施建羽,李惠華,吳美芳,王偉
(福建省亞熱帶植物研究所,福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門 361006)
白芨又名“白及”,Bletillastriata(Thunb. ex A.Murray)Rchb.f.,蘭科白芨屬草本植物,是中國(guó)傳統(tǒng)中藥。其藥用部位是干燥塊莖,味甘、苦、澀,性偏寒,歸胃經(jīng)、肺經(jīng)和肝經(jīng)[1]。白芨的藥用價(jià)值很高:抑菌、消炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、促傷口愈合等[2-3]。其主要成分為天然水溶性多糖,其次為多酚、氨基酸類[4]。目前白芨的應(yīng)用領(lǐng)域主要涉及:傳統(tǒng)中藥組方、包合材料、生物黏附材料、水凝膠材料、基因遞送載體、血管栓塞材料和聚合物膠束材料等,也可用作祛斑類化妝品[5-7]。隨著白芨栽培技術(shù)的完善,產(chǎn)量大幅提升,高端加工產(chǎn)品的需求激增。因此,運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)和方法對(duì)白芨的成分以及應(yīng)用場(chǎng)景做進(jìn)一步的挖掘具有重要意義。
近年來(lái),藥用植物外泌體成為新的中藥活性成分,引起研究人員的重視。植物外泌體是由植物細(xì)胞分泌的、包含了復(fù)雜RNA 和蛋白質(zhì)的細(xì)胞外囊泡,其直徑在30~200 nm之間,主要參與細(xì)胞間的通訊,因具有磷脂雙分子層而性質(zhì)穩(wěn)定,可保護(hù)內(nèi)含物免受降解并運(yùn)送至受體細(xì)胞[8-10]。2012 年細(xì)胞外囊泡國(guó)際學(xué)會(huì)的成立,顯示了外泌體在生物學(xué)和應(yīng)用方面的重要性。外泌體除自身具有一定功能之外,還是一種新興的天然納米材料,用作藥物載體[11-14]。外泌體在原植株細(xì)胞乃至跨界細(xì)胞或物種間有廣泛的應(yīng)用前景,例如在美容方面:間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可促燙傷皮膚的恢復(fù)及再生[15],在面部皮膚光損傷修復(fù)中,人血小板外泌體被證實(shí)安全且療效顯著[16],毛囊乳頭細(xì)胞球來(lái)源的外泌體可促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)[17]。
藥用植物外泌體是目前醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)等研究熱點(diǎn)之一[11-13],目前尚未見(jiàn)白芨外泌體分離和功能研究的報(bào)導(dǎo)。本研究以鮮白芨塊莖為材料,首次進(jìn)行白芨外泌體的分離,開(kāi)展其對(duì)體外人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(human immortalized keratinocyte,Hacat)的生物活性研究,以期為白芨外泌體在護(hù)膚品領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
鮮白芨(Bletillastriata)的藥用部位塊莖,2021 年10 月采收于福建省亞熱帶植物研究所藥用植物資源圃。
(1)鮮白芨塊莖500克榨汁,移至離心管內(nèi),2000×g,4℃,30 min 離心。(2)將上清液移至新的離心管中,10000×g,4℃,45 min離心,去除較大的囊泡。(3)取上清,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾,收集過(guò)濾液。(4)將上清和相同體積的PEG6000 溶液混勻,4℃過(guò)夜。(5)10000×g,4℃,60 min離心,去上清,用3 mL預(yù)冷PBS重懸沉淀,透析過(guò)夜。(6)將透析完的重懸液轉(zhuǎn)移到EP 管中,10000×g,4℃,60 min 離心,去上清,預(yù)冷PBS 重懸沉淀,取20 μL用于透射電鏡觀察,10 μL用于粒徑分析,10 μL用于蛋白提取,剩余外泌體于-80℃保存。
(1)吸取外泌體10 μL,滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min,濾紙吸去浮液。(2)醋酸雙氧鈾10 μL滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min,濾紙吸去浮液,常溫干燥數(shù)分鐘。(3)100 kv進(jìn)行電鏡(Hitachi HT-7700)檢測(cè)成像。
(1)吸取外泌體10 μL,稀釋到30 μL。(2)先用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行粒徑分析儀(NanoFCM N30E)性能測(cè)試,合格后方可進(jìn)行外泌體樣品上樣,注意需進(jìn)行梯度稀釋,避免樣本堵塞進(jìn)樣針。(3)樣本完成檢測(cè),即可獲得儀器檢測(cè)外泌體的粒徑和濃度信息。
(1)37℃速融外泌體,并迅速加入5×的RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay,放射免疫沉淀)裂解液。(2)混勻后在冰上裂解30 min,期間混勻。(3)配制BCA(bicinchoninic acid,聚氰基丙烯酸正丁酯)法測(cè)蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品,并取5 μL樣品加入到BCA混合液中,混勻。(4)37℃孵育30 min,酶標(biāo)儀上在OD562 nm處檢測(cè)吸光值并記錄。(5)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測(cè)樣品蛋白濃度。
Hacat 細(xì)胞在含有1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM(dulbecco's modified eagle medium)高糖培養(yǎng)液中,37℃、5% CO2保持飽和濕度培養(yǎng),細(xì)胞密度約80%~90%時(shí)進(jìn)行常規(guī)傳代。
Hacat細(xì)胞按照5000個(gè)/孔鋪板96孔板,待細(xì)胞貼壁后,62.5 μmol/L H2O2處理4 min 進(jìn)行氧化損傷。之后,棄舊的培養(yǎng)基,向細(xì)胞中添加內(nèi)含10 μg/mL 白芨外泌體的完全培養(yǎng)基。氧化損傷處理的細(xì)胞為模型組,正常未處理細(xì)胞為對(duì)照。48 h后,加入CCK8試劑進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè),2 h內(nèi)讀取OD450值。此時(shí),分別收集對(duì)照組、模型組、造模后外泌體處理組的Hacat 細(xì)胞,制備Western Blot的樣本。
采用生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)的E606336-0020 Annexin V(分子量為35k~36 kD 的Ca依賴性磷脂結(jié)合蛋白)凋亡檢測(cè)試劑盒,F(xiàn)ITC/PI(Propidium Iodide 碘化丙啶)雙染法,按照說(shuō)明書操作:胰酶消化細(xì)胞,1200 r/min,離心5 min 收集細(xì)胞,PBS洗滌2次;195 μL 1×Binding buffer懸浮細(xì)胞;加入5 μL Annexin V-FITC,4℃避光孵育10~15 min;加入200 μL 1×Binding buffer 洗滌細(xì)胞、1200 r/min 離心5 min,移除上清;190 μL 1×Binding buffer 懸浮細(xì)胞;加10 μL PI混勻后上機(jī)檢測(cè)。
提取細(xì)胞的總蛋白,經(jīng)BCA法定量和蛋白變性后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,80 V恒壓電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚二偏氟乙烯膜上,用5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h;用5% BSA稀釋一抗Anti-BCL-2(1:1000)、Anti- Caspse- 3(1:1000)、Anti- Caspase- 9(1:1000),放入PVDF 膜,4℃過(guò)夜,TBST(洗滌緩沖液一種:T:Tris;B:Buffer;S:Solution;T:Tween)洗膜3 次;放入山羊抗兔二抗室溫孵育1 h,TBST洗膜5次;然后用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影。抗體及生化試劑購(gòu)自生工生物工程股份有限公司。以β-actin 作為內(nèi)參,采用Photoshop 5.0軟件對(duì)各條帶的總灰度值作相對(duì)定量分析。具體方法參考文獻(xiàn)[18]。
每個(gè)試驗(yàn)3 次生物學(xué)重復(fù),1.7 中細(xì)胞活力設(shè)6 次生物學(xué)重復(fù),數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行生統(tǒng)分析。其余試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Duncan法進(jìn)行多重比較,表示為3次重復(fù)的平均值±SE,標(biāo)有不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05),標(biāo)有相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05);標(biāo)有不同大寫字母表示組間差異顯著(P<0.01),標(biāo)有相同大寫字母表示組間差異不顯著(P>0.01)。
采用PEG沉淀法,由鮮白芨塊莖分離的外泌體標(biāo)注為:白芨外泌體(B-exo)。圖1所示:在透射電鏡下可以看到白芨外泌體具有十分明顯的膜結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)茶杯狀;粒徑分析儀檢測(cè),白芨外泌體粒徑為69.63 nm,500 g鮮樣提取白芨外泌體35 mL,每毫升白芨外泌體的顆粒數(shù)為7.48E+9 Particles,每克鮮白芨外泌體的顆粒數(shù)為5.24E+8 Particles?;谛螒B(tài)完整性判斷,采用PEG沉淀法提取的白芨外泌體可用于后續(xù)研究。
圖1 白芨外泌體透射電子顯微鏡圖和平均粒徑示意圖
采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度,結(jié)果表明:外泌體蛋白測(cè)出的OD562 nm 為0.0945 代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的公式(1)進(jìn)行計(jì)算,得到白芨外泌體蛋白濃度為0.223 μg/μL(加裂解液),換算得到未添加裂解液的白芨外泌體原蛋白濃度為0.279 μg/μL,并根據(jù)此數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)定量。結(jié)合以上蛋白濃度和樣本的起始量可知,每克白芨鮮樣中含外泌體蛋白19.53 μg。
式中x表示OD562,y表示標(biāo)準(zhǔn)濃度(μg/mL)。
CCK8檢測(cè)不同濃度白芨外泌體對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(Hacat)存活率影響,結(jié)果如表1所示。
表1 不同濃度白芨外泌體對(duì)Hacat細(xì)胞存活率的影響
與空白對(duì)照相比,5 μg/mL 以上的白芨外泌體處理均可以顯著提高Hacat細(xì)胞的存活率(P<0.05),并且隨著白芨外泌體處理濃度的提高,Hacat細(xì)胞存活率也逐漸提高,10 μg/mL與20 μg/mL的處理沒(méi)有顯著性差異。說(shuō)明一定濃度的白芨外泌體在一定程度上可以顯著提高Hacat細(xì)胞的存活率,也有飽和濃度。
流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果,如圖2 所示。H2O2氧化損傷處理后,Hacat 細(xì)胞凋亡水平顯著上調(diào)(P<0.01)。Hacat細(xì)胞經(jīng)氧化損傷再添加10 μg/mL白芨外泌體處理48 h,與氧化損傷模型組比較,Hacat 細(xì)胞凋亡程度均顯著降低(P<0.01)。
圖2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)
表2數(shù)據(jù)分析表明:氧化損傷模型組造模有效,白芨外泌體處理組能夠顯著降低氧化損傷引起的Hacat細(xì)胞早凋亡、晚凋亡和總凋亡的細(xì)胞比例(P<0.01)。
表2 白芨外泌體對(duì)Hacat細(xì)胞凋亡的影響
Hacat 細(xì)胞經(jīng)H2O2氧化損傷處理造模,模型組用白芨外泌體10 μg/mL 干預(yù)48 h。蛋白印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞的caspase-9和caspase-3 表達(dá)顯著上升,而B(niǎo)cl-2 表達(dá)量無(wú)顯著差異;與模型組相比,白芨外泌體處理組的caspase-9和caspase-3表達(dá)顯著下降,且低于對(duì)照組,而B(niǎo)cl-2表達(dá)量無(wú)顯著差異(P<0.05)(圖3)。采用半定量掃描分析,以β-Actin為蛋白上樣量的內(nèi)參,對(duì)照組、模型組和外泌體處理組計(jì)算灰度比的相對(duì)值結(jié)果如下:caspase-9 分別為1.000,1.325±0.012,0.847±0.006;caspase-3 分別為1.000,1.313±0.025,0.856±0.011;Bcl-2 分別為1.000,1.090±0.024,1.047±0.016。
圖3 Hacat細(xì)胞經(jīng)氧化造模和外泌體處理后相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)
已有研究表明,外泌體的提取方法有超速離心法、超濾離心法、多聚物沉淀法、密度梯度離心法、免疫磁珠法以及尺寸排阻色譜法等[19-20]。方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前最廣泛采用的超速離心法,雖然操作簡(jiǎn)單且易保持外泌體的完整性,但對(duì)儀器設(shè)備的要求較高,需要超高速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速>100000 r/min,4℃,滿足此條件的離心機(jī)價(jià)格昂貴[20]。本研究中白芨外泌體的分離采用的是PEG沉淀法,屬于多聚物沉淀法。PEG早已廣泛用于濃縮和純化病毒,因?yàn)橥饷隗w與病毒有著較為相似的生物物理特性,研究人員嘗試用PEG法分離外泌體,較其他方法提取成本更廉價(jià)[21]。本研究中,采用PEG6000 在4℃條件下,過(guò)夜沉淀白芨外泌體,整個(gè)分離過(guò)程中最大的離心力為10000×g,此提取條件絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室均可以滿足,且成本低廉,與已有報(bào)導(dǎo)相符。不過(guò)也有研究表明,PEG可能會(huì)干擾目標(biāo)分離物從而影響后續(xù)試驗(yàn)[19]。本研究中,透射電鏡下白芨外泌體保留完整的膜結(jié)構(gòu);Hacat 細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡檢測(cè)及蛋白印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)通路蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示PEG 沉淀法保留了白芨外泌體的生物活性。因此PEG沉淀法適合于白芨外泌體的分離,可為其他植物外泌體的提取提供參考。
從已知的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)源性和外源性凋亡途徑[22]可知:Bcl-2 位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游,不局限于調(diào)控下游Caspase 蛋白;Caspase-9 位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的樞紐位置,能被多個(gè)因子調(diào)控;Caspase-3位于Caspase-9的下游。已有研究表明:Caspase蛋白是一類與凋亡相關(guān)的蛋白酶家族,Caspase-9 為凋亡始動(dòng)子,屬啟動(dòng)型蛋白酶,位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游[23]。Caspase-3 為凋亡效應(yīng)子,屬執(zhí)行型蛋白酶,位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游,能被上游的始動(dòng)子激活,一旦被激活會(huì)觸發(fā)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng),使凋亡不可避免[24]。Bcl-2蛋白是Bcl-2家族蛋白中抗凋亡蛋白的代表[25]。本研究表明:H2O2氧化損傷模型中Caspase-3、Caspase-9含量增加,說(shuō)明在模型組的Hacat細(xì)胞凋亡過(guò)程中,Caspase依賴性凋亡途徑激活[26]。與模型組相比,白芨外泌體干預(yù)組的Caspase-9 和Caspase-3 表達(dá)顯著下降,且低于對(duì)照組,說(shuō)明在外泌體干預(yù)下,經(jīng)H2O2氧化損傷的Hacat細(xì)胞凋亡過(guò)程中,Caspase 依賴性凋亡途徑被抑制。Caspase-9 和Caspase-3表達(dá)呈現(xiàn)出正相關(guān)性,與已有研究相符。在本項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組、氧化造模組、外泌體處理組當(dāng)中Bcl-2 表達(dá)均無(wú)顯著性變化,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)涉及的Hacat細(xì)胞凋亡過(guò)程與Bcl-2無(wú)關(guān),與已有研究Bcl-2位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游,不局限于調(diào)控下游Caspase 蛋白相符。本研究通過(guò)流式雙染檢測(cè)證實(shí)白芨外泌體對(duì)Hacat細(xì)胞凋亡的抑制作用,并通過(guò)蛋白印跡法對(duì)其可能的相關(guān)通路蛋白做了初探,兩部分內(nèi)容相互佐證,證實(shí)白芨外泌體對(duì)氧化損傷引起的Hacat細(xì)胞凋亡具有抑制作用,但鑒于凋亡途徑的復(fù)雜性[22],其Caspase 途徑上游的影響因子、相關(guān)基因及更深入的凋亡分子機(jī)理研究還需進(jìn)一步試驗(yàn)。
已有研究發(fā)現(xiàn):將白芨加水?dāng)嚢韬笮纬傻哪z,涂抹于大鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面,能顯著促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織、毛細(xì)血管生長(zhǎng)及創(chuàng)面組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的高表達(dá),具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用,具有顯著的止血功效[26]。白芨凝膠中最主要的成分是白芨多糖,其作為一種優(yōu)良的天然增稠劑,可應(yīng)用于各種化妝品,代替化學(xué)增稠劑,減少對(duì)皮膚的刺激,同時(shí)也可作為懸浮劑、保濕劑和助乳化劑應(yīng)用于化妝品中,且均具有良好的效果[4]。人皮膚角質(zhì)層的緊密結(jié)構(gòu)是限制物質(zhì)進(jìn)出皮膚的主要屏障,小分子物質(zhì)、兼具脂溶性和水溶性的物質(zhì)更易于滲透[27-28]。
白芨多糖為大分子,并具有黏性,雖然在開(kāi)放性傷口上有很好的促修復(fù)功效,但涂抹在正常皮膚上,其大分子的特性在一定程度上會(huì)限制其透皮吸收率。本研究中白芨外泌體粒徑為69.63 nm,天然納米級(jí),易于穿過(guò)角質(zhì)層;且有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),可能包裹miRNA等核酸成分使其免受降解,從而可以在基因?qū)用鎸?duì)皮膚進(jìn)行調(diào)控,這是外泌體成為研究熱點(diǎn)的重要原因,也是今后研究的方向。因此將白芨外泌體易吸收、促細(xì)胞增殖、抑制凋亡的活性,與傳統(tǒng)白芨多糖凝膠保濕增稠及促修復(fù)的活性相結(jié)合,例如:形成白芨外泌體A液(小分子,易吸收,先涂抹),白芨多糖B液(大分子,保濕,后涂抹)。類似組合可能在護(hù)膚領(lǐng)域有一定的開(kāi)發(fā)潛能。
本研究獲得了實(shí)驗(yàn)室條件下白芨外泌體的分離方法,明確其能促進(jìn)體外Hacat細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制H2O2引起的Hacat細(xì)胞凋亡且與通路蛋白caspase-9和caspase-3相關(guān),為其他植物外泌體的提取提供參考,為白芨今后在護(hù)膚品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)。