結(jié)直腸癌組織中miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白的表達變化及其意義

周嬋，冼麗英，李娜，盧碧燕，袁錦玉

1 南方醫(yī)科大學第十附屬醫(yī)院/東莞市人民醫(yī)院病理科，廣東 東莞 523000；2 東莞職業(yè)技術(shù)學院

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是全球范圍內(nèi)發(fā)病率位居第3位的惡性腫瘤，有統(tǒng)計顯示我國2020年CRC新發(fā)患者人數(shù)超過55萬，且近年呈現(xiàn)出增加趨勢［1］。盡管近年來CRC診療技術(shù)和方法不斷改進和提高，但許多患者的預后仍然不盡人意［2-3］。CRC早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，患者的預后與確診時的臨床分期等病理特征密切相關(guān)，尋找CRC早期診斷、預后判斷的生物學標志物，并采取針對性干預措施，對于改善患者預后具有至關(guān)重要意義［4］。在CRC發(fā)生發(fā)展過程中，多種蛋白、微小RNA（miRNA）、基因等參與其中，并在病變組織中異常表達［5］。miR-138-5p、miR-876-5p均為近年發(fā)現(xiàn)的具有抑癌作用的非編碼RNA，其中miR-138-5p可與癌基因的RNA序列直接結(jié)合，對癌蛋白的表達發(fā)揮明顯的抑制作用［6］，在肝癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤組織中呈低表達［7］。miR-876-5p可調(diào)控細胞的分化、凋亡及腫瘤形成，可抑制肝癌細胞的進展［8］，作為一種抑癌因子，在肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌等組織中低表達［9］。DNA損傷結(jié)合蛋白1和CUL4相關(guān)因子（DDB1- and CUL4-associated factor，DCAF）是人體維持生長發(fā)育的蛋白質(zhì)家族，DCAF7蛋白是該家族重要成員，主要參與調(diào)控細胞的增殖和分化等生命活動，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10］。本研究通過檢測CRC組織中miR-138-5p、miR-876-5p及DCAF7蛋白的表達情況，分析三者與CRC患者臨床病理參數(shù)及預后的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇南方醫(yī)科大學第十附屬醫(yī)院（東莞市人民醫(yī)院）2015年2月—2018年2月期間收治的CRC患者98例，男性52例、女性46例，年齡39～82 歲，平均（59.29 ± 8.37）歲，其中腫瘤位于結(jié)腸58例、直腸40例，腫瘤最大徑≥4 cm者51例、＜4 cm者47例，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，TNM分期Ⅰ期16例、Ⅱ期21例、Ⅲ期32例、Ⅳ期29例，分化程度低分化42例、中分化33例、高分化23例，浸潤深度T1+T2者36例、T3+T4者62例。患者均接受手術(shù)切除治療，術(shù)中留取CRC組織和癌旁組織，癌旁組織標本距離手術(shù)切緣距離＞3 cm，且病理檢查未發(fā)現(xiàn)癌細胞［12］。術(shù)中取得病理標本后迅速置于液氮罐中臨時儲存，之后送到病理科應(yīng)用-80 ℃冰箱儲存。納入標準：①符合《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2020年版）》［11］相關(guān)診斷標準，并經(jīng)手術(shù)病理確診；②首次診斷為CRC，未接受其他相關(guān)治療；③均于本院接受手術(shù)治療；④病歷資料完整。排除標準：①合并其他臟器惡性腫瘤；②合并潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn病、非腫瘤性息肉等其他結(jié)直腸疾病；③手術(shù)禁忌癥；④既往有結(jié)直腸手術(shù)史；⑤合并嚴重感染、嚴重內(nèi)科疾病、自身免疫性疾病或未有效控制的精神類疾?。虎奕虢M前已接受放化療或生物治療。本研究符合世界醫(yī)學大會《赫爾辛基宣言》相關(guān)倫理要求，并獲得醫(yī)院倫理審查、通過，批準文號：KYKT2019-038。

1.2 CRC組織和癌旁組織中miR-138-5p、miR-876-5p檢測及分析方法 采用Real-time PCR法。取CRC組織和癌旁組織標本，研磨后TRIzol法提取總RNA，應(yīng)用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，得到第一鏈cDNA，以cDNA為模板，熒光定量PCR反應(yīng)進行擴增，PCR引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，引物序列如下： miR-138-5p上游引物為5'-GTCGAGGAAGTTGTTCGTGGTG-3'，下游引物為5'-TCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'，miR876-5p上游引物為5'-TGAAGTGCTGTGGATTTCTTTGTG-3'，下游引物為5'-TGAATTACTTTGTAAACCACCACCA-3'，內(nèi)參基因U6上游引物為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT -3'，下游引物為3'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-5'。反應(yīng)程序：95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，63 ℃、30 s，72 ℃、15 s，共進行40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。以CRC組織中miR-138-5p、miR-876-5p相對表達量的中位數(shù)為臨界值，將98例CRC患者分為miR-138-5p高表達組、miR-138-5p低表達組和miR-876-5p高表達組、miR-876-5p低表達組，并分析miR-138-5p、miR-876-5p相對表達量與CRC患者預后的關(guān)系［9］。

1.3 CRC組織和癌旁組織中DCAF7蛋白檢測及分析方法 采用蛋白印跡法。取CRC組織和癌旁組織標本，RIPA裂解緩沖液提取組織細胞全蛋白，BCA法測定濃度并定量，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下應(yīng)用5%脫脂奶粉封閉45 min，結(jié)束封閉后與1∶1000稀釋的一抗DCAF7和1∶5000稀釋的GAPDH 4 ℃環(huán)境下孵育過夜。第二日應(yīng)用緩沖液清洗10 min，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶10000），室溫下孵育60 min，緩沖液沖洗后化學顯色，采集圖像，分析灰度值，以DCAF7灰度值/GAPDH灰度值的比值表示DCAF7蛋白相對表達量。以CRC組織中DCAF7蛋白相對表達量的中位數(shù)為臨界值，將98例CRC患者分為DCAF7蛋白高表達組、DCAF7蛋白低表達組，并分析DCAF7蛋白相對表達量與CRC患者預后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料呈正態(tài)分布時以±s表示，比較用配對t檢驗；計數(shù)資料比較用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier生存分析法分析miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相對表達量與CRC患者預后的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織和癌旁組織中miR-138-5p、miR-876-5p相對表達量比較 CRC組織中miR-138-5p、miR-876-5p相對表達量分別為1.36 ± 0.29、1.41 ±0.36，癌旁組織中miR-138-5p、miR-876-5p相對表達量分別為2.15 ± 0.48、2.08 ± 0.44，兩者相比，P均＜0.05。

2.2 CRC組織和癌旁組織中DCAF7蛋白相對表達量比較 CRC組織中DCAF7蛋白相對表達量為0.59 ± 0.19，癌旁組織中DCAF7蛋白相對表達量為0.20 ± 0.08，兩者相比，P＜0.05。

2.3 miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相對表達量與CRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相對表達量與CRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。由表1可知，miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相對表達量與CRC患者是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤深度有關(guān)（P均＜0.05），與性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度無關(guān)（P均＞0.05）。

表1 miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相對表達量與CRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相對表達量與CRC患者預后的關(guān)系 以CRC組織中miR-138-5p相對表達量的中位數(shù)1.36為臨界值進行分組，其中miR-138-5p高表達組43例、miR-138-5p低表達組55例。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，miR-138-5p低表達組3年總體生存率為67.3%（37/55），miR-138-5p高表達組3年總體生存率為86.6%（37/43），兩組間患者3年總體生存率相比，P＜0.05。以CRC組織中miR-876-5p相對表達量的中位數(shù)1.41為臨界值進行分組，其中miR-876-5p高表達組47例、miR-876-5p低表達組51例。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，miR-876-5p低表達組3年總體生存率為66.7%（34/51），miR-876-5p高表達組3年總體生存率為85.1%（40/47），兩組間患者3年總體生存率相比，P＜0.05。以CRC組織中DCAF7蛋白相對表達量的中位數(shù)0.59為臨界值進行分組，其中DCAF7蛋白高表達組58例、DCAF7蛋白低表達組40例。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，DCAF7蛋白高表達組3年總體生存率為67.2%（39/58），DCAF7蛋白低表達組3年總體生存率為87.5%（35/40），兩組間患者3年總體生存率相比，P＜0.05。

3 討論

CRC是威脅人類生存和健康的惡性腫瘤之一，患者的生活方式、遺傳因素及發(fā)生于結(jié)直腸腺瘤是促進該病發(fā)生的重要因素，個體的基因突變，包括染色體突變和脫氧核糖核酸錯搭配修復也是CRC發(fā)生的病因［12］。近年來盡管腫瘤放化療、免疫治療、靶向治療得到突飛猛進的發(fā)展，但對于多數(shù)中晚期患者已發(fā)生局部擴散和遠處轉(zhuǎn)移，其治療效果仍然不理想［13］。CRC發(fā)病機制復雜，目前尚未完全闡明，對CRC發(fā)病的分子機制進行深入探討，尋找敏感的生物標志物，對于CRC的早期篩查和針對性治療具有重要意義。

miRNA是一種非編碼單鏈小分子RNA，其序列較短，無編碼蛋白質(zhì)功能，可與靶基因mRNA分子3′端非翻譯區(qū)定位點結(jié)合，導致mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后基因沉默，從而發(fā)揮對惡性腫瘤細胞增殖、分化、凋亡等生理過程的調(diào)控作用，促進腫瘤進展［14-15］。miR-138-5p位于染色體Xq38.13，作為一種抑癌基因，miR-138-5p在食管鱗癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中低表達。研究［16］發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p可與腫瘤細胞的叉頭盒C1結(jié)合，并下調(diào)叉頭盒C1表達，抑制腫瘤的增殖。在肺癌組織中，miR-138-5p可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶8的表達，增加G0/G1期細胞數(shù)量，抑制細胞的生長［17］。國外研究［18］也發(fā)現(xiàn)，CRC組織中miR-138-5p表達降低，且與腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移情況及TNM分期密切相關(guān)，且miR-138-5p低表達的CRC患者生存期短于高表達患者。miR-876-5p是位于人類9號染色體短臂21.1部位的小分子RNA，同樣作為一種抑癌因子，miR-876-5p低表達于消化系統(tǒng)腫瘤、肺癌、星形細胞瘤等惡性腫瘤，上調(diào)miR-876-5p表達，可抑制胃癌細胞的增殖，促進其凋亡，減緩星形細胞瘤的進展［19-20］。李程等［21］的研究表明，上調(diào)結(jié)腸癌組織中miR-876-5p表達可靶向下調(diào)配對盒基因6的表達，抑制結(jié)腸細胞的增殖，降低結(jié)腸癌組織侵襲和遷移能力。DCAF蛋白是由40～60個氨基酸組成的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，可與DNA損傷結(jié)合蛋白1、CUL4相關(guān)因子構(gòu)成E3泛素連接酶，對靶蛋白進行泛素化修飾，參與細胞的分化、凋亡等生命活動，并在惡性腫瘤發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用［10］。DCAF7蛋白是DCAF家族的重要成員，可與磷酸化調(diào)節(jié)激酶1A作用，維持該酶的穩(wěn)定性，參與細胞增殖、分化的平衡調(diào)節(jié)［22］。金一鳴等［23］研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中DCAF7蛋白呈顯著高表達，且與患者的部分臨床病理特征密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，CRC組織中miR-138-5p、miR-876-5p相對表達量低于癌旁組織，DCAF7蛋白相對表達量高于癌旁組織，CRC組織中miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白表達與淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤深度等臨床病理特征密切相關(guān)，進一步表明miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白可能通過不同的機制調(diào)節(jié)CRC組織的增殖、遷移、侵襲等生物行為，在CRC的發(fā)生和病情進展中發(fā)揮了重要作用，并且與CRC病灶的惡性度密切相關(guān)；生存分析發(fā)現(xiàn)miR-138-5p低表達、miR-876-5p低表達、DCAF7蛋白高表達患者3年總體生存率分別高于miR-138-5p高表達、miR-876-5p高表達、DCAF7低表達患者。因此，miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白表達情況與CRC患者預后相關(guān)，均為CRC患者預后的影響因素，三項指標可作為CRC患者預后評估的生物學指標，并有望成為CRC臨床治療和藥物開發(fā)的新的靶點。但miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白在CRC發(fā)病和進展中的具體機制和作用靶點尚未闡明，可作為進一步研究的方向。

綜上所述，CRC組織中miR-138-5p低表達、miR-876-5p低表達、DCAF7蛋白高表達，miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相對表達量與CRC患者是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤深度有關(guān)。miR-138-5p低表達、miR-876-5p低表達、DCAF7蛋白高表達的CRC患者術(shù)后3年總體生存率低。