裝載人參皂苷Rh2外泌體的制備及其對肝癌細胞株Huh7、PLC半數(shù)抑制濃度測算

李美樂，趙梓粵，金凱，唐婷，黃俊期，王戈睿，謝裕安，，4

1 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部，南寧 530021；2 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；3 廣西中醫(yī)藥大學研究生院；4 廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院

肝細胞癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率都非常高［1］。中醫(yī)藥是防治惡性腫瘤的有效手段之一，在產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)的同時，還能夠有效改善患者的臨床癥狀，減輕放化療不良反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)耐藥，提高生活質(zhì)量［2］。人參皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2，G-Rh2）是人參中重要生物活性物質(zhì)之一，具有豐富的藥理作用，包括抗炎、抗腫瘤及改善心臟功能等［3］。因抗癌效果優(yōu)異，G-Rh2被認為是未來癌癥治療的新方向，但由于其生物利用度低，直接應(yīng)用于人體不能發(fā)揮其顯著的抗癌作用［4］。外泌體（Exos）是具有完整膜結(jié)構(gòu)的細胞外囊泡，直徑30～200 nm，主要負責細胞間的物質(zhì)運輸和信息傳遞［5］。隨著近年來對Exos的研究，有學者［6-7］發(fā)現(xiàn)Exos可作為一種天然的納米級藥物載體，且與傳統(tǒng)藥物遞送系統(tǒng)相比，Exos具有免疫原性低、遞送效率高、可跨過多種生物屏障等優(yōu)點，還能改善一些藥物穩(wěn)定性差、溶解度低、生物利用度不足和毒性較高的缺點。因此，Exos成為藥物遞送載體具有巨大的潛力。2022年5月—2023年10月，我們制備了裝載G-Rh2的外泌體Exos@G-Rh2，并測算其對肝癌細胞株Huh7、PLC的半數(shù)抑制濃度（IC50），現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 G-Rh2、細胞、試劑與儀器 G-Rh2購于北京索萊寶科技有限公司，分子式：C36H62O8，分子量：622.87，高效液相色譜法檢測純度HPLC≥98%。肝癌細胞株Huh7及PLC均購自中國科學院昆明細胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國GBICO公司；PBS磷酸緩沖鹽溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、抗熒光衰減封片劑（含DAPI）購自北京索萊寶科技有限公司；青鏈霉素混合液、胎牛血清（FBS）購自BI生物公司。外泌體提取試劑盒及紅色熒光標記染料購自上海宇玫博公司。Calnexin抗體、CD9抗體、CD63抗體、TSG101抗體購自美國Abcam公司。CR21N高速離心機、CP80NX超速離心機及超速離心管均購自日本日立公司；納米顆粒跟蹤分析儀購自德國Particle Metrix公司；LC-20A高效液相色譜儀及高效液相色譜柱購自日本島津公司；NEPA21電轉(zhuǎn)儀及EC-002S電擊杯購自日本NEPA GENE公司；DYCZ-24DN電泳儀購自北京六一生物有限公司；倒置顯微鏡及熒光顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.2 Huh7細胞中Exos的提取及純化 取適量胎牛血清置于超速離心管中，在4 ℃下，以100000 g/min超速離心16 h，收集上清液并用0.45 μm濾膜過濾，即得無Exos的胎牛血清，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。Huh7細胞培養(yǎng)于含10%無Exos胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液中，放置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，待細胞狀態(tài)較好且細胞密度達80%左右時，收集細胞上清，使用外泌體提取純化試劑盒分離提取Huh7細胞培養(yǎng)上清液中的Exos，具體步驟如下：將細胞上清液在4 ℃下以3000 g離心10 min去除雜質(zhì)，然后取上清液與試劑盒中的外泌體濃縮液（Exosome Concentration Solution，ECS）按4∶1比例混勻，放置于4 ℃冰箱過夜，次日取出在4 ℃下以10000 g離心60 min，離心結(jié)束后棄上清，用適量PBS重懸管底沉淀后轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中，在4 ℃下以12000 g再次離心2 min，取上清，轉(zhuǎn)入外泌體純化柱（Exosome Purification Filter，EPF），在4 ℃以3000 g離心10 min，EPF柱管底的液體即為純化后的Exos溶液；按照BCA法用BCA蛋白定量試劑盒對其蛋白進行定量后放置-80 ℃冰箱備用。

1.3 Exos@G-Rh2的制備 采用電穿孔［8］法。將適量純化的Exos與G-Rh2按質(zhì)量比為2∶3輕輕混勻，取100 μL上述混合液液添加到2 mm電穿孔比色杯中，用NEPA21 Type Ⅱ進行電穿孔（穿孔脈沖兩次，100 v、5 ms；傳輸脈沖五次，20 v、50 ms），37 ℃溫育30 min以恢復外泌體膜，最后將上述混合液轉(zhuǎn)移至100 KDa超濾管中離心（4 ℃，4000g，15 min），棄掉超濾管下管中的液體，加入適量PBS至超濾管中含濾膜的內(nèi)管，反復吹打內(nèi)管壁及底部，重懸Exos@GRh2，獲得純化的Exos@G-Rh2，BCA法測量其蛋白濃度后放置-80℃冰箱備用。

1.4 Exos@G-Rh2形態(tài)、粒徑、載藥量觀察

1.4.1 Exos@G-Rh2、Exos形態(tài)觀察 用移液槍吸取適量Exos@G-Rh2及Exos懸液分別滴加于碳覆膜銅網(wǎng)上，靜置2 min，取適量2%磷鎢酸溶液滴加到銅網(wǎng)上，然后用濾紙瀝干，室溫負染5 min，晾干后置于透射電子顯微鏡下觀察Exos及Exos@G-Rh2形態(tài)并拍照。

1.4.2 Exos@G-Rh2、Exos粒徑測算 分別取適量Exos及Exos@G-Rh2混懸液以超純水稀釋至合適濃度后，輕輕吹打使其分散完全，0.22 um微孔濾膜過濾后，取濾液注入納米顆粒跟蹤分析儀進行分析。

1.4.3 Exos@G-Rh2載藥量的測定 采用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）法，參照文獻［9-10］報道的方法，做適量修改。精密稱取G-Rh2對照品20 mg，用DMSO溶解，定容成濃度為20 mg/mL的儲備液。取適量G-Rh2儲備液，加入甲醇，制成0.2、0.5、2、5、20、50、200 μg/mL的G-Rh2溶液。色譜柱：采用Inertsustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈-水（60∶40），流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長203 nm；進樣量20 μL。按照上述色譜條件進樣測定，以G-Rh2對照品溶液濃度為橫坐標（x），每個濃度對應(yīng)的峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線。將Exos@G-Rh2溶液與適量的色譜甲醇充分混勻，超聲破膜，13000 g/min離心10 min，去除雜質(zhì)，取出上清液，轉(zhuǎn)入進樣瓶中，按照標準曲線色譜條件進樣測定該溶液中G-Rh2含量，并計算Exos@G-Rh2載藥量。Exos@G-Rh2載藥量=Exos@G-Rh2中G-Rh2含量/Exos的蛋白含量×100%。

1.5 Exos@G-Rh2對Huh7細胞、PLC細胞的IC50測算

1.5.1 Huh7細胞、PLC細胞對Exos@G-Rh2的攝取情況觀察 采用PKH-26熒光染色法。按照外泌體紅色熒光標記染料（PKH-26）說明書配制染料工作液，根據(jù)Exos蛋白定量結(jié)果在Exos中加入適量的染料工作液，通過渦旋振蕩器混勻后室溫下避光孵育20 min，加入適量PBS，轉(zhuǎn)至EPF柱離心（4 ℃，3000 g，10 min）去除多余染料，再次獲取Exos即為PKH-26標記外泌體，待細胞貼壁后，將PKH-26標記的外泌體與適量完全培養(yǎng)基混勻，分別加入Huh7細胞、PLC細胞，孵育24 h后，4%多聚甲醛固定15 min， PBS清洗后用含DAPI的封片劑進行封片，使用熒光倒置顯微鏡觀察Huh7細胞、PLC細胞對Exos@G-Rh2的攝取情況。顯微鏡下，PKH-26標記的外泌體顯示為紅色熒光。

1.5.2 Exos@G-Rh2、游離G-Rh2對Huh7細胞、PLC細胞的IC50測算 采用CCK-8法。將Huh7和PLC細胞分別以5000個/孔的密度接種至96孔常規(guī)培養(yǎng)，次日待細胞貼壁后更換為含游離G-Rh2及Exos@G-Rh2的培養(yǎng)基（G-Rh2濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35和40 μg/mL），培養(yǎng)48 h后，將CCK-8溶液與DMEM培養(yǎng)基按1∶9比例混勻配制CCK-8工作液，隨后以細胞換液方式加入96孔板，每孔100 μL，在37 ℃下避光培養(yǎng)2 h，采用酶標儀測定各孔450 nm處的吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗孔吸光度值-空白孔吸光度值）/（對照孔吸光度值-空白孔吸光度值）×100%。使用GraphPad Prism軟件計算藥物半數(shù)抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration， IC50）。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用Graph Pad Prism統(tǒng)計軟件。計量資料呈正態(tài)分布時以±s表示，比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Exos@G-Rh2的形態(tài)、粒徑、載藥量

2.1.1 Exos@G-Rh2、Exos形態(tài)比較 透射電鏡下Exos及Exos@G-Rh2形態(tài)見圖1，Exos及Exos@G-Rh2在電鏡下均可見經(jīng)典的茶托狀結(jié)構(gòu)，且有質(zhì)膜包裹，形態(tài)無顯著差異。

圖1 透射電鏡下Exos及Exos@G-Rh2形態(tài)

2.1.2 Exos@G-Rh2、Exos粒徑比較 Exos@G-Rh2、Exos粒徑分別為（156.90 ± 10.23）nm、（143.47 ±8.62）nm，兩者相比，P＞0.05。

2.1.3 Exos@G-Rh2載藥量 G-Rh2標準曲線方程為：y=11963×x-12868（R2=0.9997），Exos@G-Rh2載藥量為24.25% ± 0.27%。

2.2 Exos@G-Rh2對Huh7細胞、PLC細胞的IC50測算結(jié)果

2.2.1 Huh7細胞、PLC細胞對Exos@G-Rh2的攝取情況 熒光顯微鏡下觀察到，在Huh7細胞、PLC細胞中，紅色熒光清晰可見，主要在細胞質(zhì)中，說明PKH-26標記的Exos@G-Rh2可以被Huh7細胞、PLC細胞攝取。

2.2.2 Exos@G-Rh2、游離G-Rh2對Huh7細胞、PLC細胞的IC50比較 在Huh7細胞中，游離G-Rh2的IC50值為（34.96 ± 1.37）μg/mL，而Exos@G-Rh2的IC50值為（29.74 ± 2.83）μg/mL，兩者相比，P＜0.05；在PLC細胞中，游離G-Rh2的IC50值為（33.41 ± 1.47）μg/mL，而Exos@G-Rh2的IC50值為（30.08 ± 1.12）μg/mL，兩者相比，P＜0.05；以上結(jié)果均提示相同濃度下Exos@G-Rh2對Huh7細胞、PLC細胞活力的抑制效果強于游離G-Rh2。

3 討論

HCC是肝臟最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，死亡率很高［11］。HCC常見治療方法包括化療、放療、手術(shù)、分子靶向治療等，目前手術(shù)仍是治療肝癌的主要手段。但由于HCC起病隱匿、病程發(fā)展迅速及易轉(zhuǎn)移復發(fā)等特點，導致大多數(shù)患者確診時已屬中晚期，無法手術(shù)治療，生存率大大降低，預后并不理想［12］。同時中晚期的HCC患者身體機能嚴重下降，多臟器功能衰竭，并出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，故應(yīng)選擇不良反應(yīng)小的抗腫瘤藥物進行輔助治療，盡量延長患者生存期，減少死亡率，提高生活質(zhì)量。中草藥除抗腫瘤作用外，還能改善患者免疫功能，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥、減輕放化療不良反應(yīng)，已經(jīng)成為我國防治惡性腫瘤的有效手段之一。

G-Rh2是人參中的有效活性成分，具有誘導腫瘤細胞周期阻滯、逆轉(zhuǎn)耐藥及抑制腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲等作用［13］。但因其水溶性較差，難溶于水，治療效果并不理想。近年來，利用藥物載體傳遞GRh2的研究逐漸受到關(guān)注，顧倩等［14］采用離子交聯(lián)的方法制備殼聚糖納米粒子包載人參皂苷Rh2，結(jié)果表明該載藥納米粒子分布均一、性能穩(wěn)定，能夠被A549細胞攝取，且較游離藥物抑制A549細胞的增殖作用增強。XIA等［15］采用薄膜分散法制備了人參皂苷Rh2-混合膠束體系（Rh2-M），并通過體內(nèi)、體外實驗證明，Rh2-M不僅可以提高G-Rh2的溶解度、增加G-Rh2在腫瘤部位的濃度和滯留時間，還能增強G-Rh2對肺癌的抑制作用。盡管以聚合物膠束、納米粒、脂質(zhì)體等作為載體可以解決藥物溶解度差及生物利用度低等難題，但也存在成本高、毒性高、缺乏靶向性等不足。

Exos是具有完整膜結(jié)構(gòu)的細胞外囊泡，直徑為30～200 nm，不僅存在于細胞內(nèi)，還廣泛分布于血液、尿液、唾液、母乳、羊水、腹水及膽汁等多種體液中［16］。作為一種新型的藥物遞送載體，Exos可以在細胞間進行物質(zhì)和信息傳遞，能將其包被的治療藥物、基因等“貨物”靶向遞送給特定的細胞或組織［17］?，F(xiàn)有的載藥方法可分為內(nèi)源性載藥和外源性載藥兩大類。內(nèi)源性裝載是通過對親本細胞進行基因修飾使其產(chǎn)生具有目的藥物的Exos，外源性裝載需要先分離提純Exos，再將藥物載入其中，常用的方法包括使用電穿孔、擠出、超聲和凍融循環(huán)等［18］。作為一種新型的天然藥物遞送載體，Exos具有免疫原性低、遞送效率高和生物相容性好等優(yōu)勢。

綜上所述，我們選用Exos作為載體遞送G-Rh2，通過電穿孔法成功制備了Exos@G-Rh2，并在體外考察了其對肝細胞癌活力的影響，結(jié)果顯示Exos負載G-Rh2前后形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯變化，相較于游離G-Rh2，Exos@G-Rh2在體外對肝癌細胞的活力具有更強的抑制效果，提示Exos作為藥物載體遞送人參皂苷Rh2增強其抗腫瘤效果可行，這為進一步探討Exos作為藥物載體的潛在價值及G-Rh2的抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)。