五子衍宗丸的藥效挖掘及斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

趙晨,楊怡雯,王洪平,彭平,尹瓊,肖婷婷,徐懿喬

(1.北京同仁堂股份有限公司科學(xué)研究所,北京 100079;2.杭州環(huán)特生物科技股份有限公司,浙江 杭州 310051)

五子衍宗丸由枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車(chē)前子組成[1],為中醫(yī)補(bǔ)腎固精助腎陽(yáng)的經(jīng)典方。五子衍宗丸本為補(bǔ)腎填精所設(shè),在中醫(yī)辨證論治觀與“異病同治”思想的指導(dǎo)下,凡是腎虛精虧之證均可采用五子衍宗丸治療[2]。

斑馬魚(yú)既具有細(xì)胞等體外實(shí)驗(yàn)用藥量少、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低、周期短、高通量等特點(diǎn),又具備整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可觀察多個(gè)器官、評(píng)價(jià)藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)以及可評(píng)價(jià)代謝物活性等優(yōu)勢(shì)[3]。目前基于已知疾病機(jī)制而建立的斑馬魚(yú)模型在生物醫(yī)學(xué)的諸多領(lǐng)域快速發(fā)展,也應(yīng)用于心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、視網(wǎng)膜疾病、感染性疾病、骨質(zhì)疏松等諸多臨床常見(jiàn)病,并在抗癌、抗血栓與止血等領(lǐng)域得到應(yīng)用[4]。本研究應(yīng)用計(jì)算二次開(kāi)發(fā)的方法和生物驗(yàn)證相結(jié)合,研究藥物與疾病的關(guān)聯(lián)并利用斑馬魚(yú)模型加以驗(yàn)證,挖掘五子衍宗丸潛在的適應(yīng)證。

1 材料與方法

1.1 儀器AZ100電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡(Nikon公司);ACCU-CHEK Performa血糖儀(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司);TG16G高速離心機(jī)(上海依赫生物科技有限公司);Zebra Lab 3.11行為分析儀(ViewPoint公司)。

1.2 試劑與試藥五子衍宗丸(同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠);鹽酸吡格列酮片(江蘇德源藥業(yè)股份有限公司);磷酸西格列汀片(Merck Sharp &Dohme Italia SPA);純蛋黃粉(浙江艾格生物科技股份有限公司);血糖儀試紙(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司);葡萄糖、結(jié)晶氯化鋰、甲基纖維素、六水氯化鋁均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙酰膽堿酯酶檢測(cè)試劑盒(AAT Bioquest公司)。

1.3 動(dòng)物斑馬魚(yú)均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚(yú)用水中(水質(zhì):每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽,電導(dǎo)率為450～550 μS·cm-1;pH為6.5～8.5)。野生型AB品系斑馬魚(yú)、轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元綠色熒光NBT品系斑馬魚(yú)、轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚(yú)品系與外周運(yùn)動(dòng)神經(jīng)綠色熒光斑馬魚(yú)雜交品系斑馬魚(yú),各品系斑馬魚(yú)以自然成對(duì)交配方式進(jìn)行繁殖。

1.4 五子衍宗丸藥效作用挖掘

1.4.1 五子衍宗丸化學(xué)成分及靶點(diǎn)的收集借助BATMAN-TCM平臺(tái)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/),篩選條件為Score cutoff≥20,P-value cutoff<0.05,收集枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車(chē)前子的成分及靶點(diǎn)。

1.4.2 靶點(diǎn)的組織特異性將相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp),使用作用部位分析功能,富集靶點(diǎn)作用的組織[5]。

1.4.3 藥物-疾病通路關(guān)聯(lián)分析使用DAVID平臺(tái)的GAD_DISEASE子庫(kù)、R:enrichDGN包進(jìn)行疾病富集分析,選擇P值小于0.01極其顯著富集的疾病作為分析的目標(biāo)。選擇前10種疾病進(jìn)行通路譜關(guān)聯(lián)性分析,為了獲得可信度較高的數(shù)據(jù),使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)平臺(tái)檢索疾病并獲得靶點(diǎn),取兩個(gè)平臺(tái)的并集作為疾病靶點(diǎn),使用R語(yǔ)言對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集。使用R語(yǔ)言對(duì)五子衍宗丸的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集。選取富集的P值不大于0.01的通路計(jì)算藥物-疾病的關(guān)聯(lián)性[6]。

1.5 斑馬魚(yú)的藥效驗(yàn)證

1.5.1 防治阿爾茨海默病藥效試驗(yàn)

1.5.1.1 模型的制備、分組與給藥采用水溶給予六水氯化鋁建立斑馬魚(yú)阿爾茲海默病模型。隨機(jī)分為正常組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和五子衍宗丸組,每組30尾,給藥組分別水溶暴露給予相應(yīng)受試藥物。陽(yáng)性藥為鹽酸多奈哌齊(3.33 μg·mL-1)。

1.5.1.2 反應(yīng)能力恢復(fù)以及運(yùn)動(dòng)功能障礙恢復(fù)評(píng)價(jià)隨機(jī)選取4 dpf野生型AB品系斑馬魚(yú),28 ℃處理24 h后,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú),以光暗刺激下斑馬魚(yú)的每分鐘平均運(yùn)動(dòng)速度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)五子衍宗丸反應(yīng)能力恢復(fù)作用,以斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)距離的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)五子衍宗丸運(yùn)動(dòng)功能障礙恢復(fù)作用。

1.5.1.3 乙酰膽堿酯酶抑制作用隨機(jī)選取4 dpf野生型AB品系斑馬魚(yú),28 ℃處理48 h后,采用乙酰膽堿酯酶測(cè)定試劑盒,利用多功能酶標(biāo)儀采集數(shù)據(jù),以斑馬魚(yú)體內(nèi)乙酰膽堿酯酶熒光值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)樣品對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用。

1.5.2 降糖藥效試驗(yàn)

1.5.2.1 模型的制備、分組與給藥采用白天給予1.5 mg·mL-1的水溶蛋黃粉溶液,晚上給予30 mg·mL-1的水溶葡萄糖溶液,建立斑馬魚(yú)高血糖模型。隨機(jī)分為正常組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和五子衍宗丸組,每組30尾,給藥組分別水溶暴露給予相應(yīng)受試藥物。血糖水平評(píng)價(jià)的陽(yáng)性藥為鹽酸吡格列酮(20.0 μg·mL-1),周?chē)窠?jīng)保護(hù)功效及周?chē)窠?jīng)炎癥消退功效評(píng)價(jià)的陽(yáng)性藥為磷酸西格列汀(350 μg·mL-1)。

1.5.2.2 對(duì)葡萄糖水平的影響隨機(jī)選取5 dpf野生型AB品系斑馬魚(yú),28 ℃處理48 h后,用水將斑馬魚(yú)清洗3遍,用血糖儀檢測(cè)斑馬魚(yú)整體葡萄糖水平。

1.5.2.3 周?chē)窠?jīng)保護(hù)功效評(píng)價(jià)隨機(jī)選取5 dpf轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元綠色熒光NBT品系斑馬魚(yú),28 ℃處理4 d后,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)置于熒光顯微鏡下拍照,以斑馬魚(yú)神經(jīng)熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)五子衍宗丸周?chē)窠?jīng)保護(hù)功效。

1.5.2.4 周?chē)窠?jīng)炎癥消退功效評(píng)價(jià)隨機(jī)選取5 dpf轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚(yú)品系與外周運(yùn)動(dòng)神經(jīng)綠色熒光斑馬魚(yú)雜交品系斑馬魚(yú),28 ℃處理4 d后,每組隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)置于熒光顯微鏡下拍照,以斑馬魚(yú)神經(jīng)周?chē)行粤＜?xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)五子衍宗丸周?chē)窠?jīng)炎癥消退功效。

1.6 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果采用mean±SE表示。用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五子衍宗丸藥效作用挖掘

2.1.1 化學(xué)成分及靶點(diǎn)收集借助BATMAN-TCM平臺(tái),收集枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車(chē)前子的成分及靶點(diǎn),去除重復(fù)值,得到相關(guān)成分118個(gè),相關(guān)靶點(diǎn)1 441個(gè)。

2.1.2 靶點(diǎn)的組織特異性如圖1所示,使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)組織定位功能,可知靶點(diǎn)作用部位可能與神經(jīng)系統(tǒng)、生殖、代謝、癌癥以及腎臟功能等相關(guān)。

圖1 疾病分類(lèi)富集結(jié)果

2.1.3 藥物-疾病通路關(guān)聯(lián)分析如圖2所示,使用DAVID平臺(tái)的GAD_DISEASE子庫(kù)、R:enrichDGN包進(jìn)行疾病富集分析,選擇P值小于0.01極其顯著富集的疾病作為分析的目標(biāo)。選擇糖尿病等10種疾病進(jìn)行通路譜關(guān)聯(lián)性分析,藥物-疾病通路關(guān)聯(lián)的原理為假定當(dāng)藥物和疾病對(duì)相同的通路都有顯著的影響時(shí),藥物對(duì)該疾病可能存在著調(diào)節(jié)作用,基于這個(gè)假設(shè)來(lái)計(jì)算藥物與疾病的關(guān)聯(lián)性。使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)檢索疾病并獲得靶點(diǎn),使用R語(yǔ)言對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集。使用R語(yǔ)言對(duì)五子衍宗丸的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集。選取富集的P值不大于0.01的通路計(jì)算藥物-疾病的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示,糖尿病和阿爾茨海默病在2個(gè)平臺(tái)富集均能排進(jìn)前10位,阿爾茨海默病評(píng)分為2.37,而糖尿病評(píng)分為2.02。確定阿爾茨海默病和糖尿病為五子衍宗丸的潛在研究方向。

圖2 GAD_DISEASE疾病富集(A)和R語(yǔ)言疾病富集(B)

2.2 藥效學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 防治阿爾茨海默病效果評(píng)價(jià)如圖3所示,六水氯化鋁處理斑馬魚(yú)后,光暗刺激下斑馬魚(yú)的每分鐘平均運(yùn)動(dòng)速度、斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)距離均下降,與模型對(duì)照組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和五子衍宗丸組可以提高斑馬魚(yú)的反應(yīng)速度和運(yùn)動(dòng)距離,表明五子衍宗丸可以改善反應(yīng)能力,恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能障礙。如圖4所示,分析不同處理組斑馬魚(yú)體內(nèi)乙酰膽堿酯酶熒光值,五子衍宗丸低、中濃度與模型對(duì)照組差異不顯著,高濃度組可顯著降低乙酰膽堿酯酶水平,表明五子衍宗丸可能通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶活性達(dá)到防治阿爾茲海默病的功效。

圖3 五子衍宗丸對(duì)斑馬魚(yú)每分鐘光暗速度差值和運(yùn)動(dòng)距離的影響

圖4 五子衍宗丸對(duì)乙酰膽堿酯酶(AchE)水平的影響

2.2.2 降糖效果評(píng)價(jià)如表1所示,蛋黃粉和葡萄糖處理斑馬魚(yú)后,葡萄糖水平明顯升高,表明造模成功,陽(yáng)性對(duì)照組和五子衍宗丸組均可降低斑馬魚(yú)葡萄糖水平。

表1 五子衍宗丸對(duì)葡萄糖水平的影響

糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥,病程10年以上患者易出現(xiàn)明顯的神經(jīng)病變臨床表現(xiàn)[7]。如圖5所示,隨機(jī)選取10尾斑馬魚(yú)置于熒光顯微鏡下拍照,統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)神經(jīng)熒光強(qiáng)度和神經(jīng)周?chē)行粤＜?xì)胞數(shù)量。在轉(zhuǎn)基因運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元綠色熒光NBT品系中,模型對(duì)照組神經(jīng)熒光強(qiáng)度降低,五子衍宗丸組神經(jīng)熒光強(qiáng)度較模型對(duì)照組增強(qiáng),表明五子衍宗丸具有保護(hù)周?chē)窠?jīng)的功效。在轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞熒光斑馬魚(yú)品系與外周運(yùn)動(dòng)神經(jīng)綠色熒光斑馬魚(yú)雜交品系中,模型對(duì)照組神經(jīng)周?chē)行粤＜?xì)胞數(shù)量增強(qiáng),五子衍宗丸組神經(jīng)周?chē)行粤＜?xì)胞數(shù)量較模型對(duì)照組降低,表明五子衍宗丸具有消退周?chē)窠?jīng)炎癥的功效。

A.斑馬魚(yú)神經(jīng)熒光強(qiáng)度典型圖;B.斑馬魚(yú)神經(jīng)周?chē)行粤＜?xì)胞典型圖;C.五子衍宗丸處理后斑馬魚(yú)神經(jīng)熒光強(qiáng)度;D.五子衍宗丸處理后斑馬魚(yú)神經(jīng)周?chē)行粤＜?xì)胞數(shù)量

3 討論與結(jié)論

五子衍宗丸由枸杞子、菟絲子、覆盆子、五味子、車(chē)前子組成,五子衍宗丸本為補(bǔ)腎填精所設(shè),在中醫(yī)辨證論治觀與“異病同治”思想的指導(dǎo)下,凡是腎虛精虧之證均可采用五子衍宗丸進(jìn)行借鑒治療[7]。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)分析及其實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,探討其在糖尿病和阿爾茨海默病的藥效學(xué)作用,以期更好地指導(dǎo)臨床應(yīng)用,為今后進(jìn)一步研究五子衍宗丸的應(yīng)用提供思路。

3.1 五子衍宗丸與糖尿病臨床研究報(bào)道表明,五子衍宗丸常和西藥聯(lián)合使用治療糖尿病性勃起功能障礙或糖尿病腎病。糖尿病性勃起功能障礙是糖尿病常見(jiàn)并發(fā)癥[8],五子衍宗丸聯(lián)合十一酸睪酮膠丸治療男性2型糖尿病合并遲發(fā)性性腺功能減退癥療效顯著[9]。在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用五子衍宗丸加味方治療脾腎虧虛兼瘀證Ⅲ期糖尿病腎病療效優(yōu)于單純西醫(yī)常規(guī)治療,在調(diào)整機(jī)體的功能狀態(tài),恢復(fù)機(jī)體正氣等方面也有顯著療效[10]。動(dòng)物體內(nèi)研究表明,五子衍宗丸加減方可以降低糖尿病大鼠的空腹血糖,促使機(jī)體恢復(fù)血糖穩(wěn)態(tài)的作用,作用可能與miR-375基因調(diào)節(jié)與胰島保護(hù)有關(guān)[11]。五子衍宗丸能減輕D-半乳糖所致的氧化損傷,抑制糖尿病性白內(nèi)障小鼠晶狀體組織多元醇通路的異?；钴S,從而改善糖尿病性白內(nèi)障小鼠晶狀體的混濁程度[12]。五子衍宗丸有效部位或活性成分的研究表明,枸杞多糖具有降低血糖,增加胰島素分泌的功效[13],菟絲子多糖能改善糖尿病大鼠糖脂代謝[14],覆盆子酮具有增加胰島素分泌,降血糖效果[15]。車(chē)前子總苷對(duì)小鼠原代胰島細(xì)胞及RINm5F胰島瘤細(xì)胞胰島損傷模型均具有治療保護(hù)作用[16]。

3.2 五子衍宗丸與阿爾茨海默病古醫(yī)籍有云,“腎精不足,則志氣衰,不能上通于心,故迷惑善忘也?！卑柎暮Ｄ∈且环N中樞神經(jīng)退行性疾病,在中醫(yī)“腎生髓,腦為髓?！钡睦碚撝笇?dǎo)下,常采用補(bǔ)腎生髓法防治癡呆[17]。采用五子衍宗顆粒治療輕度認(rèn)知障礙患者,治療組記憶指數(shù)升高[18]。五子衍宗液可以顯著改善腎虛老年男性患者腦功能,提高其瞬時(shí)記憶及邏輯故事分節(jié)記憶[19]。應(yīng)用加味五子衍宗顆粒治療輕度認(rèn)知障礙患者,治療組的記憶商均較治療前明顯提高,海馬指數(shù)和顳角寬度較治療前明顯變小[20]。動(dòng)物體內(nèi)研究表明,采用阿爾茨海默病(AD)小鼠模型,通過(guò)Morris水迷宮定位航行試驗(yàn),證明加味五子衍宗顆粒及其總黃酮、總多糖能改善AD模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力[21]。加味五子衍宗方及有效組分能改善東莨菪堿所致記憶獲得障礙模型動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶成績(jī),對(duì)中樞膽堿能系統(tǒng)損傷的學(xué)習(xí)記憶障礙有保護(hù)作用[22]。五子衍宗丸有效部位或活性成分的研究表明,枸杞多糖能增強(qiáng)老年癡呆大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能[23],菟絲子總黃酮可增強(qiáng)神經(jīng)元的可塑性和營(yíng)養(yǎng)性,以防止神經(jīng)細(xì)胞從內(nèi)源性線粒體途徑丟失或凋亡,進(jìn)而改善內(nèi)分泌衰退型癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[24]。五味子醇甲可通過(guò)減輕腦組織神經(jīng)元變性、脫失,改善突觸功能等途徑起到防治老年性癡呆的作用[25]。

3.3 斑馬魚(yú)在糖尿病及阿爾茨海默病研究中的特點(diǎn)斑馬魚(yú)是僅次于小鼠的第二大模型生物,和哺乳動(dòng)物有著相似生物結(jié)構(gòu)和功能,因其具有體積小、養(yǎng)殖成本低、易飼養(yǎng)、發(fā)育快速、繁殖力強(qiáng)、便于觀察等優(yōu)勢(shì),廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥研究領(lǐng)域[26]。斑馬魚(yú)與代謝調(diào)控相關(guān)的主要器官,如胰腺及胰島素敏感的外周組織與人類(lèi)相似,使得斑馬魚(yú)可以作為糖代謝的研究模型[27]。斑馬魚(yú)表現(xiàn)出的學(xué)習(xí)、睡覺(jué)、藥物成癮和神經(jīng)保護(hù)表型也與人類(lèi)相似[28],因此斑馬魚(yú)也是神經(jīng)藥物篩選的良好模式生物。本研究借助數(shù)據(jù)挖掘技術(shù),建立了基于斑馬魚(yú)模型的“二次開(kāi)發(fā)-活性評(píng)價(jià)”的方法,對(duì)五子衍宗丸降血糖和防治阿爾茨海默病的藥效進(jìn)行了評(píng)估,使數(shù)據(jù)挖掘與實(shí)驗(yàn)結(jié)合,有效節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間,降低實(shí)驗(yàn)成本。

本研究利用計(jì)算二次開(kāi)發(fā)的方法和斑馬魚(yú)活體試驗(yàn)結(jié)合的方法,發(fā)現(xiàn)五子衍宗丸可能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和代謝疾病產(chǎn)生影響。斑馬魚(yú)降糖藥效試驗(yàn)表明,五子衍宗丸可以降低斑馬魚(yú)葡萄糖水平并改善糖尿病神經(jīng)病變。防治阿爾茨海默病藥效試驗(yàn)表明,五子衍宗丸可以改善斑馬魚(yú)反應(yīng)能力,恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能,可能與抑制乙酰膽堿酯酶活性有關(guān)。