甲亢患者血清miR-133a水平變化與甲狀腺激素及脂質(zhì)代謝的關(guān)聯(lián)性研究

黃寶樂, 吳 峰, 岳 悅, 鄭桂玲

甲狀腺功能亢進(jìn)(簡稱甲亢)是一種病理綜合征,其特征是循環(huán)甲狀腺激素(thyroid hormone,TH)水平升高[1]。除了與TH水平升高直接相關(guān)的典型臨床癥狀,如靜息能量消耗增高、體重減輕外,甲亢患者還可能伴有脂質(zhì)代謝紊亂[2]。越來越多的研究表明TH在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中起重要作用[3],但其具體機(jī)制尚未完全闡明。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一類小的非編碼單鏈RNA分子,含有22～25個(gè)核苷酸,能夠結(jié)合到其靶mRNA的3′非翻譯區(qū),導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA降解[4]。全基因組miRNA-mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)也揭示了TH對幼鼠肝臟miRNA具有潛在的調(diào)節(jié)作用[5]。在甲狀腺機(jī)能減退小鼠的肝臟中,可觀察到miR-133a表達(dá)顯著增加,而在甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)小鼠肝臟,其表達(dá)水平下調(diào)[6]。有研究顯示,miR-133a參與膽固醇合成和肝臟脂質(zhì)代謝[7]。鑒于TH和miR-133a都參與調(diào)節(jié)能量消耗和脂質(zhì)代謝,筆者推測miR-133a可能在TH調(diào)節(jié)的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮一定的作用。據(jù)此,本研究分析了甲亢患者在甲巰咪唑治療前后血清miR-133a水平變化及其與TH和脂質(zhì)代謝的關(guān)聯(lián)性,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象 招募2020年10月至2022年8月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八三醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的新發(fā)顯性甲亢患者100例(甲亢組),其中男28例,女72例,年齡18～69(40.53±11.06)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有典型的臨床癥狀,血清TH水平升高,促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)水平降低,TSH受體抗體(TSH receptor antibody,TRAb)水平升高或正常,符合顯性甲亢的診斷[8];(2)臨床資料完整;(3)入院前未接受甲亢相關(guān)治療。其中28例甲亢患者在入組后接受了2個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)甲巰咪唑治療(20 mg/片,1片/次,1次/d)。另招募同期健康體檢者100名作為對照組。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<18歲;(2)體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)>30.0 kg/m2;(3)合并已知的心血管疾病、腫瘤、糖尿病、高血壓和腎損害(血清肌酐：男性>133 μmol/L,女性>106 μmol/L);(4)服用已知影響TH代謝的藥物;(5)吸煙。本研究獲中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)[批號：倫審辦2020第(54)號],研究對象簽署知情同意書。

1.2生化指標(biāo)檢測 入院后在治療前采集靜脈血5 mL,4 ℃下以1 500 r/min離心10 min,分離血清。小心地將上清液轉(zhuǎn)移到無RNase/DNA酶的冷凍瓶中,-80 ℃保存?zhèn)錂z。采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine,FT4)和TSH水平,試劑盒購自瑞士Roche Diagnostics公司。采用比色酶法測定總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、總膽紅素(total bilirubin,TBIL)和直接膽紅素(direct bilirubin,DBIL)水平。上述指標(biāo)均通過奧林巴斯AU640自動生化分析儀(日本東京奧林巴斯公司)進(jìn)行檢測。

1.3血清miR-133a水平檢測 通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法進(jìn)行檢測。使用QIAzol試劑(美國Applied Biosystems公司)提取800 μL血清總RNA,并通過miRNeasy-血清試劑盒(美國Applied Biosystems公司)進(jìn)行分離和純化。應(yīng)用特異性TaqMan miRNA分析試劑盒(美國Applied Biosystems公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。采用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測血清miR-133a水平。反應(yīng)體系：5 μL miRcute Plus miRNA PreMix,上游和下游引物各0.2 μL,2.6 μL ddH2O。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,40個(gè)循環(huán)(94 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min)。所用引物序列見表1。以U6為內(nèi)參,通過2-ΔΔCT法計(jì)算miR-133a的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1兩組一般臨床資料比較 與對照組相比,甲亢組FT4、FT3、TRAb、舒張壓、ALT、TBIL和DBIL水平較高,BMI、腰圍、TC、TG、LDL-C、TSH水平較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組一般臨床資料比較

2.2兩組血清miR-133a水平比較 甲亢組血清miR-133a水平低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=9.796,P<0.001),見圖1。

圖1 兩組血清miR-133a表達(dá)水平比較圖

2.3甲亢患者血清miR-133a水平與TH及脂質(zhì)代謝指標(biāo)參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果 甲亢患者血清miR-133a水平與ALT(rs=-0.381,P<0.001)、FT3(rs=-0.319,P=0.001)、FT4(rs=-0.404,P<0.001)水平呈負(fù)相關(guān),與TC(rs=0.500,P<0.001)、LDL-C(rs=0.337,P=0.001)和TSH(rs=0.214,P=0.033)水平呈正相關(guān)。經(jīng)校正年齡、性別和BMI變量后,偏相關(guān)分析結(jié)果顯示血清miR-133a水平與TC(rs=0.372,P=0.001)和TSH(rs=0.254,P=0.016)水平仍呈正相關(guān),與FT3水平仍呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.271,P=0.009)。

2.4甲巰咪唑治療對甲亢患者代謝指標(biāo)參數(shù)及血清miR-133a水平的影響結(jié)果 28例經(jīng)甲巰咪唑治療的甲亢患者在隨訪期間未觀察到嚴(yán)重不良事件發(fā)生。與治療前相比,其血清FT3和FT4水平降低,TC、LDL-C和TSH水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在接受甲巰咪唑治療后,患者血清miR-133a水平較治療前顯著上調(diào)(P<0.05),見表3。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示,治療前后血清miR-133a水平變化值與FT3(rs=-0.728,P<0.001)、FT4(rs=-0.377,P=0.048)水平變化值呈負(fù)相關(guān),而與TC、TG、LDL-C和TSH水平變化值相關(guān)性不顯著(P>0.05),見圖2。經(jīng)校正年齡、性別和BMI的變量后,偏相關(guān)分析結(jié)果顯示血清miR-133a水平變化值仍與FT3變化值呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.690,P<0.001)。

圖2 甲巰咪唑治療前后血清miR-133a水平變化值與FT3、FT4水平變化值的散點(diǎn)圖

表3 甲巰咪唑治療對甲亢患者代謝指標(biāo)參數(shù)及血清miR-133a水平的影響結(jié)果

3 討論

3.1本研究結(jié)果顯示,新發(fā)甲亢患者血清miR-133a水平降低,經(jīng)甲巰咪唑治療后其水平上升。經(jīng)校正年齡、性別和BMI因素后,偏相關(guān)分析結(jié)果顯示甲亢患者血清miR-133a水平與TC、TSH水平呈正相關(guān),與FT3水平呈負(fù)相關(guān),且在甲巰咪唑治療前后miR-133a水平變化值與FT3、FT4水平變化值相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了甲亢患者甲狀腺功能與血清miR-133a水平之間存在相關(guān)性。

3.2TH對正常的生長、發(fā)育和代謝至關(guān)重要。研究表明,TH水平與體質(zhì)量及能量消耗有關(guān)[9]。甲亢患者因TH分泌過量,促進(jìn)以靜息能量消耗增加、體質(zhì)量減輕為特征的高代謝狀態(tài),導(dǎo)致血清TG和TC水平降低[10]。本研究結(jié)果亦顯示甲亢患者的血脂、BMI和腰圍水平降低。據(jù)報(bào)道,TH主要通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的特定核受體影響TG、TC的產(chǎn)生[11]。越來越多的證據(jù)也表明,miRNA機(jī)制也可能參與TH的代謝調(diào)節(jié)[12]。本研究結(jié)果表明,與甲狀腺功能正常的對照組相比,甲亢組血清miR-133a水平顯著降低。因此,探討TH與miR-133a之間的關(guān)系可能有助于進(jìn)一步了解甲亢患者代謝功能障礙的發(fā)生機(jī)制。

3.3肝臟是TH調(diào)節(jié)能量代謝和生理功能的重要器官,甲亢患者多合并肝功能不全,甲狀腺功能減退與非酒精性脂肪性肝病相關(guān)[13-14]。有研究表明,三碘甲狀腺原氨酸具有降低血脂水平的能力,包括TC和TG[11,15]。肝臟中的脂質(zhì)代謝涉及許多基因,而TH對其具有調(diào)節(jié)作用,包括一些miRNA。Zheng等[15]觀察到抑制內(nèi)源性miR-206表達(dá)可降低HepG2細(xì)胞TG和TC的表達(dá);相反,miR-206過表達(dá)可抑制T3治療誘導(dǎo)的TG水平降低。越來越多的研究證據(jù)也表明,miRNA參與脂質(zhì)代謝中基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[16-17]。Ioannidis和Donadeu[7]的研究顯示,miR-133a在TC處理中的調(diào)節(jié)作用是組織特異性的。肌肉釋放的循環(huán)外泌體攜帶特定miRNA,例如miR-133a和miR-133b水平上調(diào),進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟基因表達(dá)變化,從而改善代謝譜[18]。此外,Peng等[19]的研究發(fā)現(xiàn),miR-133a可以直接調(diào)節(jié)RAW 264.7巨噬細(xì)胞中睪丸孤兒核受體4的表達(dá),從而減少CD36介導(dǎo)的脂質(zhì)積累。Fu等[20]則證實(shí)了miR-1、miR-133a和miR-206a在比目魚肌肉發(fā)育中具有重要的調(diào)節(jié)作用,并直接或間接受到TH的調(diào)節(jié)。Diniz等[21]認(rèn)為,TH水平升高可誘導(dǎo)miR-133a表達(dá)降低,進(jìn)而促進(jìn)1型血管緊張素Ⅱ受體誘導(dǎo)的心肌肥厚,雖然該觀點(diǎn)并未在本研究中得到證實(shí),但其發(fā)現(xiàn)也為TH與miR-133a關(guān)系研究提供了參考。

3.4在本研究中,只有28例甲亢患者嚴(yán)格遵醫(yī)囑接受甲巰咪唑治療,結(jié)果顯示,在接受治療后患者血清miR-133a水平較治療前顯著升高,且其血清miR-133a水平變化值與FT3、FT4變化值呈負(fù)相關(guān)。筆者推測甲亢患者血清miR-133a水平降低可能部分歸因于TH表達(dá)過量。

3.5本研究也有一定的局限性：(1)僅檢測了甲亢患者血清miR-133a水平,其在肝臟中的表達(dá)水平未能測定;(2)本研究為非隨機(jī)對照試驗(yàn),可能存在一定的選擇偏倚;(3)樣本量相對較少,隨訪時(shí)間短,單中心研究的性質(zhì)等可能阻礙了本研究結(jié)果的推廣。

綜上所述,甲亢患者血清miR-133a水平降低,且伴隨著血脂代謝紊亂,血清miR-133a水平與TC、LDL-C水平呈正相關(guān)。經(jīng)甲巰咪唑治療后甲亢患者血清miR-133a水平有所升高,這可能部分歸因于FT3、FT4水平變化,但miR-133a在甲亢患者的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。