MDA 含量的升高以及巨噬細(xì)胞中心的形成正好進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

4 結(jié)論

飼料中添加30%和60%的蠶豆顯著提高了吉富羅非魚肝臟的糖酵解能力，添加60%的蠶豆顯著降低了吉富羅非魚肝臟的脂肪代謝能力、血清和肝臟的抗氧化能力，添加15%、30%和60%的蠶豆均會損傷吉富羅非魚的肝臟組織結(jié)構(gòu)。