豬常溫精液活力與密度檢測操作中注意事項(xiàng)

解冰輝，李同川，段曉紅，駱菲，王貴江，羅文學(xué)，馬軍紅，張軍輝

（河北省畜牧良種工作總站，河北石家莊 050061）

為了加快培養(yǎng)和選拔農(nóng)業(yè)行業(yè)高技能人才，河北省每兩年開展一次種豬繁殖職業(yè)技能競賽，大賽有利于進(jìn)一步提高家畜繁殖人員的業(yè)務(wù)素質(zhì)，強(qiáng)化并提升技能，為加快農(nóng)業(yè)農(nóng)村現(xiàn)代化提供有力的人才支撐。 大賽結(jié)合生豬繁殖生產(chǎn)的實(shí)際情況，采取理論知識(shí)考試和現(xiàn)場技能操作考核相結(jié)合的形式，以全國大賽的比賽方案和評(píng)分細(xì)則為標(biāo)準(zhǔn)。 現(xiàn)筆者對(duì)技能考核中豬常溫精液精子活力和密度檢測操作步驟中容易出現(xiàn)的問題進(jìn)行匯總。

1 使用的設(shè)備注意事項(xiàng)

1.1 恒溫加熱臺(tái)

設(shè)置為37℃，打開開關(guān)，只顯示當(dāng)前實(shí)際溫度，按下set 鍵顯示設(shè)定溫度，數(shù)字閃爍，按上下箭頭鍵調(diào)到37℃， 再按下set 鍵進(jìn)入工作狀態(tài)。選手常犯錯(cuò)誤：打開開關(guān)，看到顯示的37℃就不設(shè)置了。 設(shè)置好了37℃，再按下set 鍵后發(fā)現(xiàn)顯示的不是37℃， 以為設(shè)置錯(cuò)了又重新操作耽誤時(shí)間。 忘記再按下set 鍵。

1.2 恒溫水浴鍋

設(shè)置為37℃，打開開關(guān)，顯示屏顯示兩個(gè)溫度，上面的ST：30：00 是設(shè)定溫度（水浴鍋關(guān)閉電源后，設(shè)定溫度自動(dòng)恢復(fù)出廠設(shè)置30℃，不保存上次設(shè)定溫度，所以每次打開開關(guān)就顯示設(shè)定溫度30℃），下面的WD：☆☆是當(dāng)前實(shí)際溫度。直接按箭頭鍵調(diào)到37℃， 每按一下向上箭頭鍵增加1℃，每按一下向下箭頭鍵減少0.1℃，完成溫度設(shè)定后， 按下紅色運(yùn)行鍵進(jìn)入工作狀態(tài)，水浴鍋?zhàn)钌线叺募t色加熱指示燈亮，表明水浴鍋開始加熱，當(dāng)水溫達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，加熱指示燈自動(dòng)滅。 選手常遇問題：不小心設(shè)置成了38℃，需要按向下箭頭鍵10 次， 所以操作要謹(jǐn)慎小心。忘記按下紅色運(yùn)行鍵。 按下運(yùn)行鍵后發(fā)現(xiàn)加熱指示燈不亮以為操作出了問題，實(shí)際上是水溫達(dá)到了37℃。

1.3 溫度計(jì)

溫度計(jì)保持豎直。 溫度計(jì)的玻璃泡全部浸入水中，不要碰到容器底或壁，從立體的角度看玻璃泡應(yīng)放在水中央位置。 讀數(shù)時(shí)溫度計(jì)的玻璃泡要繼續(xù)留在水中，視線應(yīng)與溫度計(jì)水銀面相平。 玻璃泡浸在水中稍候一會(huì)兒，示數(shù)穩(wěn)定后再讀數(shù)。

1.4 顯微鏡

旋轉(zhuǎn)鏡頭轉(zhuǎn)換器， 使低倍物鏡對(duì)準(zhǔn)載物臺(tái)中央的通光孔，當(dāng)聽到“咔噠”聲時(shí)，說明鏡頭位置調(diào)整到位。 將要觀察的樣品先移到通光孔位置，然后眼睛看著物鏡，用粗動(dòng)手輪調(diào)節(jié)載物臺(tái)，緩慢上移近距離接近鏡頭但不要損壞到物鏡，然后慢慢下移載物臺(tái)的過程中看顯示屏，當(dāng)看到顯示屏出現(xiàn)模糊圖像時(shí)，再調(diào)節(jié)細(xì)動(dòng)手輪，直至圖像清晰為止，然后換成高倍物鏡觀察。

比賽使用的顯微鏡， 物鏡有4 倍、10 倍、20倍，先用4 倍物鏡觀察再轉(zhuǎn)換成10 倍物鏡觀察，因?yàn)槭褂昧孙@示屏就不用考慮操作步驟中提到的200 倍了； 接通電源， 在顯微鏡底座上顯示38℃，它代表載物臺(tái)會(huì)自動(dòng)加熱到38℃，廠家設(shè)置好了不需要調(diào)整；顯微鏡最上面的顯示屏開關(guān)是獨(dú)立的， 與顯微鏡開關(guān)沒有關(guān)系。 常犯錯(cuò)誤：裁判助手事先接通電源，打開顯示屏，顯微鏡下面的溫度顯示38℃， 選手到位后看到顯示屏是亮的，溫度也有顯示，就認(rèn)為顯微鏡是打開狀態(tài)。載物臺(tái)上移的時(shí)候看顯示屏， 容易損壞物鏡鏡頭。 接近精液的位置經(jīng)常遇見類似雜質(zhì)的東西，接著移動(dòng)載物臺(tái)就能找到，選手通常以為精子就在這個(gè)位置，上下微調(diào)就是找不到而浪費(fèi)時(shí)間。

1.5 移液器

舉例，取1 毫升精液放入小試管，手握移液器，拇指下壓到第一道阻力時(shí)吸取精液取出的就是1 毫升， 如果再向下壓死取的就大于1 毫升了。 慢慢吸入，吸取精液時(shí)手松開太快就吸不夠1 毫升，因?yàn)槲^的一端太細(xì)，來不及吸入。放入小試管時(shí)，沿側(cè)壁慢慢流入,如果手壓太快精液迅速到達(dá)小試管底部反彈噴出。 移液器吸入精液后不可倒放不可平放，應(yīng)盡快將精液放入小試管，防止精液倒流損壞移液器。 恢復(fù)移液器初始狀態(tài)時(shí)， 調(diào)節(jié)移液器使其內(nèi)部彈簧處于放松狀態(tài)，如果調(diào)反了方向，過了極限從而造成移液器的損壞。

2 關(guān)于精液的搖勻

2.1 打開17℃精液保存箱，取出一瓶常溫精液輕輕搖勻。 如果劇烈搖晃就會(huì)影響精子活力和畸形率，如果不搖勻，瓶內(nèi)不同位置活力和密度會(huì)有差異，影響最終結(jié)果的判斷。

2.2 取2700 微升3%氯化鈉溶液和300 微升精液于小試管混勻，不搖勻，計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確，兩個(gè)計(jì)數(shù)室誤差超過5%則需要重做。 應(yīng)該形成一個(gè)習(xí)慣，只要是精液，拿到手里第一件事就是輕輕搖勻。

3 關(guān)于取樣

保持精液瓶與視線水平， 使其傾斜約45° ,微量移液器吸頭深入液面下15～20 毫米處取樣。多次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，15 毫米處活力和密度是最高的。

4 關(guān)于血球計(jì)數(shù)板

4.1 確定計(jì)數(shù)的5 個(gè)中方格

計(jì)數(shù)板有兩個(gè)計(jì)數(shù)室，每個(gè)計(jì)數(shù)室有9 個(gè)大方格，正中間是計(jì)數(shù)用的大方格，只有這個(gè)大方格由25 個(gè)中方格組成，每個(gè)中方格由16 個(gè)小方格組成，每個(gè)中方格邊緣線是雙線，取左上角-右上角-右下角-左下角-中間5 個(gè)中方格計(jì)數(shù)。

4.2 計(jì)數(shù)

5 個(gè)中方格按照固定順序計(jì)數(shù)，避免丟失一格。計(jì)數(shù)原則：以精子頭部為準(zhǔn)，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。 意思是計(jì)數(shù)時(shí)看頭部在哪，在計(jì)數(shù)的中方格以內(nèi)都計(jì)數(shù)，在邊緣雙線內(nèi)的：在上邊緣雙線和左邊緣雙線內(nèi)計(jì)數(shù)，在下邊緣雙線和右邊緣雙線內(nèi)不計(jì)數(shù)。 如果精子比較多，避免丟數(shù)或重復(fù)計(jì)數(shù)，在每一個(gè)小方格也使用這個(gè)原則。 計(jì)數(shù)另一計(jì)數(shù)室5 個(gè)中方格的精子數(shù)， 并記錄數(shù)據(jù)。

4.3 計(jì)算精子密度

公式：密度=兩個(gè)計(jì)數(shù)室中5 個(gè)中方格總精子數(shù)的平均數(shù)×5×10 （1 立方毫米）×1000 （1 毫升）×10 （稀釋倍數(shù)）=平均數(shù)×50 萬=平均數(shù)×0.005 億=平均數(shù)÷200 億。

解釋：一個(gè)大方格長寬都是1 毫米，高為0.1毫米，體積為0.1 立方毫米。 平均數(shù)×5，為25 個(gè)中方格即一個(gè)大方格的精子數(shù)，即0.1 立方毫米內(nèi)的精子數(shù)，×10 后為1 立方毫米內(nèi)的精子數(shù)，1毫升等于1000 立方毫米，×1000 后為1 毫升的精子數(shù)，這個(gè)時(shí)候的數(shù)據(jù)是精液稀釋后的，所以再×10（稀釋倍數(shù)）后的數(shù)據(jù)為精液每毫升的精子數(shù)。 密度單位：億個(gè)/毫升。

5 活力和密度結(jié)果要求

國標(biāo)規(guī)定，活力小數(shù)點(diǎn)后保留一位，密度小數(shù)點(diǎn)后保留3 位。 原則：四舍六入五成雙，遇見5時(shí)， 舉例活力：65.25 修訂為65.2；65.35 修訂為65.4，去掉5 后末位為雙數(shù)。

6 其他注意事項(xiàng)

6.1 佩戴乳膠手套并消毒。 保持手部干燥，向手套內(nèi)吹一口氣，讓手套充分鼓起再佩戴。 用酒精噴霧對(duì)手消毒，避免噴在操作臺(tái)上。

6.2 載玻片、蓋玻片放到恒溫加熱臺(tái)上預(yù)熱，只預(yù)熱載玻片或蓋玻片或者把蓋玻片放在載玻片上預(yù)熱，都是不對(duì)的，要分開預(yù)熱。

6.3 微量移液器吸取20 微升預(yù)熱好的精液滴于載玻片上，加蓋已預(yù)熱的蓋玻片，并無明顯氣泡。產(chǎn)生氣泡的可能性：加蓋蓋玻片方式不對(duì)，要傾斜著放下蓋玻片；移液器滴出精液后還用力下壓就擠出氣泡了。 有人把載玻片拿起來滴精液，一方面是載玻片離開了加熱臺(tái)影響了精液溫度， 另一方面因?yàn)榫o張手打哆嗦滴不好位置，在恒溫臺(tái)上滴相對(duì)穩(wěn)定一些。

6.4 調(diào)整載物臺(tái)，確定3 個(gè)不同視野，調(diào)整顯微鏡，視野清晰，準(zhǔn)確評(píng)定不同視野下精子活力。精液只有一滴，還被壓成薄薄一層，所以精子死的快，這就要求判斷活力要快，另一方面比賽時(shí)間是有限制的。 常常有選手在此耗費(fèi)時(shí)間，左思量右思量，對(duì)數(shù)據(jù)的判斷猶豫不決。

6.5 取2700 微升3%氯化鈉溶液和300 微升精液于小試管，混勻，吸取20 微升稀釋后的精液置于血蓋片邊緣， 使精液依靠虹吸流入計(jì)數(shù)室，均勻充滿，計(jì)數(shù)室內(nèi)無氣泡。 用同樣方法在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板另一側(cè)計(jì)數(shù)室加樣。 越是精細(xì)的動(dòng)作越容易緊張，左手手肘支在操作臺(tái)上，左手扶住移液器，右手滴精液，盡量避免手顫抖。 操作要穩(wěn)要慢，充滿計(jì)數(shù)室后立刻停止，否則誤差太大。 如果發(fā)現(xiàn)有氣泡，應(yīng)該重新操作此步驟。