胰島素樣生長因子2基因在A型主動脈夾層組織中的表達研究

王海濤 蔣丁勝 方澤民

A型主動脈夾層(type A aortic dissection,TAAD)是一種心血管急危重癥,病人需要得到快速的診斷和治療[1]。目前,針對TAAD的治療方法主要依靠外科手術,缺乏行之有效的保守治療方案以及預防篩選方案。TAAD的發(fā)病機制涉及多種病理生理過程,且其中的分子機制尚未完全闡明。胰島素樣生長因子2(insulin like growth factor 2,IGF2)是系統(tǒng)發(fā)育過程中經(jīng)典的胰島素/ IGF信號軸的組成部分,在調(diào)節(jié)細胞的生存、生長和增殖以及代謝方面均發(fā)揮重要作用[2]。IGF2表達的異常增多在乳腺癌、肝癌、肺癌等癌癥研究中均有報道[3],但IGF2在心血管疾病領域研究較少。本研究探討IGF2在TAAD中的表達情況及其臨床意義。

對象與方法

一、對象

2015年1月～2019年12月我院行升主動脈置換術的TAAD病人9例(夾層組)和心臟移植供體修剪下來主動脈5例(對照組),標本均取用升主動脈部分。納入標準:夾層組入院后行主動脈血管增強CT(CTA)確診為TAAD。排除標準:均排除合并馬凡綜合征、創(chuàng)傷性夾層、腫瘤、風濕性疾病、傳染性疾病等。本研究獲得我院倫理委員會批準并獲得知情同意書。

二、方法

1.術中所獲組織分生標本組立即切割為1.0 cm3的組織塊,并立即轉移至細胞凍存管中后經(jīng)液氮速凍,-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２±順吮痉湃?%甲醛溶液中室溫保存,經(jīng)過脫水、固定、石蠟包埋等處理,并將主動脈壁病理標本切為5 μm厚的石蠟切片。

2.蘇木精-伊紅(HE)染色:切片脫蠟水合后經(jīng)蘇木素染色,1%的鹽酸酒精分化,Scott液染色,伊紅染液染色。再將切片依次放入95%酒精Ⅰ ,95%酒精Ⅱ,無水乙醇Ⅰ ,無水乙醇Ⅱ,二甲苯Ⅰ ,二甲苯Ⅱ中脫水透明,最后將切片從二甲苯拿出來稍晾干,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察拍照。

3.彈性纖維(EVG)染色:將切片脫蠟水合后放入高錳酸鉀,接著放入Elastin染液中浸染過夜,再用95%乙醇浸泡2次。放入Van Gieson染液,后經(jīng)梯度乙醇脫水,封片后顯微鏡下觀察拍照。

4.蛋白質免疫印跡法(Western Blot):取凍存的組織塊研磨后用現(xiàn)配制的裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解后超聲。將所得蛋白樣品使用BCA蛋白質定量試劑盒(Thermo Fisher scientific,23227)測定總蛋白質濃度。將蛋白質變性后每組蛋白樣品按20 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉移到PVDF膜上,使用5%脫脂牛奶(5 g脫脂奶粉∶1 000 ml TBST)室溫封閉1小時后用TBST洗膜后置于含有相應一抗的抗體稀釋液(IGF2,1∶100,ATLAS,HPA007556)中于4 ℃冰箱孵育過夜。用TBST洗膜,然后使用相應二抗室溫孵育2小時,再次使用TBST洗膜。加入顯影液,使用Chemi Doc TMXRS+成像系統(tǒng)(BioRad)顯影成像,使用Image Lab軟件測定條帶中蛋白質的相對表達量。

5.免疫組化染色:切片脫蠟、水合后進行EDTA抗原修復。用3%的H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶,PBS漂洗。滴加5%BSA封閉。去除BSA,滴加50 μl一抗(IGF2,1∶100,ATLAS,HPA007556),4 ℃孵育過夜后,PBS漂洗。滴加反應增強液37 ℃孵育,PBS漂洗。滴加二抗孵育,PBS洗3次。滴加現(xiàn)配DAB工作液染色,PBS漂洗。蘇木素復染、鹽酸酒精分化。切片脫水透明。中性樹脂封片,采集圖像,使用Image J軟件進行分析。

三、統(tǒng)計學分析

結果

1.HE染色:對照組主動脈結構完整,血管平滑肌細胞排列整齊,細胞呈長梭形,胞質豐富,細胞核深染;夾層組主動脈壁中平滑肌細胞皺縮且排列紊亂,胞核變小且胞質染色變淺,細胞形態(tài)發(fā)生改變并伴有數(shù)量的下降。見圖1A、B。

A 對照組 HE染色,可見主動脈壁結構規(guī)整,主動脈平滑肌細胞排列有序。B 夾層組,可見主動脈壁結構退變,主動脈平滑肌細胞排列紊亂。C 對照組,主動脈壁彈力纖維完整緊密。D 夾層組,主動脈壁彈力纖維斷裂、丟失

2.EVG染色:對照組主動脈中彈力纖維完整連續(xù),排列緊密有序,夾層組主動脈壁中彈性纖維染色變淺,彈力纖維排列疏松,纖維變細且斷裂增加。見圖1C、D。

3.IGF2蛋白水平在主動脈夾層組織和正常組織中的差異表達:Western Blot檢測結果顯示,正常組織表達量為1.000±0.370,主動脈夾層組織中IGF2蛋白相對表達量(夾層組)為0.229±0.148),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2)。提示IGF2可能在維持主動脈正常的結構和功能方面發(fā)揮重要作用,而主動脈壁組織中如果缺乏IGF2,則可能導致主動脈的結構發(fā)生紊亂和功能發(fā)生異常,甚至導致夾層發(fā)生發(fā)展。

圖2 兩組主動脈壁組織中IGF2蛋白表達及定量(P<0.05)

IGF2陽性表達為棕色,可見A對照組中IGF2表達顯著高于B夾層組

4.免疫組化染色:IGF2主要在主動脈平滑肌細胞核中表達。對照組主動脈中可見大量平滑肌細胞核中深染的棕色顆粒(圖3),Image J統(tǒng)計顯示,對照組主動脈平滑肌細胞中IGF2相對表達量為13.87±1.21,夾層組為0.6167±0.210,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3)。

討論

主動脈夾層的形成是由高血壓、遺傳因素等多種因素導致主動脈內(nèi)膜破裂,血液進入主動脈中膜形成真假腔,假腔的形成隨時可能導致主動脈破裂危及病人的生命。關于主動脈夾層的病理機制,目前已知的主要包括平滑肌細胞丟失、細胞外基質紊亂、彈性纖維斷裂、炎癥細胞浸潤等[4]。血管平滑肌細胞的丟失,通常認為是與平滑肌細胞增殖、凋亡功能異常有關。IGFs在各種組織器官的生長促進中發(fā)揮著關鍵的自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌作用,調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡[5]。IGF2是胰島素/IGF系統(tǒng)中的一部分,該系統(tǒng)由胰島素、IGFs、IGF受體(IGFRs)、IGF結合蛋白(IGFBPs)及相關蛋白酶組成[3]。IGF2在多種器官和組織中廣泛表達,并在組織中發(fā)揮特異性作用。有研究表明,IGF2在癌細胞中表達上調(diào),可增強其生存和侵襲能力,主要通過結合IGF1R激活下游通路發(fā)揮生物學作用,促進細胞增殖,抑制細胞凋亡[6]。還有研究表明,IGF2可以增加參與血管生成的基因的表達,以此通過增加癌癥細胞的血液供應來促進腫瘤的生長和擴散[7]。雖然對IGF2與心血管疾病相關的研究有限,但一些研究表明,IGF2水平可能與CVD風險增加有關。

血管平滑肌細胞增殖維持主動脈壁內(nèi)血管平滑肌的數(shù)量,可以起到保護作用并延緩主動脈瘤和主動脈夾層的發(fā)展[8]。IGF2可以促進動脈血管平滑肌細胞的生長和增殖,通過下調(diào)IGF2可以抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移[9]。IGF2通過與平滑肌細胞表面的IGFR1結合,激活了刺激細胞周期和促進細胞增殖的信號通路,增加參與細胞周期進展和DNA合成的基因的表達,促進細胞增殖。IGF2在血管生成中的作用也被揭示。尖端細胞是一種由促血管生成因子誘導的內(nèi)皮細胞的轉導表型,在引導新生血管生成方面發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn),IGF2對維持尖端細胞十分重要[10]。IGF2的敲除通過抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的發(fā)芽,以及IGFBP3和IGFBP4通過對IGF2-IGFR1進行調(diào)控繼而影響新生血管的生成[11]。

細胞凋亡是程序性細胞死亡的過程,對組織器官的發(fā)育和維持正常結構至關重要。在主動脈夾層病人樣本中,促進凋亡的Bcl-2家族蛋白(Bax)上調(diào),而抑制凋亡的Bcl-2家族蛋白(Bcl-2)下調(diào),提示凋亡增強是主動脈夾層發(fā)生的重要過程[12]。IGF2在調(diào)節(jié)細胞凋亡中也發(fā)揮作用。有研究表明,IGF2通過抑制細胞凋亡來促進細胞存活。如在神經(jīng)退行性疾病的動物模型中,IGF2已被證明可以通過激活PI3K/AKT/CREB信號通路保護海馬體免受細胞凋亡[13]。在癌癥細胞中,IGF2已被證明通過抑制凋亡來促進細胞存活和對化療的抵抗。有關IGF2 mRNA結合蛋白3(IGF2BP3)的研究顯示,在IGF2BP3敲除后,細胞IGF2蛋白減少且受輻射誘導的細胞凋亡增加,在將重組IGF2應用于培養(yǎng)物后恢復了細胞對凋亡的抵抗力[14]。敲低IGF2可以提高氧化低密度脂蛋白刺激的血管平滑肌細胞的細胞凋亡水平[15]?？梢奍GF2在抵抗細胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。

本研究存在一定局限性。對照組來源于未患有主動脈疾病的心臟移植供體捐獻者,缺少主動脈CTA檢查結果,也缺少主動脈直徑相關數(shù)據(jù)。因此,未能進行IGF2表達量與主動脈直徑關系的相關分析。

本研究發(fā)現(xiàn),IGF2在主動脈夾層病人主動脈壁組織中的表達量顯著降低,IGF2的下調(diào)可能減弱了平滑肌細胞的增殖能力,增加了平滑肌細胞凋亡,進而使得主動脈血管中層結構不能維持,最終引發(fā)主動脈夾層。但對于IGF2的調(diào)控機制,以及是否通過促進血管平滑肌細胞增殖或者抵抗平滑肌細胞凋亡發(fā)揮保護作用,仍需要進一步研究探討。IGF2經(jīng)過深入地研究有望成為預防和治療主動脈夾層的靶點。

利益沖突 所有的作者聲明沒有利益沖突

作者貢獻 王海濤:標本收集、研究實施、文章撰寫;蔣丁勝:實驗設計、文章批閱;方澤民:標本收集、文章批閱、經(jīng)費支持