多年生黑麥草的防御機(jī)制對(duì)模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫的響應(yīng)

邱 萍，凌顯容，郭 巧，胡 霞*

(1.樂(lè)山市實(shí)驗(yàn)中學(xué)，四川樂(lè)山 610040；2.樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂(lè)山 614000)

酸雨是指pH 值小于5.6 的降水，是因人類(lèi)活動(dòng)或自然災(zāi)害（森林火災(zāi)、火山爆發(fā)等）導(dǎo)致降水酸化的一種污染現(xiàn)象[1]。中國(guó)酸雨主要分布在四川盆地及長(zhǎng)江以南、青藏高原以東的大部分地區(qū)。酸雨不僅對(duì)植被產(chǎn)生直接影響，還造成水源及土壤酸化，帶來(lái)嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題[2]。近年來(lái)，由于工業(yè)活動(dòng)、城市化進(jìn)程的快速發(fā)展，以及污水灌溉、施用劣質(zhì)肥料等農(nóng)業(yè)活動(dòng)，重金屬污染問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重。在所有非植物必需的重金屬元素中，鎘容易在人體內(nèi)聚集，最難以修復(fù)也最引人關(guān)注。據(jù)普查，目前全國(guó)約有1.3萬(wàn)hm2耕地遭受鎘污染，有些地區(qū)的農(nóng)田污染嚴(yán)重超標(biāo)[3]。重金屬進(jìn)入土壤后被植物吸收，不僅影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)通過(guò)食物鏈積累，最終危害人類(lèi)健康。酸雨與土壤中重金屬有效態(tài)含量的多少有一定程度的關(guān)系，在酸雨作用下，土壤中重金屬在一定程度上被活化，加重了對(duì)植物的損害。此外，重金屬也會(huì)加重酸雨對(duì)植物的傷害。在我國(guó)，酸雨和鎘污染對(duì)土壤造成的環(huán)境問(wèn)題非常嚴(yán)重，并且我國(guó)酸雨區(qū)與重金屬污染區(qū)有很大程度重疊。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)酸雨和鎘單一脅迫的研究均較多，但對(duì)兩者的復(fù)合脅迫研究相對(duì)較少。

多年生黑麥草是禾本科黑麥草屬草本植物，在我國(guó)長(zhǎng)江流域、四川、貴州、湖南、云南等地生長(zhǎng)良好，具有生長(zhǎng)快、生物量大、根系發(fā)達(dá)、適應(yīng)性強(qiáng)、耐酸等優(yōu)點(diǎn)，并且對(duì)銅、鎘、鉛和鋅等多種重金屬均有一定的耐性，可在重金屬?gòu)?fù)合污染的土壤上正常生長(zhǎng)[4]。因此，本試驗(yàn)以多年生黑麥草為材料，研究其種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)生理對(duì)酸雨和鎘復(fù)合脅迫的響應(yīng)，為修復(fù)酸雨和鎘污染的土壤及環(huán)境治理提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 模擬酸雨和氯化鎘溶液的配制

模擬酸雨的配制：根據(jù)四川地區(qū)歷年的降雨酸度，參照文獻(xiàn)配制模擬酸雨[5-7]。按SO42-∶NO3-為8∶1(V/V)，配成pH值1.0的酸雨母液，使用時(shí)以蒸餾水稀釋?zhuān)柚鷓HS-3C 型精密酸度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）用稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液調(diào)配模擬酸雨的pH值分別為2.5、6.0、7.0。

氯化鎘溶液的配制：先配制1 g·L-1的氯化鎘母液，然后用蒸餾水分別稀釋標(biāo)定后的母液，配制氯化鎘溶液濃度分別為0、0.5、20.0 mg·L-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選大小一致、種胚完好、籽粒飽滿(mǎn)的多年生黑麥草種子（Lolium perenne L.），用1 g·L-1氯化汞溶液浸泡10 min 消毒，然后用大量蒸餾水反復(fù)沖洗，瀝干水分后將100 粒多年生黑麥草種子均勻擺放在直徑為12 mm、墊有3層濾紙的培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)皿和濾紙事先經(jīng)滅菌處理后冷卻至室溫）。每個(gè)培養(yǎng)皿分別倒入不同濃度的模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫溶液10 mL。復(fù)合脅迫處理為：pH 值6.0+Cd 0.5 mg·L-1（處理Ⅰ），pH 值6.0+Cd 40.0 mg·L-1（處理Ⅱ），pH 值3.0+Cd 0.5 mg·L-1（處理Ⅲ），pH 值3.0+Cd 40 mg·L-1（處理Ⅳ），pH 值7.0+Cd 0 mg·L-1（CK）。每個(gè)處理重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿放于20 ℃的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每2 d添加1次相應(yīng)濃度的脅迫溶液。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 種子發(fā)芽統(tǒng)計(jì)

種子發(fā)芽統(tǒng)計(jì)以突破種皮的胚軸長(zhǎng)度達(dá)到種子自身的長(zhǎng)度為標(biāo)準(zhǔn)，從試驗(yàn)第3 d 開(kāi)始統(tǒng)計(jì)每皿發(fā)芽的種子數(shù)。試驗(yàn)開(kāi)始第7 d 計(jì)算不同處理下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)[8]。發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)的計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率（GR）=（n/N）×100%（1），式中n 為最終達(dá)到的正常發(fā)芽粒數(shù)，N為供試種子數(shù)；

發(fā)芽勢(shì)（GP）=（n3/N）×100%（2），式中n3為種子發(fā)芽第3 d的正常發(fā)芽粒數(shù)，N為供試種子數(shù)；

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（G7/D7），式中G7為在第7 d的發(fā)芽數(shù)，D7為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.3.2 幼苗生長(zhǎng)量的測(cè)定

試驗(yàn)開(kāi)始第7 d 每皿隨機(jī)選擇10 粒發(fā)芽的多年生黑麥草，測(cè)定地上生物量（芽質(zhì)量）、地下生物量（根質(zhì)量）和總生物量（芽質(zhì)量+根質(zhì)量）。

1.3.3 幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)開(kāi)始第15 d 隨機(jī)采集不同濃度脅迫的多年生黑麥草幼苗葉片，采用丙酮浸提法用T6新悅可見(jiàn)光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）進(jìn)行葉綠素含量的測(cè)定；采用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定丙二醛（MDA）含量；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性；采用DDS-307 電導(dǎo)率儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率[9-10]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2017 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖；用SPSS 13.0 進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），最小顯著差異法（LSD）比較組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫對(duì)多年生黑麥草種子萌發(fā)的影響

從表1 可以看出，隨著鎘脅迫的加劇，多年生黑麥草種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均逐漸降低。而隨著模擬酸雨脅迫的加劇，種子發(fā)芽卻沒(méi)有表現(xiàn)出規(guī)律的變化趨勢(shì)。低濃度的鎘和弱酸復(fù)合脅迫下（處理Ⅰ）種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)均高于對(duì)照組，表明此處理不但未對(duì)植物造成傷害，反而對(duì)多年生黑麥草種子萌發(fā)具有一定的促進(jìn)作用。高濃度的鎘和強(qiáng)酸的復(fù)合脅迫（處理Ⅳ）下，多年生黑麥草種子的發(fā)芽勢(shì)比對(duì)照降低了75.9%，發(fā)芽率下降了19.5%，發(fā)芽指數(shù)下降了45.3%，差異達(dá)到顯著水平（p＜0.05），種子萌發(fā)受到明顯抑制。

表1 多年生黑麥草種子萌發(fā)對(duì)模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫的響應(yīng)

2.2 模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫對(duì)多年生黑麥草生物量的影響

從表2 可知，不同濃度的模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫處理均降低了多年生黑麥草地上生物量、地下生物量和總生物量。同一濃度酸雨脅迫下，隨著鎘脅迫的加劇，多年生黑麥草生物量逐漸降低。強(qiáng)酸脅迫時(shí)（pH=3.0），重度鎘脅迫（處理Ⅳ）使多年生黑麥草總生物量比輕度鎘脅迫（處理Ⅲ）降低了60.6%。同時(shí)，同一濃度鎘脅迫下，隨著酸脅迫的加劇多年生黑麥草生物量也呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，然而差異不顯著。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，模擬酸雨和鎘污染的復(fù)合脅迫均抑制了多年生黑麥草幼苗的生長(zhǎng)，相比于對(duì)照，處理Ⅳ復(fù)合脅迫使多年生黑麥草地上生物量降低了65.2%，地下生物量降低了73.3%，總生物量降低了67.5%，差異達(dá)顯著水平（p＜0.05）。

表2 多年生黑麥草生物量對(duì)模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫的響應(yīng)

2.3 模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫對(duì)多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量的影響

從表3 可知，低濃度的酸和鎘復(fù)合脅迫處理（處理Ⅰ）增加了多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量，促進(jìn)了葉片葉綠素的合成。在相同H+濃度的酸脅迫下，隨Cd濃度升高葉綠素含量降低。然而在相同濃度鎘脅迫下，隨著酸脅迫的加劇多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量卻并沒(méi)發(fā)生改變。高濃度的酸和鎘脅迫下（處理Ⅳ）葉綠素含量最低，為1.1 mg·g-1，顯著低于對(duì)照（p＜0.05）。

表3 多年生黑麥草葉綠素含量、細(xì)胞膜透性和過(guò)氧化物酶活性對(duì)模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫的響應(yīng)

2.4 模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫對(duì)多年生黑麥草細(xì)胞膜的影響

從表3 可以看出，不同濃度模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫下多年生黑麥草幼苗葉片丙二醛（MDA）含量均高于對(duì)照組。低濃度鎘脅迫時(shí)（處理Ⅰ和處理Ⅲ）丙二醛含量?jī)H分別比對(duì)照增加了23.5%和6.7%，高濃度鎘脅迫（處理Ⅱ和處理Ⅳ）下丙二醛含量則分別比對(duì)照增加了29.9%和49.5%。高濃度酸和鎘復(fù)合脅迫（處理Ⅳ）使黑麥草幼苗丙二醛含量達(dá)到最高值，為14.5 mmol·g-1，顯著高于對(duì)照（p＜0.05）。

和對(duì)照相比，兩種不同H+濃度的酸脅迫下低濃度鎘脅迫（處理Ⅰ和處理Ⅲ）沒(méi)有改變多年生黑麥草幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率值（表3）；而高濃度的鎘脅迫（處理Ⅱ和處理Ⅳ）均增加了多年生黑麥草葉片相對(duì)電導(dǎo)率值，差異達(dá)顯著水平（p＜0.05）。處理Ⅱ脅迫下幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)12.9%，處理Ⅳ達(dá)13.9%，分別比對(duì)照增加了12.6%和21.2%。

2.5 模擬酸雨和鎘復(fù)合脅迫對(duì)多年生黑麥草過(guò)氧化物酶活性的影響

與對(duì)照相比，低濃度的酸脅迫和鎘脅迫（處理Ⅰ）并未顯著改變多年生黑麥草幼苗葉片過(guò)氧化物酶（POD）活性。同一H+濃度的模擬酸脅迫下，隨著鎘脅迫的加劇多年生黑麥草POD 活性逐漸降低。弱酸脅迫時(shí)（pH=6.0），重度鎘脅迫（處理Ⅱ）使多年生黑麥草POD活性比輕度鎘脅迫（處理Ⅰ）下降了13.8%；強(qiáng)酸脅迫時(shí)（pH=3.0），重度鎘脅迫（處理Ⅳ）的POD 活性比輕度鎘脅迫（處理Ⅲ）降低了2.7%（表3）。同時(shí)，在同一低濃度鎘脅迫下，隨著酸脅迫的加劇多年生黑麥草POD 活性也呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，高濃度的鎘和不同H+濃度的模擬酸雨復(fù)合脅迫（處理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）均顯著抑制了POD 活性（p＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

全球普遍存在著兩種非生物脅迫：酸雨和重金屬脅迫。酸雨和有毒重金屬污染土壤時(shí)具有隱藏深、作用期長(zhǎng)、傷害不可逆等特點(diǎn)，這些特性會(huì)導(dǎo)致土壤缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，植株無(wú)法從土壤中獲取生長(zhǎng)發(fā)育所需的成分[11]。對(duì)于植物而言，早在植株幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，植株就表現(xiàn)出了對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力，這個(gè)階段是植株適應(yīng)外界環(huán)境的關(guān)鍵期，對(duì)植株自身的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用[12]。植物種子的萌發(fā)和早期生物量的變化情況就可以反映出酸雨和重金屬污染對(duì)其生長(zhǎng)的影響，以往的研究顯示，超出植株適應(yīng)范圍的重金屬會(huì)使植株幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育受到一定程度抑制。本研究中，低濃度的酸雨和鎘復(fù)合脅迫促進(jìn)了黑麥草種子的萌發(fā)，而高濃度的復(fù)合脅迫明顯抑制了種子萌發(fā)，這與之前的一些研究結(jié)果“低促高抑”現(xiàn)象相同。然而，不同濃度酸雨和鎘復(fù)合脅迫均抑制了多年生黑麥草植株生長(zhǎng)，高濃度酸雨和鎘脅迫（pH 值3.0+Cd 40 mg·L-1）下黑麥草生物量顯著降低，這與代杰等對(duì)水芹耐Pb性的研究得出的結(jié)論一致，高濃度的重金屬脅迫會(huì)對(duì)水芹的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生明顯的抑制作用[13]。

葉綠素含量的變化對(duì)植物的光合作用有很大的影響，既可反映植物葉片光合作用功能的強(qiáng)弱，也可用以表征逆境脅迫下植物組織、器官的衰老狀況。葉綠素降低會(huì)導(dǎo)致植物光合作用逐漸減弱，從而導(dǎo)致植物在此階段的生長(zhǎng)受阻。本研究中，葉綠素含量與生物量的變化規(guī)律相似，即低濃度的復(fù)合脅迫促進(jìn)了葉綠素的合成，而高濃度的復(fù)合脅迫顯著降低了葉綠素的含量，這與劉英杰等的研究結(jié)論類(lèi)似[14]。有研究認(rèn)為，不同品種作物葉片中的葉綠素含量隨重金屬濃度的升高呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)。這一研究也表明了酸和重金屬對(duì)植物葉綠素具有“低促進(jìn)高抑制”影響[15]。推測(cè)造成本研究中這種變化趨勢(shì)的可能原因是：低濃度的酸和鎘處理提高了葉綠素酸酯還原酶的活性和氨基-γ-酮戊酸的含量[16]，使多年生黑麥草幼苗葉片葉綠素含量逐漸增多；而高濃度的酸和鎘處理使鐵離子無(wú)法進(jìn)入葉綠素，阻礙了合成葉綠素的有效途徑[17]。

植物細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境的邊界，也是細(xì)胞與外界間進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸、能量交換和信息傳遞的重要場(chǎng)所。當(dāng)植物遇到逆境時(shí)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到損傷，膜脂過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的高活性最終產(chǎn)物MDA持續(xù)破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，致使電解質(zhì)滲出引起組織浸泡液的電導(dǎo)率值發(fā)生變化。脅迫程度愈大，脂質(zhì)過(guò)氧化程度越大，MDA 含量越高，相對(duì)電導(dǎo)率也就越高。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度酸和鎘復(fù)合脅迫顯著增加了多年生黑麥草幼苗葉片MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率。這與大多數(shù)已有的研究結(jié)果相似，各種非生物脅迫如干旱、酸雨、重金屬等都使植株的MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率顯著提高[15,18-19]。

通常膜脂過(guò)氧化還伴隨有活性氧產(chǎn)生，而植物體內(nèi)的各種氧化酶就組成了一個(gè)有效的活性氧消除酶系統(tǒng)。POD 是一類(lèi)活性較高的氧化還原酶，廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)，與植物的呼吸作用、光合作用等都有關(guān)系，尤其作為植物體內(nèi)消除自由基傷害防護(hù)酶系成員之一，與植物的抗逆境能力密切相關(guān)。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，隨著模擬酸雨和鎘脅迫的加劇，多年生黑麥草植株體內(nèi)POD 活性逐漸下降，在高鎘脅迫下，下降尤為明顯，這與孫天國(guó)等在毛尖紫萼蘚和楊盛昌等在桐花樹(shù)上的研究結(jié)果相同[20-21]?？赡苁且?yàn)殡S著脅迫的加劇，多年生黑麥草體內(nèi)產(chǎn)生了大量的過(guò)氧化物，而POD 的消除能力有限，使細(xì)胞受到傷害，致使POD活性下降。

3.2 結(jié)論

綜上所述，低濃度的酸雨和鎘復(fù)合脅迫促進(jìn)了多年生黑麥草種子的萌發(fā)和幼苗葉綠素的合成，而高濃度的酸雨和鎘復(fù)合脅迫顯著抑制了多年生黑麥草種子的萌發(fā)和植株的生長(zhǎng)，明顯降低了幼苗生物量和葉綠素含量，表現(xiàn)出一定的“低促高抑”現(xiàn)象。為了適應(yīng)逆境，黑麥草幼苗植株P(guān)OD 酶活性隨著模擬酸雨和鎘脅迫的加劇而明顯降低，而MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率則顯著增加。