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      基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實驗探究益癸方湯防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用及機(jī)制

      2024-04-25 06:27:54單珊王佳晨陳怡潔徐哲昀李伊伊盛祝梅黃飛翔孟麗麗張治芬
      浙江醫(yī)學(xué) 2024年7期
      關(guān)鍵詞:戊酸雌二醇靶點

      單珊 王佳晨 陳怡潔 徐哲昀 李伊伊 盛祝梅 黃飛翔 孟麗麗 張治芬

      骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是以骨量減少和骨微細(xì)結(jié)構(gòu)紊亂為特征的系統(tǒng)代謝性疾病[1],其對老年婦女和絕經(jīng)后婦女的影響尤為嚴(yán)重,大約一半的女性在絕經(jīng)后至少經(jīng)歷過一次骨質(zhì)疏松性骨折[2]。更年期女性隨著卵巢功能的下降,雌激素產(chǎn)生減少,同時卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,F(xiàn)SH)水平增加,導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)的發(fā)生、發(fā)展[3]。目前PMOP 治療仍以口服藥物為主,但長期藥物治療可能會導(dǎo)致耐藥和不良反應(yīng)。而中草藥療法因不良反應(yīng)小易被患者接受。益癸方湯是臨床經(jīng)驗方,本課題組前期研究結(jié)果表明益癸方湯可改善更年期女性圍絕經(jīng)期癥狀,降低FSH 和LDL 水平,提高雌二醇(estradiol,E2)水平[4]。但該方對于骨量保護(hù)是否有作用尚缺乏相關(guān)研究,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和實驗探究該方防治PMOP 的作用及機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

      1 材料和方法

      1.1 實驗動物 8 周齡SPF 級雌性SD 大鼠25 只,體質(zhì)量200~250 g,購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,動物許可證號:SYXK(浙)2021-0012。大鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,室溫22~26 ℃,相對濕度50%~60%,自由進(jìn)食水,12 h 間隔照明。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理與倫理委員會審查通過(批準(zhǔn)文號:IACUC-20221121-15)。

      1.2 藥品、試劑和儀器 益癸方湯組方為枸杞、旱蓮草各10 g,紅景天6 g,阿膠9 g,黃精、當(dāng)歸各10 g,茯苓15 g,黑大豆10 g,丹參、首烏藤各15 g,郁金10 g,由杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院中藥房煎煮,濃縮成100 mL/袋,4 ℃冰箱保存。戊酸雌二醇片(批號:727A,規(guī)格:1 mg/片,拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司);戊巴比妥鈉(批號:57-33-0,杭州馨然公司);HE 染色試劑(批號:G1120、G1821,北京索萊寶公司);EDTA 脫鈣液(批號:BL616B,安徽合肥白鯊公司;4%多聚甲醛(批號:BL539A,安徽合肥白鯊公司);Ⅰ型前膠原N 端前肽(procollagen type ⅠN-terminal propeptide,PINP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase 5b,TR-ACP-5b)、E2、FSH ELISA 試劑盒(批 號:RX302968R、RX300578R、RXJ302812R、RXJ302805R,武漢睿信生物公司);BCA 蛋白濃度測定試劑盒(批號:P0012S,上海碧云天公司);RIPA 裂解液(批號:P0013B,上海碧云天公司);分子量標(biāo)志物Marker(批號:GF6616,上海積福公司);信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、Janus 激酶(janus kinase,JAK)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)抗體(批號:YT4443、YT2424、YT0185,蘇州Immunoway 公司);正置顯微鏡(型號:MoticAE 2000,廈門麥克奧迪);全自動脫水機(jī)(型號:Excelsior AS,美國賽默飛公司);切片機(jī)(型號:Leica RM2255,德國萊卡公司)、包埋機(jī)(型號:Arcadia H,德國萊卡公司)、染色機(jī)(型號:Gemini AS,美國賽默公司)、自動封片機(jī)(型號:ClearVue,美國賽默飛公司);微型計算機(jī)斷層掃描(micro-computed tomography,Micro-CT)儀(型號:skyscan1276,美國bruker 公司);電泳儀(型號:1658001,北京伯樂公司);蛋白掃膜儀(型號:FluorChem Q,美國Proteinsimple 公司)。

      1.3 方法

      1.3.1 藥物活性成分的獲取 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺搜索益癸方所含藥物,設(shè)置口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18,搜索單味中藥相關(guān)的藥物活性成分。對于上述數(shù)據(jù)庫未收錄藥物,通過本草組鑒數(shù)據(jù)庫(http://herb.ac.cn/)及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充。

      1.3.2 活性成分作用靶點的預(yù)測及疾病靶點基因的篩選 在Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中利用Molecule smile 預(yù)測藥物活性成分潛在作用靶點,設(shè)置篩選條件為Probability>0.1。通過GeneCard 數(shù)據(jù)庫(https://www.Genecards.org/)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)、Drugbank 數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)、PGKB數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/)、GenClip 數(shù)據(jù)庫(http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php)、TTD 數(shù)據(jù)庫(https://db.id-rblab.net/ttd/)搜索“絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis)”和“更年期骨質(zhì)疏松癥(menopausal osteoporosis)”相關(guān)基因,其中GeneCard 數(shù)據(jù)庫取score≥1 的靶點。去重并集后導(dǎo)出相關(guān)基因。

      1.3.3 益癸方湯-PMOP 及更年期骨質(zhì)疏松癥靶點網(wǎng)格構(gòu)建和核心靶點篩選 將中藥有效成分潛在作用靶點與疾病相關(guān)靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 中進(jìn)行藥物-疾病靶點網(wǎng)格的構(gòu)建,獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系(protein-protein interactions,PPI),并對該網(wǎng)格進(jìn)行分析,節(jié)點大小與其重要性呈正相關(guān)。將中藥成分潛在作用靶點信息與疾病相關(guān)共有靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 中分析,取度中位數(shù)、接近性中心性中位數(shù)、兩者之間中心性位數(shù),篩選出15 個核心靶點。

      1.3.4 對潛在靶點進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)可視化分析 將藥物作用于疾病的潛在靶點導(dǎo)入Metascape 平臺(https://metascape.org/gp/-index.html#/main/step1),進(jìn)行可視化處理。GO 分析包括生物過程、分子組件、分子功能,采用KEGG 分析信號通路。

      1.3.5 動物模型制備、分組及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組,每組5 只。除假手術(shù)組以外,其余組采用去卵巢手術(shù)法造模[5],假手術(shù)組開腹后切除腹腔內(nèi)黃豆大小一塊脂肪。術(shù)后所有大鼠肌肉注射青霉素3 d,以防感染。觀察各組大鼠精神狀態(tài)及飲食情況,術(shù)后1 個月開始給藥,根據(jù)人與大鼠用藥換算系數(shù),計算出實驗藥物劑量。益癸方湯組給予10 mL/(kg·d)益癸方湯灌胃,戊酸雌二醇組給予0.21 mg/(kg·d)戊酸雌二醇灌胃,益癸方湯+戊酸雌二醇組給予益癸方湯10 mL/(kg·d)+戊酸雌二醇0.21 mg/(kg·d)灌胃,模型組及假手術(shù)組給予10 mL/(kg·d)蒸餾水灌胃,共給藥12 周。最后1次灌胃后,按照0.2 mL/100 g 的劑量注射2%戊巴比妥鈉麻醉后取主動脈血,3 000 r/min,離心15 min,獲得血清保存于-80 ℃冰箱。以頸椎脫臼法處死大鼠,取大鼠左右后肢股骨,左側(cè)股骨置于4%多聚甲醛中常溫固定;右側(cè)股骨置于高溫消毒后EP 管中,-80 ℃冰箱保存。

      1.3.6 股骨組織骨微細(xì)結(jié)構(gòu)檢測 采用Micro-CT 掃描。將完整左側(cè)股骨組織在4%多聚甲醛中固定24~48 h 后取出,進(jìn)行Micro-CT 掃描,獲取股骨平面圖像,配套CTAn、CT vox 軟件進(jìn)行骨微細(xì)結(jié)構(gòu)分析,軟件分析時在Micro-CT 掃描成像圖上選擇股骨遠(yuǎn)端作為感興趣區(qū)域,包括骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/tissue volume,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁間隔(trabecular separation,Tb.Sp)。

      1.3.7 骨組織病理變化情況觀察 采用HE 染色。左側(cè)股骨組織Micro-CT 掃描完畢后,置于EDTA 脫鈣液中,每周更換1 次液體,2 個月后脫鈣完全后用流動雙蒸水沖洗2 h 以上,依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、HE染色及封片,正置顯微鏡下觀察骨組織病理變化。

      1.3.8 血清PINP、TRACP-5b、E2、FSH 水平檢測 采用ELISA 法。嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清PINP、TRACP-5b、E2、FSH 水平。

      1.3.9 股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。將右側(cè)股骨組織剪成綠豆大小,液氮下研磨,加入適量裂解液,冰上裂解30 min,再放入組織研磨器中研磨,4 ℃12 000 r/min,離心15 min,收集上清液。BCA 法測定蛋白濃度,計算20 μg 的總蛋白進(jìn)行上樣,電泳儀將凝膠膜上蛋白轉(zhuǎn)移至纖維膜上,配制5%脫脂牛奶封閉1 h,洗膜3 次,將對應(yīng)目的蛋白和內(nèi)參條帶放于STAT3、JAK、Akt、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗中4 ℃搖床上孵育過夜,次日吸掉一抗,洗膜3 次,加入二抗,室溫?fù)u床上孵育1 h,洗膜3 次,加入顯影劑進(jìn)行顯影攝片。使用Image J 軟件對顯影圖像進(jìn)行灰度值分析。

      1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSDt檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計意義。

      2 結(jié)果

      2.1 益癸方湯防治PMOP 及更年期骨質(zhì)疏松癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

      2.1.1 益癸方湯活性成分及相應(yīng)靶點獲取 益癸方湯中含有157 種有效活性成分,319 個靶點,主要活性成分有槲皮素、木犀草素、丹參酮、柚皮素、谷甾醇等,見圖1(插頁)。

      圖1 益癸方湯活性成分和PMOP 靶點

      2.1.2 益癸方湯靶點基因的預(yù)測及PMOP、更年期骨質(zhì)疏松癥靶點基因的篩選 利用數(shù)據(jù)庫篩選出更年期骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點1 405 個,PMOP 相關(guān)靶點1 199 個,兩者并集靶點去重后為1 775 個。

      2.1.3 益癸方湯有效成分和PMOP 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.7.1 構(gòu)建獲得活性成分與疾病共有靶點145 個,核心靶點包括絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、Akt1、IL-1β、TNF、TP53 等,見圖2。

      圖2 15 個核心靶點

      2.1.4 GO 和KEGG 分析結(jié)果 GO 與KEGG 分析結(jié)果顯示,生物過程涉及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對激素的反應(yīng)、對肽類的反應(yīng)、細(xì)胞對有機(jī)氮化合物反應(yīng)等,分子組件涉及受體、質(zhì)膜、囊腔等,分子功能涉及氧化還原酶活性、核受體活性、配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性等,可能作用途徑有癌癥途徑、高級糖基化終末產(chǎn)物-受體信號通路、磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3,PI3K)/Akt 信號通路、MAPK 信號通路等。

      2.2 實驗結(jié)果

      2.2.1 各組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比較 各組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=79.568、9.070、10.368、11.256,均P<0.001)。與假手術(shù)組比較,模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N 均下降,Tb.Sp 均增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與模型組比較,益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th 均增加;戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織Tb.N 均增加,Tb.Sp 均下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),見圖3。從Micro-CT 二維圖和三維圖可見,與模型組比較,益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織Tb.N 增多、致密,見圖4。

      圖3 各組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp 比較(A:BV/TV 比較;B:Tb.Th 比較;C:Tb.N 比較;D:Tb.Sp 比較)

      圖4 各組大鼠股骨Micro-CT 二維圖、三維圖

      2.2.2 各組大鼠股骨組織病理變化情況比較 與假手術(shù)組比較,模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中骨小梁減少、變細(xì);與模型組比較,益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中骨小梁增加、變粗,見圖5。

      圖5 各組大鼠股骨組織HE 染色圖(A:假手術(shù)組;B:模型組;C:益癸方湯組;D:戊酸雌二醇組;E:益癸方湯+戊酸雌二醇組)

      2.2.3 各組大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比較 各組大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.242、9.508,均P<0.001)。與假手術(shù)組比較,模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清PINP 水平均降低,模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組大鼠血清TRACP-5b 水平均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較,益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清PINP 水平均升高,戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清TRACP-5b 水平均降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),見圖6。

      圖6 各組大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比較(A:PINP 水平比較;B:TRACP-5b 水平比較)

      2.2.4 各組大鼠血清E2、FSH 比較 各組大鼠血清E2、FSH 水平比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=51.258、53.867,均P<0.001)。與假手術(shù)組比較,模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清E2水平均降低,F(xiàn)SH 水平均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較,益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組E2水平均升高,F(xiàn)SH 水平均降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),見圖7。

      圖7 各組大鼠血清E2、FSH 水平比較(A:E2水平比較;B:FSH水平比較)

      2.2.5 各組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平比較 各組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8 021.218、1 580.567、1 744.77,均P<0.001)。與假手術(shù)組比較,模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較,益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平均降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),見圖8。

      圖8 各組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達(dá)水平比較(A:蛋白表達(dá)的電泳圖;B:STAT3 蛋白表達(dá)水平比較;C:JAK 蛋白表達(dá)水平比較;D:Akt 蛋白表達(dá)水平比較)

      3 討論

      本研究通過實驗探究益癸方湯對去卵巢大鼠模型的骨量保護(hù)作用,結(jié)果顯示該方劑可提高大鼠體內(nèi)E2水平、降低FSH 水平,骨代謝指標(biāo)中PINP 升高、TRACP-5b 降低,以及股骨微細(xì)結(jié)構(gòu)骨量改善,驗證該方劑可預(yù)防去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松,在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基礎(chǔ)上篩選出STAT3、JAK、Akt 靶點,通過實驗進(jìn)一步驗證了益癸方湯的作用機(jī)制可能通過下調(diào)STAT3、JAK、Akt 蛋白的表達(dá)發(fā)揮作用。

      PMOP 的發(fā)生與女性雌激素水平下降有關(guān),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析益癸方湯中可能含有槲皮素、木犀草素、丹參酮、柚皮素、谷甾醇等多種化合物。已有研究證實口服槲皮素能夠部分逆轉(zhuǎn)動物模型中的骨質(zhì)減少,其可能通過抗氧化、抗炎、促進(jìn)成骨細(xì)胞、抑制破骨細(xì)胞發(fā)揮作用[6]。Kim 等[7]研究表明木犀草素顯著降低了骨髓單核細(xì)胞和Raw264.7 細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化,還抑制分化破骨細(xì)胞的骨吸收活性。也有研究證明丹參酮ⅡA 沒有改變NF-κB 受體激活劑或巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體的表達(dá),而是可能抑制NF-κB 受體激活劑配體誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化[8]。本研究篩選出MAPK3、Akt1、TNF、IL-1β、TP53 等靶點,結(jié)合KEGG 通路分析,尋找到Akt 靶點和PI3K/Akt 信號通路相關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn),與模型組比較,益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中JAK、STAT3、Akt 表達(dá)水平均降低,提示益癸方湯可能通過該通路影響骨量作用。PI3K/Akt 信號通路通過介導(dǎo)生長因子信號傳導(dǎo)到有機(jī)過程和關(guān)鍵細(xì)胞過程,如葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞增殖和存活[9]。細(xì)胞對雌激素的反應(yīng)由雌激素受體與雌激素反應(yīng)元件的結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活等非核作用介導(dǎo),雌激素還和PI3K/Akt 信號通路有關(guān),數(shù)據(jù)表明17-E2可通過非核作用激活子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中的PI3K/Akt 信號通路[10]。PI3K/Akt 通路還影響了氧化應(yīng)激過程,促進(jìn)氧化損傷后細(xì)胞存活中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。JAK/STAT 途徑是細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的最重要途徑之一,它不僅參與炎癥,還與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[12]。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)JAK/STAT 通路被激活時,可以進(jìn)一步激活MAPK 和Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 信號傳導(dǎo)并促進(jìn)成骨分化[13]。一些黃酮類化合物可以發(fā)揮成骨分化作用,如槲皮素可作用于Akt1 靶點,并通過激活PI3K/Akt 信號通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[14]。

      綜上所述,益癸方湯中的槲皮素、木犀草素、丹參酮、柚皮素、谷甾醇等多種有效成分可能通過作用于PI3K/Akt、JAK/STAT 信號通路防治PMOP,為中草藥防治POMP 增加了理論基礎(chǔ)。

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