銅藻巖藻多糖勻漿提取工藝及抗氧化活性分析

蔡樹蕓,駱春萍,許敏,何裊裊,黃雅瑜,林米妮,張怡評(píng),,4

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350108;2.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心,福建 廈門 361005;3.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋生物學(xué)院,福建 廈門 361100;4.福建省海島資源生態(tài)監(jiān)測與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350400)

銅藻(Sargassumhorneri),又名柱囊馬尾藻、草茜、海柳麥等,隸屬于褐藻門墨角藻目馬尾藻科馬尾藻屬,是馬尾藻屬中個(gè)體較大的可食用大型褐藻[1],通常長度可達(dá)2～7 m?！缎氯A本草綱要》中記載了福建民間以銅藻作中藥“海藻”藥用,其味咸、性寒,歸肺肝經(jīng)。它具有消痰軟堅(jiān)、清熱利水的功效,可用于治療癭瘤、瘰疬、水腫、甲狀腺腫以及淋巴結(jié)腫等疾病[2]。銅藻主要分布于我國遼寧半島、山東半島、浙江、福建和廣東沿岸等[3]。近年來水溫升高且海洋富營養(yǎng)化,導(dǎo)致銅藻的產(chǎn)量增加[4]。銅藻富含多糖、多酚、巖藻黃質(zhì)、植物甾醇及蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)[5-7],具有良好的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。銅藻巖藻多糖(fucoidan)是銅藻中主要的活性成分,其具有抗氧化、抗病毒、降血糖、抗凝血和降尿酸等多種藥理作用[8-14],在醫(yī)藥、保健食品、食品及飼料等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[15-17]。目前,關(guān)于多糖的提取研究主要集中于傳統(tǒng)的熱水浸提,但提取效率較低,因此尋找合適的提取工藝具有重要意義。

勻漿提取法是加入溶劑利用勻漿機(jī)將組織進(jìn)行粉碎或磨漿,使目標(biāo)成分加快溶出的一種方法,該方法提取速度快、效率高且能耗低[18-20]。本實(shí)驗(yàn)以銅藻為原材料,采用勻漿法提取銅藻巖藻多糖,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)(RSM)優(yōu)化巖藻多糖提取工藝,并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究,為銅藻巖藻多糖的工業(yè)化生產(chǎn)以及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器DGG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);UH5300紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);BCE124-1CCN電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司];DFT-200A粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司);電熱恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);Alpha-Pure15純水系統(tǒng)(精藝興業(yè)科技有限公司);H1650離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司);QC-901渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);Multiskan SkyHigh全波長酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 材料銅藻由福建遠(yuǎn)揚(yáng)藻業(yè)有限公司提供。將銅藻洗凈,除去泥沙和雜質(zhì),瀝干水分,烘干,粉碎過50目篩,備用。

L-巖藻糖(Fuc,批號(hào):20180809,自然資源部第三海洋研究所);苯酚[生工生物工程(上海)股份有限公司];四硼酸鈉(索萊寶科技有限公司);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、過硫酸鉀[上海麥克林生化科技有限公司];濃硫酸、濃鹽酸、咔唑、抗壞血酸(VC)、二水磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 銅藻巖藻多糖勻漿提取工藝優(yōu)化

2.1.1 銅藻巖藻多糖的提取取1.0 g銅藻粉末,加入適量的水,固定勻漿轉(zhuǎn)速,水浴提取一段時(shí)間后,冷卻,10 000 r·min-1離心5 min,棄沉淀,上清液過濾,將過濾液定容至相同體積。采用苯酚-硫酸法[21]測定巖藻多糖含量。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及多糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密稱取L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg于25 mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,配成200 μg·mL-1L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液于15 mL離心管中,加水補(bǔ)足至1.0 mL,依次加入5%苯酚1.0 mL和5.0 mL濃硫酸,渦旋混勻后,30 ℃水浴靜置20 min。于490 nm處測定吸光度,以L-巖藻糖的濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性方程。

樣品溶液的制備:將定容后的上清液取100 μL,置于離心管中,加水補(bǔ)足至1.0 mL,加入5%苯酚1.0 mL和5.0 mL濃硫酸,渦旋混勻后,30 ℃水浴靜置20 min。于490 nm處測定吸光度,根據(jù)公式(1)計(jì)算巖藻多糖提取率。

(1)

C:L-巖藻糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的回歸方程計(jì)算所得的濃度值,μg·mL-1;V:上清液定容的體積,mL;N:稀釋倍數(shù);m:銅藻粉末質(zhì)量,g。

2.1.3 單因素試驗(yàn)每次只變動(dòng)一個(gè)條件,其他條件不變,考察因素提取時(shí)間(1、3、5、7、9 min)、液料比(20、30、40、50、60 mL·g-1)、提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)、提取次數(shù)(1、2、3、4、5)對(duì)巖藻多糖提取率的影響。

2.1.4 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)定提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)和液料比(C)這3個(gè)因素,以巖藻多糖的提取率為考察指標(biāo),對(duì)勻漿提取銅藻巖藻多糖的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 銅藻巖藻多糖樣品的制備采用優(yōu)化的最佳工藝提取銅藻巖藻多糖,加入無水乙醇使提取液乙醇濃度達(dá)到30%,靜置1 h,10 000 r·min-1離心5 min,棄沉淀除去褐藻膠,再繼續(xù)加入無水乙醇使?jié)舛冗_(dá)到80%,靜置24 h,10 000 r·min-1離心5 min,收集沉淀,用無水乙醇洗滌沉淀2次,真空干燥得巖藻多糖(WSHFuc)。

2.3 銅藻巖藻多糖主要成分分析

2.3.1 多糖含量檢測精密稱取5.0 mg巖藻多糖,配制成0.1 mg·mL-1的多糖溶液,取1.0 mL置于離心管中,加入5%苯酚1.0 mL和5.0 mL濃硫酸,渦旋混勻后,30 ℃水浴反應(yīng)20 min。于490 nm處測定吸光度,根據(jù)“2.1.2”項(xiàng)下方法得到的線性方程計(jì)算巖藻多糖的含量。

2.3.2 糖醛酸含量檢測采用咔唑-硫酸法[22]對(duì)多糖中糖醛酸含量進(jìn)行測定。以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品,分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,用水補(bǔ)足至1.0 mL,冰水浴5 min;分別加入5.0 mL四硼酸鈉-濃硫酸溶液,渦旋混勻,沸水浴15 min,取出后置于冰水浴中冷卻;再分別加入0.2 mL 咔唑-無水乙醇溶液,渦旋混勻,沸水浴10 min,冰浴冷卻,于530 nm處測定吸光度值;以半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),530 nm吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品溶液1.0 mL代替標(biāo)準(zhǔn)液測吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算樣品中糖醛酸含量。

2.3.3 巖藻糖含量檢測準(zhǔn)確稱取巖藻多糖樣品10 mg于10 mL 試管中,加入2.0 mL水,再加入0.6 mL濃鹽酸,置于沸水浴中水解3 h,冷卻至室溫后用水定容至10 mL,采用離子色譜檢測[23]。

2.4 銅藻巖藻多糖體外抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH自由基清除活性參考李德龍等[24]方法取不同質(zhì)量濃度的銅藻巖藻多糖溶液200 μL,加200 μL 0.05 mg·mL-1DPPH乙醇溶液,樣品對(duì)照用無水乙醇代替DPPH乙醇溶液,空白對(duì)照用同體積超純水代替多糖樣品,以VC作陽性對(duì)照,混勻后避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測吸光度,清除率按照公式(2)計(jì)算。

(2)

A0:空白對(duì)照吸光度;A1:反應(yīng)后溶液的吸光度;A2:樣品對(duì)照的吸光度。

2.4.2 ABTS+自由基清除活性取相同體積的ABTS溶劑(7.0 mmol·L-1)和過硫酸鉀溶液(2.45 mmol·L-1)混勻,置于暗處避光12 h,備用。于734 nm處將工作液的吸光值用磷酸鹽緩沖液PBS稀釋調(diào)整為0.7±0.02。分別吸取100 μL不同濃度多糖溶液與1 mL ABTS+工作液混勻,室溫避光靜置10 min,測定734 nm處的吸光值[25],清除率按照公式(3)計(jì)算。

(3)

A0:用超純水代替多糖溶液的吸光度;A1:反應(yīng)后溶液的吸光度;A2:樣品對(duì)照的吸光度。

2.4.3 羥自由基清除活性參考于靚等[26]的方法分別取200 μL不同濃度的多糖溶液,加入6.0 mmol·L-1硫酸亞鐵、6.0 mmol·L-1水楊酸乙醇溶液和6.0 mmol·L-1過氧化氫溶液各200 μL,加水定容至2 mL混合均勻,37 ℃水浴30 min,冷卻至室溫后在510 nm測定吸光度,樣品對(duì)照組用蒸餾水代替過氧化氫溶液,空白組用蒸餾水代替樣品,以VC作陽性對(duì)照,清除率按照公式(4)計(jì)算。

(4)

A0:空白組用超純水代替多糖溶液的吸光度;A1:反應(yīng)后溶液的吸光度;A2:樣品對(duì)照用超純水代替過氧化氫溶液的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 提取時(shí)間對(duì)銅藻巖藻多糖的影響在水浴溫度為60 ℃,液料比30 mL·g-1,提取次數(shù)為1次條件下,研究提取時(shí)間1、3、5、7、9 min對(duì)巖藻多糖提取率的影響。結(jié)果顯示,隨著勻漿時(shí)間的延長,巖藻多糖提取率逐漸增加,在5 min時(shí)達(dá)最高,隨后開始下降,其原因可能是勻漿時(shí)間過長,其他成分也一并溶出,導(dǎo)致巖藻多糖提取率降低。因此,選擇5 min為最佳勻漿時(shí)間。

3.1.2 提取溫度對(duì)銅藻巖藻多糖的影響在提取時(shí)間為5 min,液料比30 mL·g-1,提取次數(shù)為1次條件下,研究提取溫度60、70、80、90、100 ℃對(duì)巖藻多糖提取率的影響。結(jié)果顯示,隨著提取溫度的升高,巖藻多糖提取率逐漸增加,在90 ℃時(shí)達(dá)最高,隨后開始下降,其原因可能是過高的熱效應(yīng)會(huì)造成部分多糖分解,導(dǎo)致巖藻多糖提取率降低。因此,選擇90 ℃為最佳提取溫度。

3.1.3 液料比對(duì)銅藻巖藻多糖的影響在提取時(shí)間為5 min,提取溫度為90 ℃,提取次數(shù)為1次條件下,研究液料比20、30、40、50、60 mL·g-1對(duì)巖藻多糖提取率的影響。結(jié)果顯示,隨著液料比的增加,巖藻多糖提取率逐漸增加,在30 mL·g-1時(shí)達(dá)最高,當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加時(shí),提取率反而下降,其原因可能是其他物質(zhì)溶出,抑制了多糖的溶出,導(dǎo)致巖藻多糖提取率降低。因此,選擇30 mL·g-1為最佳液料比。

3.1.4 提取次數(shù)對(duì)銅藻巖藻多糖的影響在提取時(shí)間為5 min,提取溫度為90 ℃,液料比30 mL·g-1條件下,研究提取次數(shù)1、2、3、4、5次對(duì)巖藻多糖提取率的影響。結(jié)果顯示,隨著勻漿提取次數(shù)增多,多糖溶出量越多,但提取次數(shù)不斷增加,不利于后續(xù)的濃縮分離,增加生產(chǎn)成本。因此,確定勻漿提取次數(shù)為2次。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

3.2.1 巖藻多糖提取因素水平根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、液料比(C)3個(gè)因素,以巖藻多糖提取率作為響應(yīng)值指標(biāo),在Design Expert 12軟件中設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

3.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果每個(gè)因素各3個(gè)水平,共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),按照得到的試驗(yàn)條件對(duì)銅藻進(jìn)行提取,并利用軟件 Design Expert 12對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

采用多元線性回歸擬合銅藻巖藻多糖提取的響應(yīng)值,得到了提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、液料比(C)和多糖提取率的二次多項(xiàng)式回歸方程為:Y=13.82+0.673 7A+1.11B+0.462 0C-0.241 8AB+0.094 5AC+0.061 3BC-0.721 5A2-1.15B2-0.675 1C2。

顯著性系數(shù)和結(jié)果方差分析的結(jié)果如表3所示,可以看出模型P<0.01,說明該模型極顯著,具有可靠性。失擬項(xiàng)P>0.05,說明模型有較好的擬合度,實(shí)際值與預(yù)測值相差不大,具有較高的可信度。相關(guān)系數(shù)R2=0.990 6,進(jìn)一步表明試驗(yàn)值與模型預(yù)測值擬合度高。根據(jù)F值可得,這3個(gè)因素中,各因素對(duì)巖藻多糖提取率的影響為:提取溫度(B)=提取時(shí)間(A)>液料比(C),說明提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖的提取影響極顯著,液料比對(duì)其提取率的影響相對(duì)較小。因素A和因素B的交互作用對(duì)結(jié)果影響最大。

表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析表

采用軟件Design Expert 12繪制了響應(yīng)面3D圖和等高線圖,更直觀的反映試驗(yàn)結(jié)果并對(duì)其進(jìn)行分析,研究各因素之間的交互作用對(duì)因變量(巖藻多糖提取率)的影響,如圖1～3所示。

圖1 提取時(shí)間與提取溫度相互作用對(duì)巖藻多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

各因素兩兩交互作用的顯著性可以通過觀察響應(yīng)面圖曲線的陡峭程度看出來,響應(yīng)面的曲線越陡峭,說明顯著性約大。由圖可知,交互項(xiàng)對(duì)WSHFuc提取率的影響大小為:AB>AC>BC,其中AB交互項(xiàng)的影響顯著。由圖1可知提取溫度的陡峭程度比提取時(shí)間的陡峭程度大,說明提取溫度對(duì)巖藻多糖提取率的影響大于提取時(shí)間。圖2中提取時(shí)間和液料比陡峭程度相差不多,說明兩者對(duì)巖藻多糖提取率的影響區(qū)別不是很大。圖3中提取溫度比液料比的陡峭程度大,說明提取溫度對(duì)巖藻多糖提取率的影響大于液料比。

圖2 提取時(shí)間與液料比相互作用對(duì)巖藻多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖3 提取溫度與液料比相互作用對(duì)巖藻多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

3.2.3 最佳工藝的預(yù)測和驗(yàn)證通過軟件Design Expert 12預(yù)測得到最佳工藝為:提取時(shí)間為5.833 min,提取溫度94.463 ℃,液料比為33.897 mL·g-1,該條件下模型預(yù)測的最高多糖提取率為14.303%?？紤]到實(shí)驗(yàn)條件,將提取工藝參數(shù)調(diào)整為提取時(shí)間為6 min,提取溫度94 ℃,液料比為34 mL·g-1,提取次數(shù)2次,該條件下對(duì)銅藻進(jìn)行提取,實(shí)際測得巖藻多糖的平均提取為14.76%,RSD<5%,與預(yù)測值相差不大。因此,本次試驗(yàn)基于響應(yīng)曲面法所得到的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

3.3 銅藻巖藻多糖主要成分不同的提取方法會(huì)影響多糖的組成成分,勻漿法提取的銅藻巖藻多糖中多糖含量為77.45%,糖醛酸含量為19.18%,巖藻糖含量為7.57%。

3.4 體外抗氧化活性研究

3.4.1 DPPH自由基清除活性結(jié)果表明,在0.2～1.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi),WSHFuc具有良好的DPPH清除活性,與多糖濃度呈正相關(guān),其IC50值為0.22 mg·mL-1,雖然多糖的清除能力低于VC,但巖藻多糖有較好的DPPH自由基清除活性。

3.4.2 ABTS+自由基清除活性在0.2～1.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi),WSHFuc對(duì)ABTS+的清除率隨著濃度的增加而升高,其IC50值為0.41 mg·mL-1,雖然巖藻多糖對(duì)ABTS+的清除能力低于VC,但巖藻多糖仍有較好的ABTS+自由基清除活性。

3.4.3 ·OH清除活性在0.5～2.5 mg·mL-1濃度范圍內(nèi),WSHFuc對(duì)·OH的清除率隨著濃度的增加而升高,巖藻多糖對(duì)·OH有一定的清除活性,但清除能力低于VC。

4 討論與結(jié)論

巖藻多糖是一種天然多糖混合物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,主要成分包括L-巖藻糖和硫酸基團(tuán),還存在少量蛋白質(zhì)及糖醛酸等[27]。勻漿可以使物料的粒徑減小,使多糖加快溶出,與傳統(tǒng)的熱水浸提相比,大大縮短提取時(shí)間。本研究以銅藻為研究對(duì)象,在單因素基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化勻漿輔助銅藻巖藻多糖的提取工藝,探究提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、液料比(C)對(duì)銅藻巖藻多糖提取率的影響。結(jié)果表明,影響巖藻多糖提取率的因素的順序?yàn)?提取溫度(B)=提取時(shí)間(A)>液料比(C),得到多糖的最佳提取條件為:為提取時(shí)間為6 min,提取溫度94 ℃,液料比為34 mL·g-1,提取次數(shù)2次,巖藻多糖的提取率為14.76%,該工藝可以提高銅藻多糖的提取率。

代謝過程中會(huì)產(chǎn)生各種氧自由基,H2O2和·OH基等活性氧會(huì)對(duì)細(xì)胞和組織造成損傷,導(dǎo)致衰老或者疾病的發(fā)生,清除自由基可以預(yù)防氧化的加劇。有研究表明巖藻多糖有著良好的抗氧化活性,為天然抗氧化劑[28-30]。Lou等[31]從馬尾藻中分離純化出一種新型的多糖STSP-I,具有較強(qiáng)清除自由基的作用。本文研究銅藻巖藻多糖對(duì)DPPH、ABTS+、·OH的清除率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在多糖濃度達(dá)到1.0 mg·mL-1時(shí),巖藻多糖對(duì)DPPH、ABTS+自由基的清除率與VC接近,說明其具有良好抗氧化活性,為銅藻巖藻多糖進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考依據(jù)。