姜黃素灌胃對(duì)脂肪肝大鼠腸黏膜屏障損傷的改善作用及其機(jī)制

侯洪濤，張建，裘艷梅，李蘋蘋，鄭吉敏，王玉珍，劉改芳

1 河北省人民醫(yī)院消化科，石家莊 050051；2 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院兒科

長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)引起高血脂、高血糖、非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）、肥胖等多種疾?。?］。NAFLD是以肝臟脂質(zhì)蓄積為病理改變的肝臟代謝性疾病［2］。隨著人們飲食及生活方式的改變，NAFLD發(fā)病率逐年升高，流行病學(xué)調(diào)查［3］顯示，NAFLD的全球患病率約為25.24%?！澳c—肝軸”概念的提出為尋找肝病的發(fā)病機(jī)制和診療方法提供了新思路。NAFLD時(shí)常伴有腸黏膜屏障損傷，腸黏膜屏障損傷會(huì)加快NAFLD的病理生理進(jìn)程［4］。NAFLD時(shí)腸黏膜氧化應(yīng)激水平的升高是腸黏膜損傷的重要機(jī)制之一。核因子-E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2， Nrf2）是體內(nèi)抵御氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子，抗氧化反應(yīng)元件可以與Nrf2結(jié)合，上調(diào)Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)，改善機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)［5］。血紅素加氧酶-1（hemeoxygenase-1， HO-1）是一種抗氧化酶，能夠?qū)辜?xì)胞的氧化應(yīng)激［6］。姜黃素是從植物姜黃中提取的疏水性多酚，現(xiàn)代藥理研究表明姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用［7］。2020年6—10月，我們觀察了姜黃素灌胃對(duì)脂肪肝大鼠腸黏膜屏障損傷的改善作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 姜黃素、大鼠、試劑及儀器 姜黃素購自美國(guó)Sigma公司。SPF級(jí)雄性SD大鼠45只，大鼠體質(zhì)量190 ± 20 g克，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（冀）2018-004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、普通飼料及高脂飼料（10%豬油+2%膽固醇+0.5%膽鹽+87.5%普通飼料）均購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SOD試劑盒和MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司；脂多糖（lipopolysaceharide， LPS）試劑盒購自湛江安度斯公司；二胺氧化酶（diamine oxidase， DAO）試劑盒購自美國(guó)Sigma公司；兔抗Nrf2多克隆抗體購自美國(guó)Bioworld公司；小鼠抗HO-1單克隆抗體購自武漢三鷹公司；兔抗β-actin單克隆抗體購自上海Abways公司；山羊抗兔IgG二抗購自柏奧易杰（北京）科技有限公司；山羊抗小鼠IgG二抗購自柏奧易杰（北京）科技有限公司。電子天平購自德國(guó)Sartorius公司，高速離心機(jī)購自德國(guó)Eppendorf公司，轉(zhuǎn)移脫色搖床購自海門其林貝爾儀器制造公司，電泳儀購自北京六一儀器廠，低溫離心機(jī)購自德國(guó)Eppendorf公司，垂直電泳槽購自北京六一儀器廠，醫(yī)用X射線膠片購自美國(guó)柯達(dá)公司，石蠟病理切片機(jī)購自德國(guó)LEIKA公司，光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 脂肪肝大鼠模型制備、分組、姜黃素給予方法 SD大鼠45只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組，應(yīng)用普通飼料喂養(yǎng)。其余35只繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，每周測(cè)量大鼠體質(zhì)量，建立脂肪肝模型。8周后，隨機(jī)處死5只高脂喂養(yǎng)大鼠，通過肝組織切片確認(rèn)脂肪肝模型制備成功。高脂喂養(yǎng)的其余30只大鼠進(jìn)一步分為模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組，每組10只。姜黃素溶于1%的羧甲基纖維素鈉，模型組繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)；姜黃素低劑量組在髙脂喂養(yǎng)的同時(shí)給予200 mg/（kg·d）姜黃素灌胃，每日1次；姜黃素高劑量組在髙脂喂養(yǎng)的同時(shí)給予400 mg/（kg·d）姜黃素灌胃，每日1次；對(duì)照組和模型組大鼠予以相同劑量的1%羧甲基纖維素鈉灌胃；各組大鼠灌胃8周后，處死大鼠，留取肝臟、小腸組織和門靜脈血用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 各組大鼠肝臟、小腸組織病理學(xué)觀察 取各組大鼠肝臟組織，制備石蠟切片，蘇木精—伊紅染色后，應(yīng)用光鏡觀察肝臟脂肪變的程度。取各組小鼠小腸組織，制備病理學(xué)切片，蘇木精—伊紅染色后，應(yīng)用光鏡觀察小腸黏膜絨毛的變化。

1.4 各組大鼠腸黏膜屏障功能指標(biāo)觀察 取大鼠門靜脈血，按試劑盒說明書測(cè)定門靜脈血漿LPS及門靜脈血漿二胺氧化酶（DAO），使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)大鼠血清ALT、AST。

1.5 各組大鼠小腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)觀察 取小腸組織，制備小腸組織勻漿，按試劑盒說明書，檢測(cè)小腸組織丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.6 各組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白檢測(cè)采用Western Blotting法。取小腸組織，剪碎后加入蛋白裂解液，制備勻漿液，提取細(xì)胞核蛋白Nrf2和胞漿蛋白HO-1并測(cè)定蛋白含量。蛋白煮沸變性后，將20 μg蛋白樣品上樣至12%SDS-PAG凝膠孔中，進(jìn)行電泳，蛋白分離后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，后將其置于5%脫脂牛奶中常溫封閉1 h；將膜置于稀釋后的第一抗體中［兔抗Nrf2多克隆抗體（1∶1000稀釋）、小鼠抗HO-1單克隆抗體（1∶1000稀釋）、兔抗β-actin單克隆抗體（1∶5000稀釋）］，4 ℃孵育過夜。用TBST緩沖液對(duì)PVDF膜漂洗3次，以1∶10000的山羊抗兔、山羊抗小鼠第二抗體溶液孵育2 h；以TBST漂洗3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，使用凝膠成像儀觀察蛋白條帶并拍照，用Image J軟件分析圖像，以β-actin作為內(nèi)參照，結(jié)果以目的條帶和內(nèi)參照的OD比值來表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟、小腸組織病理學(xué)變化 ①各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化見圖1。對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無炎癥反應(yīng)；模型組大鼠可見肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的脂肪堆積，并有炎細(xì)胞浸潤(rùn)；姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組肝細(xì)胞脂肪變減輕，炎癥浸潤(rùn)減少，并與給藥劑量有關(guān)。②各組大鼠小腸組織病理學(xué)變化見圖2。各組小腸黏膜形態(tài)未見明顯異常，對(duì)照組絨毛高大、完整，無充血及水腫；模型組絨毛低矮、間隙增寬，結(jié)構(gòu)破壞，不完整；姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組大鼠小腸絨毛比較完整，絨毛缺失減少，并與給藥劑量有關(guān)。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化（HE染色，×200）

圖2 各組大鼠小腸組織病理學(xué)變化（HE染色，×100）

2.2 各組大鼠腸黏膜屏障功能指標(biāo)比較 各組大鼠血漿LPS、DAO及血清AST、ALT水平比較見表1。由表1可知，與對(duì)照組相比，模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組大鼠血漿LPS、DAO及血清AST、ALT水平均升高（P均＜0.05），但姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組低于模型組（P均＜0.05），且有劑量依賴性（P均＜0.05）。

表1 各組大鼠血漿LPS、DAO及血清AST、ALT水平比較（±s）

表1 各組大鼠血漿LPS、DAO及血清AST、ALT水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與姜黃素低劑量組比較，△P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組ALT（U/L）35.69 ± 9.5975.03 ± 10.86*52.65 ± 7.48*#44.00 ± 5.49*#△LPS（EU/mL）0.27 ± 0.090.55 ± 0.10*0.37 ± 0.07*#0.46 ± 0.07*#△DAO（U/mL）0.46 ± 0.141.06 ± 0.25*0.83 ± 0.18*#0.64 ± 0.12*#△AST（U/L）130.71 ± 14.09165.28 ± 10.26*153.47 ± 8.84*#141.60 ± 8.27*#△

2.3 各組大鼠小腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 各組大鼠小腸組織MDA含量及SOD活性比較見表2。由表2可知，與對(duì)照組相比，模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組大鼠小腸組織MDA含量均升高（P均＜0.05），但姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組低于模型組（P均＜0.05），且有劑量依賴性（P均＜0.05）；與對(duì)照組相比，模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組大鼠小腸組織SOD活性均降低（P均＜0.05），但姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組高于模型組（P均＜0.05），且有劑量依賴性（P均＜0.05）。

表2 各組大鼠小腸組織MDA含量及SOD活性比較（±s）

表2 各組大鼠小腸組織MDA含量及SOD活性比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與姜黃素低劑量組比較，△P＜0.05。

SOD（U/mg）179.02 ± 12.56135.48 ± 16.48*154.70 ± 10.12*#166.74 ± 9.06*#△組別對(duì)照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組MDA（nmol/mg）3.55 ± 0.837.21 ± 1.39*5.65 ± 1.12*#4.60 ± 0.89*#△

2.4 各組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 各組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見表3。由表3可知，與對(duì)照組相比，模型組、姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高（P均＜0.05），且姜黃素低劑量組、姜黃素高劑量組高于模型組（P均＜0.05），且有劑量依賴性（P均＜0.05）。

表3 各組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠小腸組織中Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與姜黃素低劑量組比較，△P＜0.05。

HO-1蛋白0.37 ± 0.100.54 ± 0.13*0.67 ± 0.11*#0.80 ± 0.13*#△組別對(duì)照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素高劑量組Nrf2蛋白0.29 ± 0.060.40 ± 0.07*0.63 ± 0.08*#0.77 ± 0.09*#△

3 討論

高脂飲食可誘發(fā)胰島素抵抗、NAFLD、代謝綜合征、2型糖尿病及動(dòng)脈硬化性心腦血管疾病的發(fā)生［8］，嚴(yán)重危害人民的生命健康。NAFLD已成為我國(guó)第一大慢性肝?。?］，成為公共健康問題。肝臟的血供有約70%來源于腸道相關(guān)血管，肝腸解剖上的關(guān)系決定了其功能上的密切聯(lián)系。近年來，“腸—肝軸”被人們認(rèn)識(shí)和重視，“腸—肝軸”在NAFLD的發(fā)病過程中具有重要地位［10］。NAFLD常伴腸黏膜屏障受損［11］，腸黏膜屏障的受損加速了NAFL向NASH、肝纖維化及肝硬化的發(fā)展。本研究成功應(yīng)用高脂飲食誘導(dǎo)了大鼠肝臟脂肪變，大鼠血清LPS水平升高，說明NAFLD大鼠腸黏膜屏障功能受損。

氧化應(yīng)激是NAFLD時(shí)腸黏膜屏障損傷的重要機(jī)制［12］。LI等［13］研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可使腸黏膜大量促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，誘導(dǎo)腸黏膜氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致腸黏膜肌球蛋白輕鏈激酶 （myosin light chain kinase，MLCK）表達(dá)升高，緊密連接受損，腸黏膜通透性升高。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)大鼠腸組織中MDA水平升高、SOD水平降低，說明高脂喂養(yǎng)大鼠腸黏膜存在氧化應(yīng)激，血漿DAO活性升高，血清LPS水平升高，說明腸黏膜通透性升高，腸黏膜屏障功能受損，與既往研究結(jié)果一致。

Nrf2是一種調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要的核轉(zhuǎn)錄因子［14］，富含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是體內(nèi)氧化應(yīng)激的中樞調(diào)控者，在維持體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下，Nrf2在胞漿與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1結(jié)合而被降解，機(jī)體受到親電體和活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）刺激后，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1解離進(jìn)入到細(xì)胞核，進(jìn)一步與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化酶基因表達(dá)［15］。HO-1為Nrf2下游重要的保護(hù)性蛋白酶［16］。HO-1是一種微粒體酶，可將血紅素分解代謝為膽綠素、膽紅素、一氧化碳和自由鐵，發(fā)揮其強(qiáng)大的抗氧化、抗炎作用［17］。本研究中，高脂喂養(yǎng)大鼠由于腸組織氧化應(yīng)激水平的升高，Nrf2、HO-1的表達(dá)較正常對(duì)照組增加，這是一種機(jī)體在病理情況下的保護(hù)性調(diào)節(jié)行為，這也說明了Nrf2/HO-1在NAFLD時(shí)是調(diào)控腸道氧化應(yīng)激的重要信號(hào)。

姜黃素有強(qiáng)大的抗氧化、清除自由基的作用［18］。LIN等［19］通過體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠激活Nrf2-Keap1信號(hào)通路發(fā)揮其抗氧化作用。本研究應(yīng)用姜黃素對(duì)高脂喂養(yǎng)大鼠進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，大鼠腸組織中MDA水平降低、SOD水平升高，Nrf2、HO-1的表達(dá)較模型組顯著增加，并且與姜黃素應(yīng)用的劑量相關(guān)，這表明姜黃素激活了Nrf2/HO-1通路。同時(shí)姜黃素干預(yù)組大鼠，腸源性內(nèi)毒素血癥減輕，小腸黏膜損傷程度明顯減輕，肝臟脂肪變程度得到改善。

綜上所述，姜黃素灌胃可改善脂肪肝大鼠的腸黏膜屏障損傷，其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1通路改善腸道氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。本研究為肝病腸治提供了理論依據(jù)，但本研究未以該通路抑制劑進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證，且對(duì)其上游信號(hào)分子也未進(jìn)行充分探討，后期將深入進(jìn)行相關(guān)研究。