電場對卷莢相思種子萌發(fā)和生理生化的影響

朱夢恬，江瑞熠，李秉鈞，鄧智文，榮俊冬，鄭郁善，陳禮光

（福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院, 福建 福州 350002）

電場處理種子作為一項物理技術(shù)應(yīng)用在農(nóng)林業(yè)，具有方法簡便、省時有效、低耗無污染等特點。現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中[1]，電場處理技術(shù)在生物效應(yīng)、靜電選種、農(nóng)業(yè)育種、物理抑菌等領(lǐng)域已經(jīng)取得了豐碩的成果[2-4]，極大地提高了現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)的生產(chǎn)效率。揭示電場對種子萌發(fā)的特性能夠了解植物種子萌發(fā)的驅(qū)動因素[5]，目前針對電場處理種子萌發(fā)特性已有多項研究，Huang 等[6]將黃瓜(Cucumis sativus)種子吸脹后放入電場處理，發(fā)現(xiàn)黃瓜種子的發(fā)芽率提高。將番茄(Solanum lycopersicum)[7]、水稻(Oryza sativa)[8]、大豆(Glycine max)[9-10]、黃瓜[11-12]等農(nóng)作物種子電場處理，發(fā)現(xiàn)對種子萌發(fā)特性和活力、苗木長勢、植株生長發(fā)育性狀及生產(chǎn)效率普遍具有一定的正向影響。通過電場處理有利于植物種子體內(nèi)三磷酸腺苷的合成、酶活性的變化，并且促進種子抗逆性和萌發(fā)能力的提高，減輕脅迫對種子發(fā)育產(chǎn)生的影響[13-17]。

卷莢相思(Acacia cincinnata)是豆科金合歡屬植物，常綠喬木，主要作為沿海沙地綠化造林的先鋒樹種，原產(chǎn)于印度尼西亞東部、澳大利亞昆士蘭沿海和巴布亞新幾內(nèi)亞南部等地[18]，20 世紀70 年代引種入我國，我國的人工栽培主要分布在廣東、福建、云南、廣西、海南等地[19]，具有適生性強、速生豐產(chǎn)、材質(zhì)優(yōu)良、根瘤固氮等特點[20-21]。已有研究表明，金合歡屬(Acacia)植物均具有較強的抗脅迫能力，如馬占相思(A.mangium)、大葉相思(A.auriculiformis)、臺灣相思(A.confusa)等[22-23]。黃斌龍等[24]研究了不同輕型基質(zhì)對卷莢相思(A.cincinnata)容器苗生長的影響，研究發(fā)現(xiàn)用60%泥炭土 + 40%鋸屑作為卷莢相思容器育苗的基質(zhì)其生長表現(xiàn)良好，為生長促進型，是最理想的輕型基質(zhì)配方；路媛媛等[25]研究了高壓靜電場介導(dǎo)對番茄種子萌發(fā)特性及α-淀粉酶活性的影響，結(jié)果表明，靜電場處理可以促進番茄種子的萌發(fā)，且在6.0 kV·cm-1下番茄種子的萌發(fā)特性、根和芽的生長以及α-淀粉酶活性具有顯著的提高。但同屬的卷莢相思種子在電場處理下萌發(fā)和生理生化特性尚未有研究。因此，本研究將通過電場處理卷莢相思種子進行萌發(fā)，測定卷莢相思種子萌發(fā)的相關(guān)指標以及其種子抗氧化酶活性和抗性指標，分析不同電場強度處理下卷莢相思種子的萌發(fā)及生理特性差異，探究種子在電場處理下的萌發(fā)趨勢，明確種子萌發(fā)最佳電場強度，為卷莢相思種子的萌發(fā)和培育研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設(shè)備

試驗選用的卷莢相思種子采集于福建省漳浦中西國有林場，晾曬后選取顆粒飽滿的種子于2022年3 月進行萌發(fā)試驗。試驗所用電源發(fā)射器設(shè)備為波爾高壓電源73030P 電場裝置，該設(shè)備主要由電場發(fā)生器、金屬片、絕緣塑料棒組成。通過電場發(fā)生器將頻率50 Hz 的220 V 交流電場轉(zhuǎn)變?yōu)橹绷鞲邏?，將種子置于兩個金屬片中間，形成一個回路并產(chǎn)生穩(wěn)定的正向電場。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置電場強度為0 (CK)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 kV·cm-1，處理時間為60 min，試驗共設(shè)置6 個處理，在不同電場強度處理下共設(shè)置3 個重復(fù)。電場的參數(shù)取值范圍在0～1.0 kV，板間距離50 mm，每個處理挑選飽滿、大小相近的50 粒種子，均勻鋪灑在金屬片上。試驗采用紙上培養(yǎng)法進行種子萌發(fā)試驗，在人工氣候箱中進行，設(shè)置恒溫為25 ℃，濕度為70%，光照采用晝夜各12 h，試驗前使用將卷莢相思種子用15% HCHO 進行消毒，然后用蒸餾水清洗數(shù)遍，最后用80 ℃熱水浸泡24 h，第2 天將種子置于電場中進行處理，然后放入培養(yǎng)皿中。種子萌發(fā)后突破種子1 cm 時，每個測定指標稱取0.1 g，液氮速凍后放置-80 ℃冰箱儲存待測酶活性。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標

將種子經(jīng)過電場處理后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每日記錄萌發(fā)種子數(shù)(以胚根突破種皮2 mm 作為萌發(fā)標準)，卷莢相思種子在第3 天開始萌發(fā)并于12 d 后結(jié)束發(fā)芽，分別計算發(fā)芽率(germination percentage，GP)、發(fā)芽勢(germination)和發(fā)芽指數(shù)(germination index, GI)。公式如下[26]：

發(fā) 芽 率 = (供 試 種 子 發(fā) 芽 數(shù)/供 試 播 種 數(shù)) ×100%；

發(fā)芽勢 = (規(guī)定時間內(nèi)供試播種的發(fā)芽數(shù)/供試播種數(shù)) × 100%；∑

發(fā)芽指數(shù) =Gt/Dt；

式中：Gt為當天的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)。

1.3.2 抗性指標測定

相對電導(dǎo)率(relative electrical)采用電導(dǎo)儀法[27]測定。丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量使用硫代巴比妥酸法[28]測定，分別記錄532、600、450 nm處的吸光度OD 值，計算丙二醛的含量。

1.3.3 酶活性測定

過氧化物酶(peroxidase, POD)活性使用愈創(chuàng)木酚法[28]測定，記錄470 nm 處的吸光度OD 值，計算過氧化物酶的活性。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性使用氮藍四唑(NBT)還原法[28]測定，記錄560 nm處的吸光度OD 值，計算超氧化物歧化酶的活性。

過氧化氫酶(catalase, CAT)活性使用紫外吸收法[28]測定，記錄240 nm 處的吸光度OD 值，計算過氧化氫酶的活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 對所測數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用平均值 ±標準誤表示測定結(jié)果，為了驗證數(shù)據(jù)是否滿足條件，對其進行KS 檢驗，若原始數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，對原始數(shù)據(jù)進行10 作底數(shù)的lg (x+ 1)對數(shù)轉(zhuǎn)換，保證數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布。最后分別對同一時間不同電場處理進行單因素方差分析，并用Duncan 法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較。采用Origin 2022 和Excel軟件作圖。結(jié)構(gòu)方程模型在軟件AMOS 26.0 中實現(xiàn)，通過SEM 研究分析抗氧化酶活性、MDA 含量及相對電導(dǎo)率對種子萌發(fā)特性的影響路徑及范圍，采用極大似然估計法對模型進行擬合。本研究中，χ2/df＜ 2、P＞ 0.05、GFI ＞ 0.9 時，模型擬合良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同電場強度處理對卷莢相思種子萌發(fā)的影響

卷莢相思種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)隨著電場的增強呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，在0.6 kV·cm-1下 均 達 到 最 大(表1)。發(fā) 芽 率 在1.0 kV·cm-1時 顯 著 低 于CK (P＜ 0.05)，其 他 處 理 與CK 無顯著差異(P＞ 0.05)；發(fā)芽勢在0.4、0.6、0.8、1.0 kV·cm-1下與CK 有顯著差異(P＜ 0.05)；發(fā)芽指數(shù)在0.6 kV·cm-1下顯著高于CK (P＜ 0.05)，其他處理與CK 無顯著差異(P＞ 0.05)。

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)(表1)，發(fā)芽率指標建立卷莢相思種子回歸方程：Y= 65.460 63 - 189.803X13+ 226.959 3X12-53.029 5X1，R2= 0.981 (圖1)；該回歸方程P值為0.028 3(P＜ 0.05)；當電場在0.65 kV·cm-1時，即發(fā)芽率可以達到最大值(74.76%)，與CK 相比提高了13.27%。

圖1 不同電場強度處理對卷莢相思種子發(fā)芽率的模型擬合Figure 1 Model fitting of different electric field strength treatments on the germination rate of Acacia cincinnata seeds

2.2 不同電場強度處理對卷莢相思種子酶活性和抗性的影響

2.2.1 電場強度處理對卷莢相思種子抗性的影響

相對電導(dǎo)率隨著電場強度的增加呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢(圖2)。與CK 相比，0.2 kV·cm-1處理相對電導(dǎo)率上升了2.87%，0.6、0.8、1.0 kV·cm-1處理的相對電導(dǎo)率顯著低于CK (P＜ 0.05)，且0.8 kV·cm-1處理與CK 相比顯著降低41.30%。

圖2 不同電場強度處理對卷莢相思種子抗性的影響Figure 2 Effects of different electric field strength treatments on the resistance of Acacia cincinnata seeds

卷莢相思種子在不同強度電場處理下，0.2 kV·cm-1處理的MDA 含量相比CK 增加了11.38%，其他4 個處理的MDA 含量相比CK 分別降低了7.84%、20.65%、12.73%、2.85%。各處理MDA 含量隨電場強度的增加呈現(xiàn)先升后降再升的趨勢，且0.6 kV·cm-1處理的MDA 含量最低，顯著低于CK (P＜ 0.05) (圖2)。

2.2.2 電場強度處理對卷莢相思種子萌發(fā)期抗氧化酶活性的影響

適宜的電場處理明顯提高了卷莢相思種子POD 的活性，與CK 相比呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖3)。0.8 和1.0 kV·cm-1處 理 相 比 于CK 降 低 了0.29%和24.95%，且與CK 相比無顯著差異(P＞0.05)；其余各處理均顯著高于CK (P＜ 0.05)，其中在0.6 kV·cm-1處 理 下POD 活 性 增 幅 最 高，達 到65.72%。

圖3 不同電場強度處理對卷莢相思種子抗氧化酶活性的影響Figure 3 Effects of different electric field strength treatments on antioxidant enzyme activities of Acacia cincinnata seeds

卷莢相思種子CAT 活性隨著電場強度增加表現(xiàn)出先降后升再降的趨勢(圖3)。0.6 和0.8 kV·cm-1處理均顯著高于CK，且比CK 提高了75.66%和42.22% (P＜ 0.05)，但0.2、0.4、1.0 kV·cm-1處 理 與CK 無顯著差異(P＞ 0.05)，且0.2 kV·cm-1處理低于CK。

不同強度電場處理下，卷莢相思種子SOD 活性呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(圖3)。0.2、0.4、0.6、0.8 kV·cm-1處理均不同程度地高于CK，分別提高了0.68%、23.19%、50.54%、14.28%。且在0.4 和0.6 kV·cm-1處理時與CK 間差異顯著(P＜ 0.05)；同時，在0.2、0.8、1.0 kV·cm-1處 理 下 種 子SOD 活 性 與CK 相比無顯著差異(P＞ 0.05)。這表明隨著電場強度提高，卷莢相思種子在特定條件下SOD 活性提高，但是達到一定閾值后會抑制SOD活性。

2.3 不同電場強度處理對卷莢相思種子發(fā)芽率的直接和間接影響

結(jié)構(gòu)方程模型是一種構(gòu)建、預(yù)測和驗證因果關(guān)系模型的主要方法，可以清晰描述單項指標對總體結(jié)構(gòu)的作用以及單項指標間的相互聯(lián)系。本研究中模型的適配度測試結(jié)果顯示，χ2/df的值為0.949，P=0.486，CFI 為1.000，表明構(gòu)建的結(jié)構(gòu)方程模型與參數(shù)的適配度較好，模型擬合基本理想。

結(jié)構(gòu)模型(圖4)顯示電場處理對POD 酶和相對電導(dǎo)率指數(shù)有極顯著的影響(P＜ 0.001)；但對SOD并未達到顯著影響(P＞ 0.05)。相對電導(dǎo)率對MDA具有極顯著的正效應(yīng)(P＜ 0.01)，路徑系數(shù)為0.53；但是MDA 對CAT 酶具有極顯著的負效應(yīng)(P＜ 0.01)，路徑系數(shù)為0.48。其中SOD 對CAT 產(chǎn)生極顯著的正效應(yīng)(P＜ 0.001)，路徑系數(shù)達到0.64，且CAT 對POD也具有極顯著的正效應(yīng)(P＜ 0.001)，路徑系數(shù)達到0.76。CAT 和SOD 對發(fā)芽率具有正效應(yīng)，且CAT 對發(fā)芽率具有極顯著影響(P＜ 0.01)；路徑系數(shù)達到0.80；但是MDA 和POD 對發(fā)芽率具有顯著和極顯著的負效應(yīng)影響，路徑系數(shù)分別為-0.44 和-0.60。

圖4 電場處理卷莢相思種子各影響因素的結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)分析Figure 4 Structural equation model (SEM) analysis of the influencing factors of Acacia cincinnata seeds administered an electrical current

3 討論與結(jié)論

發(fā)芽勢能夠反映種子品質(zhì)優(yōu)劣及其生命力，發(fā)芽率是檢測種子質(zhì)量的重要指標之一，發(fā)芽指數(shù)是反映種子活力的指標[29]。本研究表明，電場強度不同，對種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均產(chǎn)生不同程度的影響，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)隨著電場強度的增強呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，在0.6 kV·cm-1時發(fā)芽率最高，且發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)顯著高于CK(P＜ 0.05)，這可能是電場誘導(dǎo)可減少種子生理損傷、適當提高種子的呼吸速度與吸收能力，提高種子萌發(fā)能力[3]。從結(jié)構(gòu)方程模型中發(fā)現(xiàn)MDA 和POD 對發(fā)芽率具有顯著的負效應(yīng)影響，從結(jié)構(gòu)方程模型中發(fā)現(xiàn)MDA、POD 和SOD 對發(fā)芽率具有極顯著的負效應(yīng)影響(P＞ 0.01)。黃洪云等[30]研究發(fā)現(xiàn)適宜的電場處理會促進番茄(Solanum lycopersicum)種子的萌發(fā)。且國外研究發(fā)現(xiàn)適宜的電場處理植物，有利于種子的萌發(fā)，且具有更強的抗逆能力，并增強其穩(wěn)定性[31-32]。本研究也發(fā)現(xiàn)適宜電場處理能刺激卷莢相思種子內(nèi)部的活性物質(zhì)，并有效促進種子萌發(fā)。

酶活性通過改變植物體內(nèi)現(xiàn)成的酶分子活性來調(diào)節(jié)其新陳代謝。本研究中POD 和SOD活性隨著電場強度的增強呈現(xiàn)先升后降的趨勢，而CAT 活性隨著電場強度的增強呈現(xiàn)先下降再上升最后下降的趨勢，說明適宜的電場處理能夠使卷莢相思種子在特定條件下提高酶活性并保證營養(yǎng)快速而充分的進入胚中[33]，且電場處理對卷莢相思種子的生理生化指標既能促進也產(chǎn)生阻礙，這取決于電場強度。由結(jié)構(gòu)方程模型可以發(fā)現(xiàn)電場處理種子極顯著地影響POD 活性(P＜ 0.001)，且SOD 對CAT 的調(diào)控具有顯著效果(P＜ 0.001)，而POD 和CAT 之間也產(chǎn)生了極顯著的影響(P＜ 0.001)。胡建芳等[34]研究發(fā)現(xiàn)高粱(Sorghum bicolor)種子通過電場處理萌發(fā)時期酶活性增強，而抗氧化酶之間具有協(xié)同作用。楊生等[35]研究也發(fā)現(xiàn)檸條(Caragan korshinskii)種子經(jīng)過電場處理后POD 活性有一定量的增加。這可能是因為種子在電場處理時，電場強度提高了種子的呼吸速率和營養(yǎng)元素的吸收，導(dǎo)致鈣離子(Ca2+)濃度發(fā)生變化，適量Ca2+使酶活性有一定量的增強[36]。在電場閾值內(nèi)，活性氧在細胞內(nèi)逐漸減少，細胞膜受到保護，功能得到提高，抗氧化酶合成受到激活，表達活性提高[37]。與此同時，抗氧化酶的反應(yīng)需要H2O2進行催化，且有足夠的電子進入植物體內(nèi)，POD 活性在低濃度H2O2下也可以發(fā)揮超過自身的高效催化作用[38]。

相對電導(dǎo)率是衡量細胞膜透性的重要指標，其值越大，表示電解質(zhì)的滲透量越多，細胞膜受到的傷害越大。而MDA 是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，其含量升高，引起膜系統(tǒng)損傷，進而影響細胞膜透性?；钚匝踹^量會導(dǎo)致膜脂過氧化產(chǎn)生MDA，同時會使細胞膜透性增強，對相對電導(dǎo)率具有一定影響，二者相輔相成。本研究也發(fā)現(xiàn)在適宜的電場強度下，相對電導(dǎo)率和MDA 含量有不同程度的下降，且在適宜的電場處理下能夠有效地改善卷莢相思種子細胞代謝強度的變化，有利于種子的萌發(fā)[39]。陳花等[40]研究也認為適宜的電場，提升了種子細胞內(nèi)的正常代謝反應(yīng)，保護了細胞膜的結(jié)構(gòu)。Janositz和Knorr[41]研究發(fā)現(xiàn)，煙葉細胞對不同的電場強度有不同的反應(yīng)，過高的電場會擊穿細胞壁，導(dǎo)致原生質(zhì)體收縮、體內(nèi)細胞破裂。電場處理種子可能使Ca2+的濃度產(chǎn)生變化，調(diào)節(jié)了種子內(nèi)部的生理作用，從而提高細胞膜穩(wěn)定性，因此減少了膜脂化產(chǎn)物MDA 的含量，從而維護了細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[42-43]。結(jié)構(gòu)方程模型顯示電場處理對相對電導(dǎo)率具有極顯著的負效應(yīng)影響(P＜ 0.001)，且相對電導(dǎo)率對MDA也有顯著的影響(P＜ 0.01)，這說明電場處理對種子會有促進的作用，電場處理可以使種子內(nèi)部電解質(zhì)的滲透量減少，細胞膜受傷害的程度降低，不會形成過量的活性氧而產(chǎn)生膜脂過氧化，使相對電導(dǎo)率和MDA 含量降低[44-46]。

綜上所述，不同電場處理下，在適宜的電場強度下卷莢相思種子的萌發(fā)效果有大幅度的提高，并且可有效降低MDA 和相對電導(dǎo)率含量，促進酶的活性，改變植物的新陳代謝，影響到植物種子吸水快慢和呼吸強弱，最終提高種子的萌發(fā)效率。因此，在使用電場處理植物種子時，應(yīng)提前分析電場處理下對種子的最優(yōu)區(qū)間，根據(jù)種子萌發(fā)對電場耐受程度來采取相應(yīng)措施，進一步優(yōu)化處理參數(shù)。電場處理對卷莢相思種子及后期生長過程的影響機制還有待進一步深入研究。