益生元-乳酸菌發(fā)酵活性成分對護(hù)膚功效的影響

唐柳映 曹曉蕊 伍文怡 劉可兒 王昌濤

[摘 要]目的 研究益生元-乳酸菌發(fā)酵活性成分的抗氧化性能，分析其對護(hù)膚功效的影響。方法 采用傳統(tǒng)微生物發(fā)酵法對表皮葡萄球菌（SE）和植物乳桿菌（PC）進(jìn)行發(fā)酵得到活性成分，之后通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）抗氧化檢測、羥基自由基清除、超氧陰離子清除等實(shí)驗(yàn)方法來檢測活性成分的抗氧化能力。結(jié)果 兩種發(fā)酵液的活性成分含量在不同濃度益生元的影響下增長不同，最適宜SE生長的低聚果糖益生元濃度為0.5%，最適宜PC生長的低聚果糖益生元濃度則為1.5%。結(jié)論 在2.5%的低聚果糖濃度下培養(yǎng)出的PC羥基自由基清除率效果最佳，對SE更適宜的低聚果糖影響抗氧化性能的濃度為1.5%～2.5%，此濃度下可以得到更高效的益生元-乳酸菌發(fā)酵活性成分，從而發(fā)揮護(hù)膚功效。

[關(guān)鍵詞] 益生元；乳酸菌發(fā)酵；抗氧化性；化妝品原料

[中圖分類號] Q939.11+7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1004-4949（2024）05-0029-04

Effect of Active Ingredients of Prebiotics-lactic Acid Bacteria Fermentation for Skin Care Efficacy

TANG Liu-ying， CAO Xiao-rui， WU Wen-yi， LIU Ke-er， WANG Chang-tao

（College of Chemistry and Materials Engineering， Beijing Technology and Business University， Beijing 100048， China）

[Abstract]Objective To study the antioxidant properties of the active ingredients of prebiotics-lactic acid bacteria fermentation， and analyze its effect on skin care. Methods Staphylococcus epidermoides （SE） and lactobacillus plantarum （PC） were fermented by traditional microbial fermentation method to obtain the active ingredients. Then， antioxidant detection， hydroxyl radical scavenging and superoxide anion scavenging of 1， 1-diphenyl-2-tritrophenylhydrazine （DPPH） were used to detect the antioxidant roperties of the active ingredients. Results The content of active ingredients in the two fermentation solutions increased differently under the influence of different concentrations of prebiotics. The optimal concentration of fructooligosaccharides prebiotics for SE growth was 0.5%， and that for PC growth was 1.5%. Conclusion The hydroxyl radical scavenging effect of PC cultured at 2.5% concentration of fructooligosaccharide is the best， and for SE， the optimal concentration of fructooligosaccharide affecting the antioxidant performance is between 1.5% and 2.5%. At this concentration， more efficient active ingredients of prebioticslactobacillus fermentation for skin care can be obtained.

[Key words] Prebiotics； Lactic acid bacteria fermentation； Antioxidant properties； Cosmetic ingredients

乳酸菌（lactic acid bacteria）是指通過發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱[1]。主要通過自身作用、發(fā)酵產(chǎn)酸抑制有害菌生長和代謝、產(chǎn)生異生物質(zhì)3方面發(fā)揮其益生作用[2]。而益生菌是一類通過改善宿主腸道微生物菌群的平衡而發(fā)揮作用的活性微生物[3]。乳酸菌作為一種益生菌，具有分布廣泛、數(shù)量眾多、種類豐富的特點(diǎn)[4]。同時(shí)，乳酸菌還具有耐酸、耐膽鹽、抗氧化、高黏附和生成短鏈脂肪酸等優(yōu)良特性[5]。乳酸菌的發(fā)酵工藝綠色安全，且趨向于產(chǎn)業(yè)化，本研究使用益生元對表皮葡萄球菌（SE）和植物乳桿菌（PC）進(jìn)行發(fā)酵后獲得溶胞產(chǎn)物，并對活性成分含量、抗氧化等進(jìn)行功效檢測，旨在探究出益生元-乳酸菌發(fā)酵得到的活性成分的最高效的護(hù)膚功效濃度或濃度范圍，為化妝品微生物天然原料領(lǐng)域增加實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 低聚果糖（益生元）、表皮葡萄球菌、植物乳桿菌（乳酸菌）、溶菌肉湯（LB培養(yǎng)基）、MRS肉湯培養(yǎng)基、去離子水、DPPH粉末、無水乙醇、FeSO4粉末、30%H2O2、水楊酸粉末、Tris粉末、鹽酸溶液、鄰苯三酚粉末。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)以低聚果糖作為益生元，分別加入SE和PC的液體培養(yǎng)基。其中，每個(gè)菌種各分為6個(gè)不同的低聚果糖益生元濃度梯度，即0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%。液體培養(yǎng)基制作完成后加入菌株[6]。取1 ml菌液加入到益生元溶液中，在600 nm的波長下測量OD值。采用DPPH自由基清除能力測定、羥基自由基清除能力測定及超氧根離子清除能力測定這3種方法分別測量6個(gè)不同益生元濃度下培養(yǎng)的菌株溶液上清液的自由基清除率，即抗氧化值[7]。

1.2.1菌株的培養(yǎng) 用接種環(huán)取適量SE凍存液接種到LB固體培養(yǎng)基中。適量PC凍存液接種到MRS固體培養(yǎng)基中。24 h后，將SE和PC從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基，分別溶解于液體培養(yǎng)基（編號0、0號瓶）中。放入搖床培養(yǎng)24 h。SE培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)濕度為60%；PC培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)濕度為60%[8]。

1.2.2接菌 從0號瓶每次取1 ml分別加入1～6號瓶中，放入搖床24 h。

1.2.3測定活性成分含量 取6支1.5 ml離心管，均加入去離子水800 μl，再分別加入1～6號瓶溶液200 μl，并做3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。從每支離心管取100 μl滴入孔板，用酶標(biāo)儀在波長600 nm下測定OD值。

1.2.4提取上清液 取6支50 ml離心管，分別加入1～6號瓶溶液，每兩管一組，在30～50 g兩兩對稱，離心，取上清液。仿照上述步驟提取1～6號瓶的上清液。

1.2.5測定抗氧化性 ①DPPH自由基清除能力測定：首先配制DPPH乙醇溶液，再將樣品用樣品溶劑進(jìn)行倍半稀釋，并配制成6個(gè)梯度，分別稀釋100%、80%、60%、40%、20%、10%；其中A1組成分為待測液100 μl、DPPH 100 μl；A2組成分為DPPH 100 μl、去離子水100 μl；A3組成分為待測液100 μl、無水乙醇100 μl；最后避光下反應(yīng)30 min，在波長517 nm下測吸光度；②羥基自由基清除能力測定：首先配制FeSO4溶液、H2O2溶液、水楊酸乙醇溶液；隨后配制待測液：將樣品用樣品溶劑進(jìn)行倍半稀釋，并配制成5個(gè)梯度，分別稀釋100%、80%、60%、40%、20%；其中A組成分為蒸餾水0.2 ml、FeSO4溶液0.2 ml、H2O2溶液0.4 ml；B組成分為樣品液0.2 ml、FeSO4溶液0.2 ml、H2O2溶液0.4 ml；C組成分為蒸餾水0.2 ml、FeSO4溶液0.2 ml、H2O2溶液0.4 ml；D組成分為樣品液0.2 ml、FeSO4溶液0.2 ml、H2O2溶液0.4 ml；將配制好的溶液反應(yīng)10 min；隨后向A組中加入水楊酸乙醇溶液0.2 ml；B組中加入水楊酸乙醇溶液0.2 ml；C組中加入無水乙醇0.2 ml；D組中加入無水乙醇0.2 ml；再次將配制好溶液反應(yīng)30 min后，對反應(yīng)液進(jìn)行2～3 min的離心，各取100 μl上清液加至96孔板中；最后在波長為510 nm下測吸光度；③超氧陰離子自由基清除能力測定：首先配制Tris溶液，隨后配制鹽酸溶液：鹽酸溶液A 0.05 mol/L；鹽酸溶液B 10 mmol/L；鹽酸溶液C 3 mol/L；再配制Tris-HCl溶液、鄰苯三酚溶液；待測液：將樣品用樣品溶劑進(jìn)行倍半稀釋，并配制成6個(gè)梯度，分別稀釋100%、80%、60%、40%、20%、10%；其中A1、A2、A3組成分均為Tris-HCl溶液0.5 ml；配制好的溶液均在24 ℃下水浴保溫20 min，隨后向A1組中加入蒸餾水0.25 ml、鄰苯三酚溶液0.2 ml；A2組中加入樣品液0.25 ml、鄰苯三酚溶液0.2 ml；A3組中加入樣品液0.25 ml、蒸餾水0.2 ml，將其混勻，反應(yīng)17～18 min；向A1、A2、A3組中均加入鹽酸溶液C 0.05 ml，反應(yīng)結(jié)束；最后在波長510 nm下測吸光度。

2 結(jié)果

2.1 不同益生元濃度下的SE和PC生長情況 0.5%低聚果糖含量的SE發(fā)酵液的OD值為0.3949，OD值最大，低聚果糖濃度為1%和濃度為0.5%的SE發(fā)酵液的OD值數(shù)值相近；1.5%低聚果糖含量的PC發(fā)酵液的OD值為0.5789，為其平行對照組中OD值最高，2.5%低聚果糖含量的PC發(fā)酵液的OD值為0.5674，與1.5%低聚果糖含量的PC發(fā)酵液近似，見圖1。

2.2 不同益生元濃度下PC和SE的自由基清除能力在羥基自由基清除率的測量方法下，2.5%的低聚果糖濃度下培養(yǎng)出的PC發(fā)酵液的P值（1.4466）高于1.5%的低聚果糖濃度下培養(yǎng)出的PC的P值（0.6444），見圖2。同樣是在羥基自由基的測量方法下，2.5%的低聚果糖濃度的P值（0.4665）高于1.5%的低聚果糖濃度的P值（0.2891），但二者較為近似，見圖3。

3 討論

乳酸菌具有安全、高效綠色、副產(chǎn)物少、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，在發(fā)酵領(lǐng)域起著十分廣泛而重要的作用。國內(nèi)對于乳酸菌發(fā)酵技術(shù)逐漸趨于多面化，全世界的乳酸菌市場發(fā)展迅猛的同時(shí)，我國的乳酸菌市場也在基礎(chǔ)研究、成品應(yīng)用和市場開發(fā)等各個(gè)方面取得了一定成績，比如植物基食品乳酸菌發(fā)酵開發(fā)、乳酸菌生物工程育種等，但大多都是應(yīng)用于食品方面。近年來，化妝品市場中追求植物或天然原料，追求天然、無添加化妝品功效，乳酸菌是來源廣泛的一類天然原料，而乳酸菌發(fā)酵得到的活性成分具有很好的抗氧化、抗炎功效，將乳酸菌發(fā)酵活性應(yīng)用于化妝品中，從而增強(qiáng)抗炎、抗氧化等功效，是一種更安全、高效的選擇。目前對乳酸菌發(fā)酵活性液的功效探究的相關(guān)研究甚少，本研究對其展開基礎(chǔ)研究，以期為天然化妝品原料領(lǐng)域增加可靠性數(shù)據(jù)和有力支撐。

本研究結(jié)果表明，兩種菌在添加益生元低聚果糖的發(fā)酵環(huán)境中生長狀況不同，主要的原因可能是不同種菌代謝低聚果糖的酶系統(tǒng)存在差異[9]。最適宜SE生長的低聚果糖益生元濃度為0.5%，最適宜PC生長的低聚果糖益生元濃度則為1.5%，表明低聚果糖在這兩種菌株發(fā)酵液中最適添加量，而PC對低聚果糖的適宜濃度較SE高，原因可能是PC對低聚果糖的利用率較高，相宜性好，從而使得菌株生長繁殖快[10]。添加了低聚果糖的菌株發(fā)酵液能夠有效地清除羥基自由基[11]，且與濃度呈正相關(guān)，表明低聚果糖發(fā)酵液具有一定的抗氧化活性[12]。發(fā)酵液的抗氧化作用對維持微生態(tài)的平衡有著重要作用。有研究表明[13]，乳酸菌在發(fā)酵時(shí)可以增加發(fā)酵液中的總酚等化合物的含量，同時(shí)增加具有給質(zhì)子特性化合物的可用性，這些化合物能夠有效提高DPPH自由基清除率，從而提高抗氧化活性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，低聚果糖含量為1.5%與2.5%的SE發(fā)酵液和PC發(fā)酵液對于羥基自由基的清除率相差無幾，經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)、討論分析認(rèn)為，可能是添加低聚果糖益生元的濃度差異不大，導(dǎo)致兩種發(fā)酵液中增加總酚等化合物的含量相差甚微，進(jìn)而使得抗氧化活性差別不顯著[14，15]。

綜上所述，添加了低聚果糖的SE和PC發(fā)酵液，兩種菌均生長旺盛，發(fā)酵液的自由基清除能力提高，表明低聚果糖的加入能提高發(fā)酵液的抗氧化能力，具體機(jī)理有待研究。目前乳酸菌和益生元的種類繁多，使得發(fā)酵產(chǎn)物具有差異性，以致發(fā)酵液的功能效果不盡相同，因此篩選與乳酸菌最相適宜的益生元還需繼續(xù)探究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]秦楠，張娜郡，陳超，等.黨參發(fā)酵工藝及成分變化研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2023，41（6）：232-236，277-278.

[2]田興芳.乳酸菌抗氧化活性測定及潛在應(yīng)用研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2023.

[3]何江龍，牟文榮，張童童，等.Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化地黃酵素的制備工藝及質(zhì)量評價(jià)[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2023，38（10）：2182-2191.

[4]李晨，殷朝敏，范秀芝，等.不同提取液制備的輻照裂褶菌多糖理化性質(zhì)、抗氧化和益生元活性分析[C]//中國食用菌協(xié)會，中國食用菌協(xié)會藥用真菌委員會.第十二屆藥用真菌學(xué)術(shù)研討會論文集.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所.2023：1.

[5]羅曉霞，覃思華，王暉迪，等.細(xì)菌外囊泡在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制及應(yīng)用前景[J].協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志，2023，14（5）：915-924.

[6]馬騰，李亞琳，孫志宏，等.益生菌與腸-器官軸的相互作用[J].衛(wèi)生研究，2023，52（5）：837-844，852.

[7]趙暾，王韻，馬雅軍，等.短鏈脂肪酸及其在微生物腸腦軸中作用研究進(jìn)展[J].中華老年心腦血管病雜志，2022，24（10）：1116-1117.

[8]劉晶，張贊，劉洋，等.表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ESAT-6-Ag85A基因的侵入型乳酸菌免疫特性研究[J].中國免疫學(xué)雜志，2019，35（1）：10-14.

[9]時(shí)維平，史海磊，付廣明，等.活菌型乳酸菌組織浸泡法在細(xì)菌陽性對照中的應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2023，39（6）：757-758.

[10]羅小琴，楊鶴翔，趙青川.腸道菌群干預(yù)對腫瘤患者肌肉減少癥的影響[J].腫瘤代謝與營養(yǎng)電子雜志，2023，10（5）：594-600.

[11]徐張揚(yáng)，劉光盛，馮旭，等.復(fù)合益生元制劑對右旋葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響[J].中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志，2023，30（1）：76-81.

[12]屈青松，林峰，趙崇妍，等.發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵人參工藝優(yōu)化及人參皂苷抗氧化活性測定[J].中成藥，2020，42（10）：2738-2743.

[13]Paitán-Anticona E，Sotelo-Méndez A，Osorio NB，et al.Influence from the type of birth on the content of lactic acid bacteria in neonate meconium[J].Rev Peru Med Exp Salud Publica，2020，37（1）：93-98.

[14]屈青松，周晴，石艷雙，等.乳酸菌發(fā)酵中藥功能及其增效機(jī)制的研究進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2022，15（9）：1707-1715.

[15]那立亞，簡江，白龍男，等.乳酸菌發(fā)酵液防脫育發(fā)功效的臨床評價(jià)研究[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2020，38（7）：63-64.

收稿日期：2023-11-26 編輯：扶田