重癥肺炎合并呼吸衰竭患者外周血miR-24 表達(dá)與病情及預(yù)后的關(guān)系

高飛 張秀梅 金小樂(lè) 薛乾隆 王慧 張志斌

重癥肺炎的病情發(fā)展迅速、死亡率較高[1-2]。呼吸衰竭是重癥肺炎最常見的合并癥，也是造成重癥肺炎患者死亡的重要因素[3]。因此，研究重癥肺炎合并呼吸衰竭患者病情及預(yù)后的評(píng)價(jià)方式具有積極的臨床意義。目前臨床上評(píng)價(jià)重癥肺炎合并呼吸衰竭患者病情及預(yù)后的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)包括WBC、CRP、降鈣素原（procalcitonin，PCT）等，但是在國(guó)內(nèi)多項(xiàng)重癥肺炎相關(guān)研究中，上述實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與預(yù)后關(guān)系的多因素回歸分析結(jié)果差異較大[3-5]，目前尚缺乏能夠有效預(yù)測(cè)預(yù)后的標(biāo)志物。miRNA 是近年來(lái)備受關(guān)注的一類小分子RNA，能夠分泌進(jìn)入外周血并成為評(píng)價(jià)病情的標(biāo)志分子。兩項(xiàng)急性肺損傷相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-24 在急性肺損傷大鼠的肺組織中表達(dá)減少，而過(guò)表達(dá)miR-24 能夠減輕急性肺損傷大鼠的病理改變及炎癥反應(yīng)[6-7]，提示miR-24 可能在肺部炎癥反應(yīng)的調(diào)控中起重要作用?；诖?，本研究以重癥肺炎合并呼吸衰竭患者為對(duì)象，探討患者外周血miR-24 表達(dá)與病情及預(yù)后的關(guān)系，旨在為發(fā)現(xiàn)新的重癥肺炎合并呼吸衰竭評(píng)價(jià)標(biāo)志物提供臨床證據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018 年10 月至2020 年12 月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的106 例重癥肺炎合并呼吸衰竭患者作為重癥肺炎組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南（2016 年版）》中重癥肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；（2）符合第8 版《內(nèi)科學(xué)》中呼吸衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并肺栓塞、肺部腫瘤、肺不張、肺水腫；（2）肺結(jié)核患者；（3）3 個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗生素、激素。選取同期本院收治的184 例普通肺炎患者作為普通肺炎組，均符合肺炎診斷且不合并呼吸衰竭、未達(dá)到重癥肺炎標(biāo)準(zhǔn)。選取同期在本院體檢的100 名健康志愿者作為對(duì)照組。3 組研究對(duì)象性別、年齡、BMI、吸煙比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：W20180027）。

表1 重癥肺炎組患者miR-24表達(dá)水平與病情評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)性分析

表1 3組研究對(duì)象一般資料比較

1.2 外周血miR-24 表達(dá)水平檢測(cè) 采用熒光定量PCR 法。抽取3 組研究對(duì)象外周靜脈血5 mL，采用北京天根生物公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。首先，采用miRNA 提取分離試劑盒（批號(hào)：DP501，北京天根生化科技有限公司）提取外周靜脈血中的miRNA，而后采用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號(hào)：KR211，北京天根生化科技有限公司）將外周靜脈血miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后采用miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：FP411，北京天根生化科技有限公司）對(duì)cDNA中miR-24 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書配置反應(yīng)體系：cDNA 2 μL、反應(yīng)混合液10 μL、10 μmol/L 上游和下游引物各0.6 μL、去離子水補(bǔ)足體系至20.0 μL。將反應(yīng)體系放入熒光定量PCR 儀（型號(hào)：7500，賽默飛世爾科技公司），設(shè)置反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，而后95 ℃5 s、60 ℃15 s 重復(fù)40 個(gè)循環(huán)，得到循環(huán)曲線和循環(huán)閾值。以U6 為內(nèi)參，根據(jù)2－ΔΔCt法計(jì)算miR-24 表達(dá)水平。

1.3 重癥肺炎病情的評(píng)價(jià)及預(yù)后分組 查閱重癥肺炎患者的病歷，根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)評(píng)估病情：WBC、CRP、PCT、PaO2、PaCO2、pH 值、碳酸氫根（HCO3－）及急性生理學(xué)及慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ）。WBC 采用血常規(guī)儀（型號(hào)：BC-7500，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）檢測(cè)，CRP、PCT 采用全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)：BS-600M，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）檢測(cè)，PaO2、PaCO2、pH 值、HCO3－采用動(dòng)脈血?dú)夥治鰞x（型號(hào)：RAPIDPoint?500e，西門子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司）檢測(cè)，根據(jù)入院后24 h內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)的最差值計(jì)算APACHE Ⅱ評(píng)分。根據(jù)治療結(jié)局將重癥肺炎合并呼吸衰竭患者的預(yù)后分為存活和死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)分析重癥肺炎組患者miR-24 表達(dá)水平與病情評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)性；采用多因素Cox 回歸分析重癥肺炎組患者預(yù)后的影響因素；采用ROC 曲線評(píng)估m(xù)iR-24 表達(dá)水平對(duì)重癥肺炎組患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組研究對(duì)象外周血miR-24 表達(dá)水平比較 重癥肺炎組、普通肺炎組和對(duì)照組外周血miR-24 表達(dá)水平分別為0.70±0.19、0.86±0.25、1.00±0.21，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.060，P＜0.001），其中重癥肺炎組低于普通肺炎組及對(duì)照組（均P＜0.05），普通肺炎組低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.2 重癥肺炎組患者miR-24 表達(dá)水平與病情評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)分析顯示，重癥肺炎組患者miR-24 表達(dá)水平與CRP、PCT、APACHE Ⅱ評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），與PaO2呈正相關(guān)（P＜0.01），與WBC、PaCO2、pH 值、HCO3－均無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05），見表1。

2.3 重癥肺炎組存活與死亡患者病情評(píng)價(jià)指標(biāo)及miR-24 表達(dá)水平比較 重癥肺炎組死亡患者CRP、PCT、APACHE Ⅱ評(píng)分均高于存活患者，PaO2、miR-24 表達(dá)水平均低于存活患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而重癥肺炎組存活與死亡患者WBC、pH 值、PaCO2、HCO3－比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 重癥肺炎組存活與死亡患者病情評(píng)價(jià)指標(biāo)及miR-24表達(dá)水平比較

2.4 重癥肺炎組患者預(yù)后影響因素的多因素分析以重癥肺炎組患者預(yù)后作為因變量（賦值：存活=0、死亡=1），以PCT（連續(xù)變量）、CRP（連續(xù)變量）、PaO2（連續(xù)變量）、miR-24（連續(xù)變量）、APACHE Ⅱ評(píng)分（連續(xù)變量）作為自變量，對(duì)重癥肺炎組患者預(yù)后的影響因素進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示PaO2、APACHEⅡ評(píng)分、miR-24 均是重癥肺炎組患者預(yù)后的影響因素（均P＜0.05），見表3。

表3 重癥肺炎組患者預(yù)后影響因素的多因素分析

2.5 miR-24 表達(dá)水平預(yù)測(cè)重癥肺炎組患者預(yù)后的ROC 曲線分析 ROC 曲線分析顯示，miR-24 表達(dá)水平預(yù)測(cè)重癥肺炎組患者預(yù)后的最佳截?cái)嘀禐?.639，AUC為0.780（95%CI：0.711～0.889），靈敏度和特異度分別為0.659 和0.826，提示miR-24 表達(dá)水平對(duì)重癥肺炎組患者的預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值，見圖1。

圖1 miR-24 表達(dá)水平預(yù)測(cè)重癥肺炎組患者預(yù)后的ROC 曲線

3 討論

重癥肺炎是臨床常見的呼吸系統(tǒng)危重癥，救治難度大、死亡率高[10-12]。國(guó)內(nèi)多項(xiàng)關(guān)于重癥肺炎預(yù)后的研究發(fā)現(xiàn)，重癥肺炎預(yù)后的影響因素復(fù)雜，合并呼吸衰竭、接受機(jī)械通氣、PaO2降低、APACHEⅡ評(píng)分增加、心率加快等均是重癥肺炎患者死亡的危險(xiǎn)因素[3-5]。不同研究中呼吸衰竭及機(jī)械通氣對(duì)重癥肺炎患者預(yù)后影響的分析結(jié)果一致，但關(guān)于其他生命體征、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、評(píng)分等對(duì)重癥肺炎患者預(yù)后影響的回歸分析結(jié)果差異較大[3-5，13-15]，這不僅增加了臨床上評(píng)價(jià)重癥肺炎病情及預(yù)后的難度，也對(duì)尋找評(píng)價(jià)重癥肺炎患者、尤其是重癥肺炎合并呼吸衰竭患者病情及預(yù)后的標(biāo)志物提出了新要求。

miRNA 是近些年備受關(guān)注的一類非編碼小分子RNA，生物學(xué)作用廣泛，參與增殖、凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激等多個(gè)生物學(xué)環(huán)節(jié)的調(diào)控。Wu 等[16]研究顯示重癥肺炎患者外周血中多種miRNAs 表達(dá)改變且對(duì)患者急性呼吸窘迫的發(fā)生具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。miR-24 是在多種組織中發(fā)揮保護(hù)作用的一種miRNA。心腦血管相關(guān)的研究證實(shí)，miR-24 能夠減輕心肌缺血再灌注損傷、七氟醚誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷[17-18]。急性肺損傷相關(guān)的研究證實(shí)，miR-24 在急性肺損傷模型大鼠的肺組織中表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-24 顯著減輕急性肺損傷模型大鼠肺組織的病理改變及炎癥反應(yīng)[6-7]。在上述miR-24 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究分析了重癥肺炎合并呼吸衰竭患者外周血miR-24 表達(dá)的變化并發(fā)現(xiàn)：與普通肺炎患者及健康志愿者比較，重癥肺炎合并呼吸衰竭患者外周血中miR-24 呈低表達(dá)，提示miR-24 低表達(dá)與重癥肺炎合并呼吸衰竭的發(fā)病有關(guān)。

結(jié)合miR-24 在急性肺損傷大鼠中的保護(hù)及抗炎作用進(jìn)行分析，重癥肺炎合并呼吸衰竭發(fā)病過(guò)程中低表達(dá)的miR-24 能夠削弱其保護(hù)及抗炎作用，進(jìn)而造成肺損傷及炎癥反應(yīng)的加劇。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-24在重癥肺炎合并呼吸衰竭發(fā)病過(guò)程中對(duì)病情的影響，本研究進(jìn)行了相關(guān)性分析，選擇WBC、CRP、PCT 3 項(xiàng)指標(biāo)用于評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)程度，PaO2、PaCO2、pH 值、HCO3－4 項(xiàng)指標(biāo)用于評(píng)價(jià)肺泡氧合功能及肺損傷程度，APACHE Ⅱ評(píng)分用于評(píng)價(jià)整體病情，分析結(jié)果顯示：miR-24 與CRP、PCT、APACHE Ⅱ評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，與PaO2呈正相關(guān)，表明重癥肺炎合并呼吸衰竭患者miR-24 的低表達(dá)與炎癥反應(yīng)加劇、肺泡氧合功能減退、整體病情加重有關(guān)，符合miR-24 介導(dǎo)的肺組織保護(hù)及抗炎作用。

本研究對(duì)比了重癥肺炎組死亡與存活患者的miR-24 表達(dá)及病情，并進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PaO2、miR-24、APACHE Ⅱ評(píng)分是重癥肺炎合并呼吸衰竭患者預(yù)后的影響因素。其中PaO2、APACHE Ⅱ影響預(yù)后的分析結(jié)果與國(guó)內(nèi)王新平[19]的研究結(jié)果一致；而miR-24 影響預(yù)后的可能機(jī)制是miR-24 表達(dá)的變化加重了病情。最后，通過(guò)ROC 曲線分析證實(shí)miR-24 表達(dá)水平對(duì)重癥肺炎合并呼吸衰竭患者的預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，本研究結(jié)果表明重癥肺炎合并呼吸衰竭患者外周血miR-24 表達(dá)水平降低與病情加重及預(yù)后惡化有關(guān)，并且miR-24 表達(dá)水平對(duì)患者的預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值。當(dāng)然，本研究也存在一定的不足之處：（1）重癥肺炎組患者較少且均來(lái)自同一中心，會(huì)存在一定的選擇偏倚，今后將開展多中心、大樣本的隨機(jī)對(duì)照研究以獲得更確切的研究結(jié)論；（2）miR-24 不是臨床常規(guī)開展的檢驗(yàn)項(xiàng)目，這無(wú)疑制約了該指標(biāo)的臨床應(yīng)用價(jià)值，待今后檢測(cè)手段進(jìn)步、在臨床推廣后，miR-24有望成為評(píng)估重癥肺炎病情的臨床標(biāo)志物。