三氯化鋁誘發(fā)阿爾茨海默病過(guò)程中熊果酸灌胃對(duì)大鼠認(rèn)知功能的改善作用觀察

劉萍萍，肖一，張翼，何學(xué)芳，彭紅，季一飛

南充市中心醫(yī)院（北京安貞醫(yī)院南充醫(yī)院）神經(jīng)內(nèi)科 四川省神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川 南充 637000

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是危害老年人健康的主要疾病之一，對(duì)全世界各地的家庭和社會(huì)產(chǎn)生了巨大的負(fù)面影響［1］。已有證據(jù)［2-3］表明，氧化應(yīng)激可能是AD發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。鋁是癡呆的發(fā)病因素之一，鋁廣泛存在于環(huán)境中，隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，鋁會(huì)逐漸在腦部沉積，破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，并進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙［4］。而新的研究［5-6］表明，神經(jīng)保護(hù)治療可使神經(jīng)元免受神經(jīng)毒素、自由基的損害，調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)元的存活。熊果酸（Ursolic Acid，UA）是一種天然的五環(huán)三萜羧酸，是女貞葉、枇杷葉、鐵冬青葉、迷迭香葉等多種傳統(tǒng)藥用植物的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗高血壓、抗白血病和抗病毒等多種生物化學(xué)和藥理作用［7-9］。有鑒于此，2022年6—12月，我們觀察了AlCl3誘發(fā)AD過(guò)程中UA灌胃對(duì)大鼠認(rèn)知功能的改善作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 大鼠 體質(zhì)量170～200 g的健康雄性Wistar大鼠，購(gòu)自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心［許可證號(hào)為SCXK（川）2018-0018］，大鼠飼養(yǎng)在光照12 h/黑暗12 h周期循環(huán)的鼠籠中，溫度22～24℃，相對(duì)濕度為50%～60%，自由進(jìn)食水和食物。本研究中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理使用指南》進(jìn)行，并通過(guò)川北醫(yī)學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 大鼠分組、AD模型大鼠的制備及UA給予方法 將大鼠隨機(jī)分為空白組、UA組、AlCl3組、AlCl3+UA組4組，每組6只?？瞻捉M大鼠連續(xù)45 d每日1次灌胃生理鹽水，UA組大鼠連續(xù)45 d每日1次灌胃40 mg/kg UA，AlCl3組大鼠連續(xù)45 d每日1次灌胃100 mg/kg AlCl3建立AD模型，AlCl3+UA組大鼠連續(xù)45 d每日1次灌胃100 mg/kg AlCl3，且從第30天開(kāi)始至第45天每日1次灌胃40 mg/kg UA。

1.3 各組大鼠認(rèn)知功能觀察 各組大鼠灌胃停止5 d后，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠認(rèn)知功能。實(shí)驗(yàn)包括：①定位航向?qū)嶒?yàn)。分別以各象限的統(tǒng)一位置作為起始點(diǎn)，動(dòng)物面朝池壁，從任一象限起始點(diǎn)輕輕放入水池中。一個(gè)象限一次實(shí)驗(yàn)時(shí)間為90 s，從動(dòng)物入水至四肢爬上平臺(tái)的時(shí)間作為逃避潛伏期。動(dòng)物爬上平臺(tái)后，讓其停留10 s。若在90 s內(nèi)動(dòng)物未找到平臺(tái)，則潛伏期記為90 s，并人為引導(dǎo)其找到平臺(tái)，并停留10 s。每天每只動(dòng)物訓(xùn)練4次，連續(xù)訓(xùn)練4天，以第5天的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為本研究的最終數(shù)據(jù)。②空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束的24 h后，移除平臺(tái)。將動(dòng)物面向池壁，從任一象限輕輕放入水中，記錄大鼠在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間。

1.4 各組大鼠大腦皮層和海馬組織中的鋁含量測(cè)定 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各組大鼠，七氟烷麻醉后斷頭處死大鼠，取大鼠大腦皮層和海馬組織。取0.2 g大鼠大腦皮層和海馬組織加入濃硝酸1.6 mL和高氯酸0.4 mL加熱消化，用石墨爐原子吸收分光光度法測(cè)定大鼠大腦皮層和海馬組織中的鋁含量。測(cè)定條件：溫度2600 ℃，狹縫寬度0.5 mm，電流強(qiáng)度5 mA，干燥溫度150 ℃、15 s，灰化溫度800 ℃。

1.5 各組大鼠大腦皮層和海馬組織中乙酰膽堿酶（AChE）活性檢測(cè) 采用比色法。取大鼠大腦皮層及海馬組織用預(yù)冷的生理鹽水制成10%組織勻漿，按照AchE測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)要求檢測(cè)大鼠大腦皮層及海馬組織中AchE活性。

1.6 各組大鼠大腦皮層和海馬組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè) 分別取大鼠大腦皮層及海馬組織制作含有10%腦組織勻漿的0.9%無(wú)菌生理鹽水溶液，將勻漿在4 ℃下以6000 rpm的速度離心10 min以分離上清液。根據(jù)程序［10］，測(cè)定氧化應(yīng)激標(biāo)志物超氧化物歧化酶（Super Oxide Dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）活性，并根據(jù)NIEHAUS等［11］的方法計(jì)算大腦皮層和海馬組織中硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）的活性。

1.7 各組大鼠大腦皮層和海馬組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time，PCR）法。取大鼠大腦皮層及海馬組織，嚴(yán)格按照RNeasy Mini試劑盒說(shuō)明書(shū)所示步驟從海馬組織中提取總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大腦皮層及海馬組織中TNF-α、IL-6、NF-κB和COX-2的mRNA表達(dá)。引物序列如下：TNF-α正向引物為5′-GTACTAACTCCCAGAAAAGCAAGC-3′，反向引物為5′-CAGTAGACAGAAGAGCGTGGTG-3′，IL-6正向引物為5′-CCCAACTTCCAATGCTCTCCT-3′，反向引物為5′-GGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3′，NF-κB正向引物為5′-ATTCACATAGCTGTGATGAGCAA-3′，和反向引物為5′-AACGAGATGTTGTCGTACTCCAC-3′，COX-2正向引物為5′-CTTGGCTTGTGACTTTGGCAG-3′，反向引物為5′-CACACATTGCATGGGG-3′，GAPDH正向引物為5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，反向引物為5′-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3′。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中受檢基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認(rèn)知功能比較 各組大鼠認(rèn)知功能比較見(jiàn)表1。由表1可知，與空白組及UA組相比，AlCl3組大鼠逃避潛伏期更長(zhǎng)、在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間更短（P均＜0.05）；與AlCl3組相比，AlCl3+UA組大鼠逃避潛伏期更短、在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間更長(zhǎng)（P均＜0.05）。

表1 各組大鼠認(rèn)知功能比較（s，ˉx ± s）

2.2 各組大鼠大腦皮層和海馬組織中的鋁含量比較 空白組、UA組、AlCl3組、AlCl3+UA組大鼠大腦皮層中的鋁含量分別為（1.95 ± 0.06）、（1.92 ±0.06）、（9.05 ± 0.32）、（4.62 ± 0.45）ng/g，其中AlCl3組大鼠大腦皮層中的鋁含量均高于其余各組（P均＜0.05）?？瞻捉M、UA組、AlCl3組、AlCl3+UA組大鼠海馬組織中的鋁含量分別為（2.00 ± 0.06）、（2.02 ± 0.06）、（10.48 ± 1.35）、（5.05 ± 0.16）ng/g，其中AlCl3組大鼠海馬組織中的鋁含量均高于其余各組（P均＜0.05）。

2.3 各組大鼠大腦皮層和海馬組織中AChE活性比較 空白組、UA組、AlCl3組、AlCl3+UA組大鼠大腦皮層中AChE活性分別為（6.25 ± 1.30）、（6.18 ±0.95）、（18.47 ± 2.61）、（10.28 ± 1.34）μmol/mg，其中AlCl3組大鼠大腦皮層中的AChE活性均高于其余各組（P均＜0.05）?？瞻捉M、UA組、AlCl3組、AlCl3+UA組大鼠海馬組織中AChE活性分別為（6.08 ±1.14）、（5.83 ± 0.91）、（17.65 ± 2.52）、（8.96 ±1.29）μmol/mg，其中AlCl3組大鼠海馬組織中的AChE活性均高于其余各組（P均＜0.05）。

2.4 各組大鼠大腦皮層和海馬組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物活性比較 各組大鼠大腦皮層中氧化應(yīng)激標(biāo)志物活性比較和各組大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物活性比較見(jiàn)表2、3。由表2、3可知，AlCl3組大鼠大腦皮層和海馬組織中TBARS活性均高于其余各組，SOD、CAT、GSH活性均低于其余各組（P均＜0.05）。

表2 各組大鼠大腦皮層中氧化應(yīng)激標(biāo)志物活性比較（±s）

表2 各組大鼠大腦皮層中氧化應(yīng)激標(biāo)志物活性比較（±s）

注：與空白組相比，aP＜0.05；與UA組相比，bP＜0.05；與AlCl3組相比，cP＜0.05。

組別空白組UA組AlCl3組AlCl3+UA組GSH（U/mg protein）21.06 ± 0.7021.37 ± 0.719.64 ± 0.32ab 18.95 ± 0.63c TBARS（nmol/mg protein）6.14 ± 0.206.10 ± 0.2014.60 ± 0.48ab 8.94 ± 0.30c SOD（U/mg protein）4.18 ± 0.144.20 ± 0.141.24 ± 0.04ab 2.94 ± 0.10c CAT（U/mg protein）3.45 ± 0.113.52 ± 0.121.28 ± 0.04ab 2.40 ± 0.08c

表3 各組大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物活性比較（±s）

表3 各組大鼠海馬組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物活性比較（±s）

注：與空白組相比，aP＜0.05；與UA組相比，bP＜0.05；與AlCl3組相比，cP＜0.05。

組別空白組UA組AlCl3組AlCl3+UA組GSH（U/mg protein）22.74 ± 0.7522.86 ± 0.768.64 ± 0.29ab 18.37 ± 0.61c TBARS（nmol/mg protein）2.47 ± 0.082.50 ± 0.087.36 ± 0.24ab 4.98 ± 0.16c SOD（U/mg protein）6.15 ± 0.206.20 ± 0.202.05 ± 0.06ab 4.96 ± 0.16c CAT（U/mg protein）4.23 ± 0.144.20 ± 0.141.28 ± 0.04ab 2.63 ± 0.09c

2.5 各組大鼠大腦皮層和海馬組織中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 各組大鼠大腦皮層和海馬組織中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表4、5。由表4、5可知，AlCl3組大鼠大腦皮層和海馬組織中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于其余各組（P均＜0.05）。

表4 各組大鼠大腦皮層中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 各組大鼠大腦皮層中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組相比，aP＜0.05；與UA組相比，bP＜0.05；與AlCl3組相比，cP＜0.05。

組別空白組UA組AlCl3組AlCl3+UA組COX-2 mRNA 1.00 ± 0.080.97 ± 0.075.88 ± 0.56ab 1.46 ± 0.11c TNF-α mRNA 1.00 ± 0.081.01 ± 0.086.18 ± 0.59ab 2.64 ± 0.26c IL-6 mRNA 1.00 ± 0.081.02 ± 0.097.25 ± 0.70ab 2.97 ± 0.26c NF-κB mRNA 1.00 ± 0.081.01 ± 0.088.08 ± 0.77ab 3.17 ± 0.29c

表5 各組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表5 各組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組相比，aP＜0.05；與UA組相比，bP＜0.05；與AlCl3組相比，cP＜0.05。

組別空白組UA組AlCl3組AlCl3+UA組COX-2 mRNA 1.00 ± 0.080.99 ± 0.085.95 ± 0.57ab 1.50 ± 0.13c TNF-α mRNA 1.00 ± 0.081.02 ± 0.096.45 ± 0.62ab 2.86 ± 0.26c IL-6 mRNA 1.00 ± 0.081.05 ± 0.107.32 ± 0.71ab 3.04 ± 0.28c NF-κB mRNA 1.00 ± 0.081.02 ± 0.098.17 ± 0.79ab 3.24 ± 0.30c

3 討論

與其他評(píng)估方法相比，行為變化是鋁接觸后神經(jīng)毒性更直觀的表現(xiàn)。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，Al-Cl3組比空白組到達(dá)固定平臺(tái)所需的時(shí)間要長(zhǎng)得多，這表明AlCl3組大鼠存在認(rèn)知功能缺陷，而經(jīng)UA治療后的大鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)間縮短。本研究為UA減輕AlCl3對(duì)大鼠的認(rèn)知功能障礙提供了證據(jù)。既往研究［12］報(bào)告稱，在學(xué)習(xí)和記憶測(cè)試中，生理功能受損或運(yùn)動(dòng)能力下降會(huì)降低記憶力。而本研究正好證明了UA顯著改善了學(xué)習(xí)和記憶，從而改善了認(rèn)知障礙。

鋁會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡丟失，從而導(dǎo)致與AD相關(guān)的神經(jīng)退行性變。鋁是一種非氧化還原的三價(jià)陽(yáng)離子，由于其神經(jīng)毒性，已被認(rèn)為是各種神經(jīng)疾病的致病因素。鋁在腦內(nèi)的蓄積被認(rèn)為是AD的致病因素之一，鋁通過(guò)改變血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的親脂性而影響B(tài)BB的完整性和通透性。我們發(fā)現(xiàn)，AlCl3誘導(dǎo)的大鼠海馬和大腦皮層中的鋁含量升高，而UA降低了鋁含量，對(duì)AD動(dòng)物模型起到神經(jīng)保護(hù)作用。

AChE是一種將神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿轉(zhuǎn)化為非活性代謝產(chǎn)物的腦酶。許多神經(jīng)精神疾病與AChE活性增加有關(guān)，AChE活性對(duì)認(rèn)知過(guò)程至關(guān)重要。已有研究［13］表明，由于AChE活性增加，AD患者大腦中的乙酰膽堿水平較低。鋁的神經(jīng)毒性作用顯著增強(qiáng)了AChE的活性，該酶能分解乙酰膽堿。越來(lái)越多的研究［14］表明，連續(xù)45 d灌胃AlCl3100 mg/（kg·d）的大鼠，AChE活性增加，被動(dòng)回避記憶受損。我們的研究結(jié)果也證實(shí)了UA具有神經(jīng)保護(hù)作用，從而提高AlCl3誘導(dǎo)AD大鼠的認(rèn)知功能。

AlCl3誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性可能與氧化應(yīng)激升高引起的神經(jīng)退行性變有關(guān)。據(jù)研究［15］報(bào)道，AlCl3可能導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，可能涉及由超氧化物自由基陰離子與AlCl3的結(jié)合形成鋁超氧化物半還原自由基離子，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期接觸鋁明顯降低了SOD、CAT和GSH活性，而增加了TBARS活性。在既往研究［16］中發(fā)現(xiàn)了一致的結(jié)果，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致大鼠大腦的氧化損傷，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能下降。TBARS活性的升高表明鋁的毒性對(duì)細(xì)胞造成了自由基損傷。同樣，YUAN等［17］人報(bào)道，通過(guò)飲用水給予AlCl3導(dǎo)致大鼠額葉皮層海馬組織中TBARS活性顯著升高。UA治療后，可增加保護(hù)性抗氧化酶及降低TBARS使大鼠大腦中的氧化應(yīng)激指標(biāo)恢復(fù)。當(dāng)SOD、CAT將超氧化物陰離子自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫（H2O2）時(shí)，需要SOD來(lái)防止GSH消耗。SOD和CAT活性的降低可能是由蛋白質(zhì)氧化引起的。本研究可證明UA能顯著降低AlCl3誘導(dǎo)AD大鼠體內(nèi)GSH水平的耗竭，從而有利于避免與鋁接觸相關(guān)的氧化損傷，與早期的一項(xiàng)研究［18］發(fā)現(xiàn)熊果酸可以減少各種疾病的氧化應(yīng)激一致。

神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素是神經(jīng)炎癥，它可能導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶方面的問(wèn)題。AD等腦部疾病的異常發(fā)展在很大程度上依賴于神經(jīng)炎癥。由于長(zhǎng)期接觸AlCl3，大腦中會(huì)釋放炎癥因子，如TNF-α、IL-6和COX-2。據(jù)研究［19］報(bào)道，AD患者的血液和腦組織具有較高水平的TNF-α、IL-6和COX-2。與COX-2類(lèi)似，TNF-α可能損害睡眠并降低運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。而與記憶和學(xué)習(xí)相關(guān)的大腦突觸可塑性和神經(jīng)發(fā)生受到NF-κB的重要影響。此外，神經(jīng)毒性和NF-κB之間的關(guān)系被廣泛報(bào)道，當(dāng)NF-κB水平降低時(shí)，神經(jīng)毒性被抑制。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)灌胃AlCl3后，大腦皮層和海馬組織中的TNF-α、IL-6、NF-κB和COX-2的水平顯著升高。此外，UA可抑制AlCl3引起的神經(jīng)炎癥。這些結(jié)果表明，UA的抗炎作用可能與其調(diào)節(jié)大腦皮層和海馬組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、NF-κB和COX-2的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，UA可改善AlCl3誘導(dǎo)的AD模型大鼠的認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與降低大鼠大腦皮層和海馬組織中鋁含量、AChE活性、氧化應(yīng)激水平和炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。這些研究結(jié)果都表明熊果酸可能有助于阻止AD的發(fā)生和進(jìn)展，從而改善AD大鼠的認(rèn)知功能。下一步我們將擴(kuò)大樣本量及增加雌性大鼠，以減少樣本量及性別誤差，并繼續(xù)研究熊果酸對(duì)AD大鼠的神經(jīng)作用保護(hù)機(jī)制。