白藜蘆醇單用或與miR-27b激動劑聯(lián)合應(yīng)用對腦出血大鼠腦組織繼發(fā)性病理損傷的防治作用觀察

舒藝璇，何曉英，陳鑫，蔣義碧

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000

腦出血（intracerebral hemorrhage， ICH）是神經(jīng)系統(tǒng)常見病多發(fā)病，占我國腦卒中患者的25%～55%，其致殘率及死亡率高［1］。ICH后腦組織會出現(xiàn)病理性損傷，包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。腦組織繼發(fā)性病理損傷主要是由于ICH后有害物質(zhì)釋放引起的血腦屏障破壞、炎性反應(yīng)、氧化損傷等病理損傷，與ICH預(yù)后密切相關(guān)，而減輕ICH后繼發(fā)性病理損傷一直是神經(jīng)學(xué)者研究的熱點(diǎn)［2］。微小RNA（MicroRNAs， miRNA）是一類約22個核苷酸長度的非編碼RNAs，通過特異性互補(bǔ)堿基對靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（UTR）降解或直接抑制靶基因的翻譯，從而調(diào)控多種途徑。近年來研究［3］發(fā)現(xiàn)，miRNA-27b與ICH密切相關(guān)，降低miR-27b水平能減輕ICH大鼠的病理損傷。既往研究［4-5］通過雙熒光素酶報(bào)告基因分析，提示核因子相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2， Nrf2）mRNA是miR-27b的直接靶點(diǎn)，miR-27b表達(dá)下降可能激活Nrf2/抗氧化應(yīng)激反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號通路。Nrf2/ARE信號通路是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)氧化還原平衡的主要承擔(dān)者，Nrf2/ARE信號通路可減輕ICH后病灶周圍炎癥反應(yīng)，具有重要神經(jīng)保護(hù)作用［6-7］。白藜蘆醇（Resveratrol， Res）是一種天然多酚類化合物。既往研究［8］證明，Res可減輕ICH后腦組織周圍水腫及凋亡，具有抑制炎癥反應(yīng)等作用，并且在腫瘤、心血管、糖尿病等多種疾病中可降低促炎miRNA水平，提高抗炎能力［9］。2022年6月—2023年10月，我們觀察了Res單用或與miR-27b激動劑聯(lián)合應(yīng)用對ICH大鼠腦組織繼發(fā)性病理損傷的防治作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 大鼠 8周齡雄性SD大鼠180只，體質(zhì)量250～300 g，購于湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心，許可證號SYXK（鄂）2022-0065，上述動物均通過西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查。

1.2 大鼠分組和ICH模型制備方法 將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組，每組36只。ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組以及NC組大鼠采用膠原酶注射尾狀核法制備ICH模型［10］：造模前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，禁食8 h后常規(guī)稱重，用7%水合氯醛（0.7 mL/kg）腹腔注射麻醉小鼠，將其固定在腦立體定位儀上，頭部備皮，常規(guī)消毒，剪開皮膚；以前囟作為原點(diǎn)，向后0.2 mm、向右3 mm處鉆一直徑為1 mm小圓孔作為注射孔，將吸人膠原酶的微量注射器固定好，沿注射孔將針頭垂直、緩慢插入大鼠腦實(shí)質(zhì)，深度約6 mm，以0.5 μL/min的速度注人膠原酶，注射完畢后停針10 min，緩慢向上拔針，每向上拔針1 mm停針5 min，直至全部拔出；結(jié)束后閉孔、消毒、縫合。假手術(shù)組以生理鹽水代替膠原酶，其余操作與其他組一致。造模后采用Longa評分，1～3分視為造模成功［11］。造模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)24 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 Res和miR-27b激動劑給予方法 Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組大鼠在造模前連續(xù)7 d 腹腔注射50 mg/（kg·d） Res，假手術(shù)組及ICH組采取同樣方法向大鼠腹腔注射等體積的2% DMSO。Res+miR-27b agomir組大鼠在造模前3 d將5 μL（20 nmol/L）miR-27b激動劑miR-27b agomir注入大鼠右側(cè)腦室，NC組大鼠采取同樣方法將5 μL（20 nmol/L）agomir陰性對照試劑注入右側(cè)腦室，假手術(shù)組、ICH組、Res組則注入等量生理鹽水。

1.4 各組大鼠神經(jīng)功能評估 每組取6只大鼠，使用mNSS評分量表評估大鼠神經(jīng)功能，評分越高表示神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。

1.5 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率測算 采用TUNEL法。每組取6只大鼠，處死后取腦組織制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟后用乙醇、PBS洗滌，于蛋白酶K溶液中孵育，配制TdT標(biāo)記反應(yīng)緩沖液，加入50 μL反應(yīng)混合物，避光孵育，PBS清洗，DAPI復(fù)染，再次PBS洗滌，封片后熒光顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。神經(jīng)細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 各組大鼠腦組織炎癥因子、氧化應(yīng)激相關(guān)因子檢測 采用ELISA法。每組取6只大鼠，處死后取腦組織制成勻漿，按照ELISA試劑盒說明書操作，測定腦組織中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、丙二醛（Malonic dialdehyde， MDA）水平及超氧化物（Superoxide dismutase， SOD）。

1.7 各組大鼠腦組織中miR-27b、Nrf2 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。每組取6只大鼠，處死后取腦組織，采用TRIzol法提取總RNA。采用cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，按熒光定量PCR試劑盒EnTurbo? SYBR Green PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行RT-PCR操作。引物序列如下：Nrf2正向引物為5'-GTCGCTTGCCCTGGATATTC-3'，反向引物5'-TAGCTCCTGCCAAACTTGCTC-3'；miR-27b-3p正向引物為5'-AGTGGCTAAGTTCTGCCTCAAC-3'，反向引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3'；U6正向引物為5'-CCTGCTTCGGCAGCACAT-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH正向引物5'-GCCAAGGTCATCCATGACAAC-3'，反向引物5'-GTGGATGCAGGGATGATGTTC-3'。以2-ΔΔCt表示組織中目的mRNA的相對表達(dá)量。

1.8 各組大鼠腦組織中Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白Nrf2、血紅素加氧酶（Heme oxygenase 1， HO-1）、醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase1， Nqo1）檢測 采用Western Blotting法。每組取6只大鼠，處死后取腦組織，加入組織蛋白提取試劑，冰浴徹底勻漿，離心后取上清液，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度；經(jīng)過制膠、上樣、轉(zhuǎn)膜后，加入封閉液室溫封閉1 h；加入一抗在4 ℃過夜，TBST洗3次；加入二抗，室溫孵育30 min，TBST洗4次；滴加ECL混合溶液，經(jīng)過顯色、曝光、顯影、定影后保存膠片；將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白條帶灰度值，目的蛋白的相對表達(dá)量以目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 27.0.1統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時以±s表示，多組間比較用ANOVA分析法，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 假手術(shù)組、ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組大鼠mNSS評分分別為（0.83 ± 0.75）、（14.33 ± 0.81）、（8.00 ±0.63）、（12.00 ± 0.89）、（8.50 ± 1.05）分，其中假手術(shù)組大鼠mNSS評分均低于其余各組（P均＜0.05），ICH組大鼠mNSS評分均高于其余各組（P均＜0.05），且Res+miR-27b agomir組大鼠mNSS評分均高于Res組和NC組（P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較 假手術(shù)組、ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別為0.84% ±0.69%、37.18% ± 1.14%、6.41% ± 0.92%、19.46% ±1.35%、6.57% ± 0.77%，其中假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均低于其余各組（P均＜0.05），ICH組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均高于其余各組（P均＜0.05），且Res+miR-27b agomir組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均高于Res組和NC組（P均＜0.05）。

2.3 各組大鼠腦組織炎癥因子、氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)水平比較 各組大鼠腦組織炎癥因子、氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)水平比較見表1。由表1可知，假手術(shù)組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、MDA表達(dá)水平均低于其余各組（P均＜0.05），SOD活力均高于其余各組（P均＜0.05）；ICH組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、MDA表達(dá)水平均高于其余各組（P均＜0.05），SOD活力均低于其余各組（P均＜0.05）；且Res+miR-27b agomir組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、MDA表達(dá)水平均高于Res組和NC組（P均＜0.05），SOD活力均低于Res組和NC組（P均＜0.05）。

表1 各組大鼠腦組織炎癥因子、氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)比較（±s）

表1 各組大鼠腦組織炎癥因子、氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與ICH組相比，#P＜0.05；與Res組比，△P＜0.05；與Res+miR-27b agomir組相比，＆P＜0.05。

組別假手術(shù)組ICH組RES組RES+miR-27b agomir組NC組SOD（U/mg）53.52 ± 1.0927.72 ± 1.82*48.92 ± 2.56*#39.13 ± 1.41*#△47.55 ± 1.57*#＆n66666 TNF-α（pg/mg）22.38 ± 1.2254.21 ± 2.39*27.79 ± 1.25*#37.02 ± 1.10*#△27.56 ± 1.39*#＆IL-1β（pg/mg）15.04 ± 0.8846.00 ± 1.92*19.38 ± 1.20*#28.04 ± 1.20*#△19.09 ± 2.07*#＆MDA（nmol/mg）1.88 ± 0.327.27 ± 0.41*2.86 ± 0.30*#4.15 ± 0.21*#△2.91 ± 0.60*#＆

2.4 各組大鼠腦組織中miR-27b、Nrf2 mRNA相對表達(dá)量比較 假手術(shù)組、ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組大鼠腦組織中miR-27b相對表達(dá)量分別為1.02 ± 0.01、0.62 ± 0.04、0.23 ± 0.03、0.32 ±0.05、0.20 ± 0.04，其中Res組和NC組大鼠腦組織中miR-27b相對表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余組間相比，P均＜0.05。假手術(shù)組、ICH組、Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組大鼠腦組織中Nrf2 mRNA相對表達(dá)量分別為1.01 ± 0.01、3.29 ± 0.05、4.74 ± 0.06、3.96 ± 0.05、4.77 ± 0.06，其中Res組和NC組大鼠腦組織中Nrf2 mRNA相對表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余組間相比，P均＜0.05。

2.5 各組大鼠腦組織中Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白Nrf2、HO-1、NQO1相對表達(dá)量比較 各組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達(dá)量比較見表2。由表2可知，Res組和NC組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其余組間相比，P均＜0.05。

表2 各組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與ICH組相比，#P＜0.05；與Res組比，△P＜0.05；與Res+miR-27b agomir組相比，＆P＜0.05。

組別假手術(shù)組ICH組Res組Res+miR-27b agomir組NC組NQO1蛋白0.06 ± 0.030.15 ± 0.07*0.76 ± 0.09*#0.25 ± 0.06*#△0.75 ± 0.04*#＆n66666 Nrf2蛋白0.06 ± 0.030.11 ± 0.04*0.54 ± 0.08*#0.16 ± 0.03*#△0.51 ± 0.02*#＆HO-1蛋白0.05 ± 0.040.16 ± 0.07*0.71 ± 0.12*#0.45 ± 0.08*#△0.70 ± 0.05*#＆

3 討論

腦組織繼發(fā)性病理損傷是指在ICH后，由于腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的血液及溶血產(chǎn)物釋放的有害物質(zhì)通過激活炎癥反應(yīng)、細(xì)胞性毒性和興奮性毒性，促使神經(jīng)元和神經(jīng)細(xì)胞在退行性改變、炎癥和生化級聯(lián)的相互作用下，引起的腦組織損傷和細(xì)胞死亡［12］。Res是一種天然的多酚植物抗毒素，具有非常廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎免疫和神經(jīng)保護(hù)等作用［13-14］。本實(shí)驗(yàn)中觀察到予以Res干預(yù)ICH大鼠后，Res組神經(jīng)功能缺損明顯改善，炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)下降以及SOD活性提升，表明其減輕腦組織炎癥反應(yīng)及氧化損傷，說明Res能減輕ICH大鼠神經(jīng)損傷，其可能是通過減輕炎癥反應(yīng)及提升抗氧化應(yīng)激能力起到了神經(jīng)保護(hù)的作用。

miRNAs是一類約22個核苷酸長度的非編碼RNAs，能與靶基因3′-UTR區(qū)域結(jié)合，誘導(dǎo)該靶基因mRNA降解，抑制靶基因表達(dá)［3］。miRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如脊髓損傷、多發(fā)性硬化、缺血性卒中和阿爾茨海默病等病理過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥作用。miR-27家族及其基因簇與人體內(nèi)多種疾病有著較高的相關(guān)性。SAKSHI等［15］研究指出，在糖尿病足潰瘍進(jìn)展過程中，miR-27b損害Nrf2介導(dǎo)的足部血管生成。此外，miR-27b是ICH后早期神經(jīng)功能惡化的危險因素，抑制miR-27b表達(dá)可減輕ICH后的損傷。多項(xiàng)研究［16］發(fā)現(xiàn)，Res可能以一種新的方式——調(diào)控miRNA的表達(dá)而呈現(xiàn)多樣的生物活性，例如Res促進(jìn)miR-20b-5p表達(dá)后抑制STIM2表達(dá)，改善線粒體功能，從而減輕急性心肌梗死后的缺血再灌注；Res在阿爾茨海默癥的大鼠模型中，調(diào)節(jié)Sirt1/miRNA-134/GSK3β表達(dá)，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)炎癥和神經(jīng)毒性。在本研究中發(fā)現(xiàn)，與ICH組相比，Res組、Res+miR-27b agomir組、NC組miR-27b的表達(dá)均降低；在予以miR-27b激動劑后，與Res組相比，Res+miR-27b agomir組miR-27b的表達(dá)升高，而NC組作為陰性對照與Res組無明顯差異，上述結(jié)果提示ICH后大鼠miR-27b表達(dá)下降，而Res可進(jìn)一步抑制miR-27b表達(dá)的作用；并且在Res組中神經(jīng)功能評分、腦組織凋亡率及促炎因子表達(dá)隨之降低，推測Res可能是通過下調(diào)ICH大鼠miR-27b的表達(dá)減輕ICH后的腦組織繼發(fā)性病理損傷。

Nrf2/ARE通路是抗氧化最重要的防御機(jī)制之一，它與炎癥性疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等密切相關(guān)。Nrf2/ARE信號通路激活后，Nrf2與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白Keap1（Kelch-like ECH-associated protein-1）解離并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，通過與ARE相互作用，可啟動下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)，促進(jìn)自由基的清除，以抵抗氧化應(yīng)激損傷［7］。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)可調(diào)節(jié)多種miRNA，改變其完整性、穩(wěn)定性及生物學(xué)功能。miR-27b是一類與氧化應(yīng)激有關(guān)的miRNA，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究中觀察到，在大鼠ICH模型中miR-27b表達(dá)下降，予以Res干預(yù)后進(jìn)一步抑制其表達(dá)。在Res組中觀察到，伴隨miR-27b水平下降的同時，大鼠腦組織Nrf2 mRNA的水平明顯上升，并且Nrf2/ARE信號通路下游蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，TNF-α、IL-1β等促炎因子水平明顯下降，SOD活力明顯提升。相反，與Res組相比，當(dāng)Res+miR-27b agomir組miR-27b表達(dá)上升后，Nrf2 mRNA的水平則降低，并且Nrf2/ARE信號通路下游蛋白含量減少，Res的抗炎及抗氧化應(yīng)激作用也受到一定的抑制。通過上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nrf2可能是miR-27b的潛在靶向分子，二者表達(dá)可能存在負(fù)相關(guān)。因此推測Res抑制ICH大鼠miR-27b的表達(dá)后，可能進(jìn)一步激活Nrf2/ARE信號通路影響其下游蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎及減輕氧化損傷作用。

綜上所述，Res單用或聯(lián)合miR-27b激動劑可對ICH大鼠腦組織繼發(fā)性病理損傷起防治作用，其防治作用可能與激活Nrf2/ARE信號通路有關(guān)。這表明Res可能成為治療ICH有價值的藥物，而miR-27b則可作為ICH治療的重要研究靶點(diǎn)，為改善ICH繼發(fā)性損傷提供新的思路。