基于代謝組學探究疏調氣機湯治療甲狀腺功能減退癥的作用機制

郭爽,張利軍,龍小妹,古建興,劉海鵬,范源,3

(1.云南中醫(yī)藥大學中藥學院,云南 昆明 650500;2.云南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院,云南 昆明 650041;3.云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,云南 昆明 650021)

甲狀腺功能減退癥(hypothyroidism),簡稱甲減,是由于甲狀腺激素合成及分泌減少,或其生理效應不足所致機體代謝降低的一種疾病。流行病學顯示,我國甲減患病率約為17.8%,且女性患病率大于男性,隨年齡增長,患病率增加[1]。臨床多以藥物優(yōu)甲樂為主,但需長期用藥。我國是世界上認識甲狀腺疾病最早的國家[2],中醫(yī)理論中并無甲狀腺疾病的概念,將頸前喉結兩旁結塊腫大為臨床特征的疾病歸類為“癭病”范疇[3]。情志內傷、水土因素、體質因素和外感六邪導致氣滯、血瘀、痰凝結于頸部,是癭病的基本病機,臨床多以疏肝健脾、理氣和血為主。

疏調氣機湯是國醫(yī)大師張震的用藥經(jīng)方,他認為疏調人體氣機須以疏利理氣與調護脾腎相結合,提出“疏肝為體,健脾補腎為兩翼”之基本治療理念[4]。疏調氣機湯以柴胡、香附、郁金、丹參、川芎、枳實、白芍、白術、茯苓、山藥、仙靈脾、薄荷和生甘草組成,具有疏調氣機之功效,臨床甲減可用以治療氣機失調諸證[5]。甲減在中醫(yī)辨證中主要表現(xiàn)為腎陽虧虛、脾腎陽虛、心腎陽虛、氣血兩虛、陰陽兩虛等癥狀[6];疏調氣機湯治療甲減,可養(yǎng)其脾腎,補其氣虛,起到對癥治療的效果。本研究通過代謝組學探究疏調氣機湯治療甲減作用機制,可為后續(xù)單體治療甲減及甲減的臨床治療提供實驗數(shù)據(jù)及新思路。

1 材料

1.1 儀器質譜儀(Thermo Scientufic公司);Nexera X2 LC-30AD超高效液相色譜儀(Shimadzu公司);Bioruptor超聲波系統(tǒng)(Diagenode公司);Concentrator真空離心濃縮機(Eppendorf公司);5430R離心機(Eppendorf公司);MultiSkan FC可見紫外分光光度計(Thermo公司)。

1.2 試劑甲醇、乙腈、甲酸(Millipore公司);氨水(Merck公司);乙酸銨(Sigma公司);水合氯醛(天津市光復精細化工研究所);促甲狀腺激素(Thyroid Stimulating Hormone,TSH)、血清游離三碘甲狀腺原氨酸(Free Triiodothyronine,FT3)、血清游離甲狀腺素(Free Thyroxine,FT4)試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 藥物中藥飲片柴胡、香附、郁金、丹參、川芎、枳實、白芍、白術、茯苓、山藥、仙靈脾、薄荷、生甘草均購自昆明益生藥業(yè)有限責任公司,飲片均由云南中醫(yī)藥大學中藥資源教研室李宏哲副教授鑒定為臨床藥用飲片;優(yōu)甲樂(Merck KGaA公司,批號:JX20190041);丙硫氧嘧啶(上海朝暉藥業(yè)有限公司,批號:2108N13)。

1.4 動物30只SPF級雄性SD大鼠,體重均為(200±10)g,購于云南致力科技有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010,飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學動物房,大鼠生長環(huán)境為室溫25 ℃,濕度60%,自由飲水。動物實驗研究方案已經(jīng)云南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準(批準號:R-062021G088)。

2 方法

2.1 動物模型建立及給藥SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周,隨機分為正常組5只和造模組25只。造模組大鼠進行丙硫氧嘧啶(1 mg/100 g)每天灌胃給藥造模兩周。兩周后眼底靜脈取血,離心得上清,檢測TSH、FT3、FT4指標變化水平,確定模型建立成功。將造模成功大鼠隨機分為模型對照組、陽性藥(優(yōu)甲樂)組(9 μg·kg-1)、疏調氣機湯低濃度組(10.3 g·kg-1)、疏調氣機湯中濃度組(20.6 g·kg-1)、疏調氣機湯高濃度組(41.2 g·kg-1),每組5只。給藥組分別進行灌胃,正常組和模型對照組同等劑量飲用水灌胃,持續(xù)給藥6周。大鼠末次給藥后,夜間禁食12 h,自由飲水,稱重,腹腔注射水合氯醛麻醉,腹主動脈取血,靜置4 h,4 ℃,5 000 r·min-1離心取血清并分裝,-80 ℃保存。取甲狀腺組織置離心管內,液氮速凍后-80 ℃保存。

2.2 生化指標檢測大鼠腹主動脈取血,離心,取上清,試劑盒ELISA檢測FT3、FT4、TSH濃度,比較表達水平。

2.3 血清代謝組學對血清進行代謝物提取,取上清液進行LC-MS/MS檢測。色譜分析采用SHIMADZU-LC30超高效液相色譜系統(tǒng)使用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(1.7 μm,2.1 mm × 100 mm)進行分離。色譜分離條件:進樣量為3 μL,柱溫25 ℃,流速0.3 mL·min-1;流動相A:水+25 mmol·L-1乙酸銨,B:乙腈。質譜分別采用電噴霧電離(ESI)進行正離子和負離子模式檢測,樣品經(jīng)UHPLC分離后,使用QE Plus質譜儀進行質譜分析,使用HESI源進行離子化。使用MSDIAL軟件進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。對得到的數(shù)據(jù),刪除組內缺失值>50%的離子峰,對正負離子數(shù)據(jù)進行總峰面積歸一化,并整合,使用R軟件進行模式識別,數(shù)據(jù)經(jīng)Unit variance scaling(UV)預處理后,進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.4 統(tǒng)計學分析所有實驗數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學方法處理,采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件,多組間數(shù)據(jù)差異顯著性方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠模型建立體重及進食量變化每天記錄大鼠體重,同時稱重兩次灌胃之間24 h飼料重量,計算差值,觀察大鼠進食情況。造模期間,正常組與模型對照組大鼠體重均增加,但模型對照組體重增長呈均勻線性增長,正常組每天無明顯增長趨勢。模型對照組大鼠進食量明顯小于正常組,且隨著造模時間增加,進食量差異越明顯(見表1)。

表1 大鼠體重、進食表

3.2 大鼠血清指數(shù)水平變化大鼠給藥6周后血清ELISA檢測指標表達水平,與正常組相比,疏調氣機湯對甲減大鼠TSH存在明顯的降低作用,可顯著增加FT3、FT4表達水平(見圖1)。

a.TSH;b.FT3;c.FT4;C.正常組;M模型對照組;Y.陽性藥組;D.疏調氣機湯低濃度組;Z.疏調氣機湯中濃度組;G.疏調氣機湯高濃度組

3.3 大鼠血清代謝組學分析

3.3.1 血清正、負離子色譜對比大鼠血清正、負離子色譜峰3個樣本重復結果,表明代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高,信號穩(wěn)定性較好(見圖2)。

A.正離子;B.負離子

3.3.2 主成分分析偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法。該方法運用偏最小二乘回歸建立代謝物表達量與樣品類別之間的關系模型,來實現(xiàn)對樣品類別的預測。正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法,R2Y和Q2越接近于1,模型越穩(wěn)定可靠。從圖3中可見,R2Y均大于0.99,Q2均大于0.5,即表明模型穩(wěn)定,且模型的預測能力好(R2、Q2為回歸直線與Y軸的截距)。

A.PCA;B.OPLS-DA

3.3.3 差異代謝物篩選以 VIP>1,P<0.05,差異倍數(shù)(FC)>1.5 為上調, FC<0.667為下調作為篩選標準選取顯著差異代謝物。正常組與模型對照組比較,共有312個顯著差異代謝物,其中111個代謝物水平上調,198個代謝物水平下調,根據(jù)VIP值排序,比較模型對照組與正常組血清潛在標記物,對前20個代謝物進行信息匯總(見表2)。疏調氣機湯高劑量組與模型對照組比較,共有91個顯著差異代謝物,其中有47個代謝物水平上調,39個代謝物水平下調,選擇前50個血清潛在標記物作熱圖以明顯表示其變化(見圖4),顏色越紅表示相對表達量越高,越藍表示相對表達量越低。

圖4 大鼠血清差異代謝物聚類熱圖

表2 前20血清標記物信息(C vs M)

3.3.4 代謝通路分析根據(jù)“3.3.3”項下分析所得,對血清潛在標記物進行分類(見圖5),對KEGG分析所得前30條作用通路作氣泡圖(見圖6),結果顯示血清潛在標記物主要為生物堿類(alkaloids)、縮氨酸類(peptides)、聚酮類(polyketides)、脂肪?；?FA)、異戊二烯脂類(prenol lipids)等;主要作用通路為中心碳循環(huán)、氨基酸生物合成、膽汁分泌等信號通路。

圖5 差異代謝物KEGG分類環(huán)形圖

圖6 KEGG富集通路氣泡圖

4 討論

相關研究表明,部分中藥方劑對甲減具有良好的治療作用:海藻玉壺湯可明顯改善甲狀腺腫大,保護肝腎功能[7-8];右歸丸可明顯改善甲減陽虛證大鼠癥狀,起到溫腎壯陽、滋補精血的作用[9];芪桂湯通過調節(jié)下丘腦-垂體-甲狀腺軸,發(fā)揮其補腎助陽、益氣健脾功效,對甲減大鼠起到治療作用[10]。經(jīng)實驗結果顯示,疏調氣機湯能明顯降低大鼠血清TSH表達水平,升高FT3、FT4表達水平,改善甲減表征,存在較好的治療效果。相關文獻表明,FT3、FT4、TSH可視為甲減的最佳生物標記物[11],即表明本實驗所用血清標記物可作為治療效果評估的指標[12]。

疏調氣機湯具有疏肝理氣、健脾補腎,輔以活血清熱、化痰消積功效,方中柴胡疏肝解郁、調達氣血;香附、郁金疏肝行氣,增強柴胡之功;丹參活血祛瘀;川芎活血行氣;茯苓與白術健脾益氣、燥濕利水;薄荷疏肝行氣,枳實破氣寬中,增強疏調氣機之功;仙靈脾溫補腎陽,與茯苓、白術調護先后天之本;生甘草調和諸藥,緩和藥性;白芍養(yǎng)血斂陰、平肝柔肝,與甘草配伍,則“酸甘化陰”更能發(fā)揮其柔肝養(yǎng)血緩急之作用。諸藥共奏疏肝解郁、調補脾腎、理氣和血之功效,適用于肝氣郁結、氣機失暢、脾腎不足之疾病[13]。

在本研究中,疏調氣機湯對甲減大鼠血清內代謝組分析,主要代謝物TOP 5分別是花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)、麥角克堿、半乳糖醛酸、α-酮戊二酸?；ㄉ南┧崾侨梭w大腦和視神經(jīng)發(fā)育的重要物質,在體內可誘導血小板聚集和刺激脂多糖[14],具有抗炎[15]、影響脂代謝等作用[16];DHA在大腦及神經(jīng)發(fā)育中起到作用,具有抗炎、促凋亡等藥理作用[17-18];麥角克堿臨床常用于治療閉經(jīng)、月經(jīng)不調、雄性激素低下等疾病治療[19];半乳糖醛酸具有抗氧化等活性[20];α-酮戊二酸為三羧酸循環(huán)的中間產物,具有抗癌[21]、抗氧化[22]等藥理作用,以上變化說明疏調氣機湯在治療甲減的治療機制中,可影響三羧酸循環(huán)、神經(jīng)遞質代謝、脂代謝等,提示疏調氣機湯對甲減的治療作用多以調節(jié)抗炎、抗氧化代謝為主。

綜上,疏調氣機湯對甲減具有良好的治療作用,通過對大鼠血清潛在標記物分析,疏調氣機湯可調節(jié)部分血清標記物變化,可在一定程度上影響大鼠代謝,起到抗炎等藥物活性,進而發(fā)揮治療作用;利用血清標記物對機制進行預測,涉及多條作用機制,其具體機制還需深入探究。本實驗為甲減臨床治療及疏調氣機湯應用提供實驗數(shù)據(jù),可為后續(xù)相關實驗提供新思路。