根瘤內(nèi)生菌群對南洋楹苗木生長的影響

林千禧，鄭會全，路國輝，黃 榮，韋如萍，王潤輝，晏 姝*

(1. 華南師范大學生命科學學院，廣東 廣州 510631；2. 廣東省林業(yè)科學研究院/廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣東 廣州 510520)

根瘤菌（Rhizobia）是革蘭氏陰性無芽孢細菌，能在豆科植物根系分泌的黃酮類化合物激活下誘發(fā)根瘤共生體系的形成[1-3]。根瘤是生物固氮的主要場所，能促進植物和微生物間代謝物和固氮產(chǎn)物的交換，在全球氮循環(huán)、生態(tài)改良和農(nóng)林生產(chǎn)等方面發(fā)揮著重要作用[4]。前人研究發(fā)現(xiàn)，根瘤內(nèi)不僅有根瘤菌，其中還存在著大量非根瘤菌（Nonrhizobia endophytes）[5]，它們與根瘤菌以及與植物體、土壤環(huán)境之間相互作用形成了特殊的微生態(tài)系統(tǒng)。多數(shù)根瘤菌能促進植物生長、增加土壤有機碳、速效氮和全氮含量，發(fā)揮典型的肥力島效應[6-7]，而根瘤內(nèi)其他內(nèi)生菌雖不能誘導結(jié)瘤，但對宿主植物有促生、抗病、內(nèi)生聯(lián)合固氮等作用，因而也越來越受到關(guān)注[8-12]。Rajendran 等[13]研究表明，單獨接種木豆內(nèi)生芽孢桿菌不能使木豆結(jié)瘤或促生而只能提高葉綠素含量；但與根瘤菌共接種時，對植株鮮質(zhì)量、葉綠素含量等均有促進作用。Ibáez等[14]發(fā)現(xiàn)，阿根廷的花生(Arachis hypogaeaL.)根瘤中的Pseudomonasspp.、Enterobacterspp.等內(nèi)生細菌，在與Bradyrhizobium共生菌株混合接種花生時可以增加作物產(chǎn)量。李繼紅等[15]發(fā)現(xiàn)大豆根瘤中幾乎所有菌株都產(chǎn)生IAA，部分可溶解磷礦物，少數(shù)具有固氮能力。

南洋楹（Falcataria falcata） 是豆科Leguminosae 南洋楹屬Falcataria常綠喬木，是國際林業(yè)研究協(xié)會(IUFRO)大力推廣的速生固氮樹種之一。我國自1940 年開始引種南洋楹，該樹種在廣東、廣西等南方省（區(qū)）表現(xiàn)出較強的適應性和速生性，6 a生平均樹高14.5 m、平均胸徑17.5 cm[16]，無愧于“植物賽跑家”的稱號。南洋楹的速生特性決定了其生長發(fā)育需要充足養(yǎng)分[17-20]，苗期常采用高劑量配方施肥配合精細管理等方式[18-20]。而采用接種結(jié)瘤促生的方式鮮有報道[21]?；诟鼍c其他內(nèi)生菌群協(xié)同增效的“菌-菌互作”原理，本研究以不同來源南洋楹根瘤提取液為接種菌液，開展南洋楹苗木接種對比試驗，探究微生物共生對其苗期生長結(jié)瘤、生物量積累、光合及固氮的影響，并運用高通量測序技術(shù)對回接根瘤16S rRNA 基因全長測序，并以Silva.138 為參考數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，揭示相對豐度較高的根瘤內(nèi)生菌與南洋楹苗木重要生長指標的關(guān)系，以期為南洋楹微生物菌肥研發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時也可為今后擴展根瘤菌研究視野以及科學利用根瘤中某些非根瘤菌提供依據(jù)[8]。

1 材料與方法

1.1 接種菌液來源

采樣地包括位于廣東省中部的廣州市（113.373 719°E，23.194 212° N）、東部的惠州市（114.241 918°E，23.201 885° N）和西部的茂名市（111.248 662°E ，21.628 686° N）3 個南洋楹苗木培育基地，選擇上述3 個基地中同一種子來源、同一育苗方式培育的0.5 年生優(yōu)質(zhì)南洋楹苗木各5 株，分別采集其根系上天然生長的飽滿、肉色至粉色的球形根瘤10 顆。用清水沖洗去根瘤表面雜質(zhì)，在超凈工作臺中，依次用75% 乙醇溶液30 s、0.1% 升汞溶液8 min 消毒、無菌水清洗5 次后放入潔凈離心管中，加入300 μL 無菌水，用無菌研磨棒將根瘤壓碎。靜置5 min 后，吸取上層液體至200 mL YMA 液體培養(yǎng)基中，28 °C 恒溫搖床120 rpm 條件下振蕩培養(yǎng)2 ～4 d，分光光度計檢測菌液OD600值為1.2 時[22]，獲得接種菌液，編號分別為YZ、YD、YX。

1.2 供試苗木培養(yǎng)

為了盡量控制其他內(nèi)生細菌的干擾和排除不同基因型的生長差異，供接種試驗的南洋楹苗木來源于廣東省林業(yè)科學研究院自主選育的優(yōu)良無性系178 號組培苗，瓶苗規(guī)格為苗高5 cm 左右的生根芽苗。育苗基質(zhì)采用實驗室用高純石英砂和蛭石按體積比1∶1 混合，經(jīng)3 次121 °C 滅菌25 min，分裝于9.5 cm（內(nèi)口徑） × 8 cm（高）塑料育苗袋中。將移栽組培苗放入經(jīng)紫外燈消毒的人工氣候箱中培養(yǎng)，光照強度7 000 lux， 溫度28 °C 、濕度75%、光照時間12 h，每天以純水噴施保持基質(zhì)濕潤。移栽組培苗14 d 左右生長穩(wěn)定。

1.3 接種與施肥試驗設計

選取移栽健康成活的苗木以澆灌方式接種，將菌液均勻澆灌于基質(zhì)表面使其滲透，每株10 mL。采用完全隨機區(qū)組試驗設計，設4 個處理，即分別接種YZ、YD、YX 和對照（澆灌等量無菌YMA 液體培養(yǎng)基），每個處理9 株重復。試驗期間所有苗木每天噴施純水1 次，每15 d 施加Jensen 無氮營養(yǎng)液1 次，每盆每次施加10 mL，共計施加營養(yǎng)液4 次。

1.4 指標測定

苗木移栽培養(yǎng)3 個月后，在不同處理中各選取3 株生長正常的平均苗，即每個處理共計9 株作為待測植株。將苗木從基質(zhì)中小心挖出、洗凈后用吸水紙控干、待測。用SPAD-502 葉綠素儀測定每株中層的成熟葉片的相對葉綠素含量（SPAD,Specialty Products Agricultural Division），每株測定5 片，取其平均值；以直尺測量每株苗高、根系自然舒展后密度達80%以上處的長度（精確到0.1 cm），電子數(shù)顯游標卡尺測量地徑（精確到0.01 mm），摘取每株根瘤并統(tǒng)計單株結(jié)瘤數(shù)，以1/1 000 電子天平稱量每株的地上部分、地下部分及總根瘤鮮質(zhì)量。再將苗木地上部分與地下部置于105 °C 烘箱中殺青30 min，在85 °C 下烘至質(zhì)量恒定，并在干燥器中冷卻后，用電子天平稱取地上部、地下部干質(zhì)量。

采用硫酸-雙氧水消解-凱氏定氮法[23]測定植株的全氮含量；

式中：M為總氮量，a為總干質(zhì)量，b為含氮量，N為固氮量，Mx為接種根瘤菌的南洋楹的總氮量，M0為未接種根瘤菌的南洋楹的總氮量，E為固氮效益。

1.5 根瘤內(nèi)細菌DNA 序列測定及物種注釋

分別收集3 個接種處理待測植株的全部回接根瘤，送北京百邁克生物科技有限公司提取根瘤內(nèi)細菌DNA，進行16S rRNA 基因全長測序，將測得的菌株序列使用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的BLAST 程序在線比對，并從 GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載與待分析序列相近的已知種模式菌株的16S rDNA 序列，用DNAMAN 進行多重比對，確定各菌株的種屬分類地位。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 整理數(shù)據(jù)。使用SPSS 25.0、SAS 8.0、TBtools 等執(zhí)行統(tǒng)計分析及圖表繪制，均值顯著性檢驗采用單因素方差分析和LSD 多重比較（p＜0.05），相關(guān)性分析采用Pearson法（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同試驗處理對南洋楹苗木生長結(jié)瘤的影響

苗木移栽3 個月后，3 個接種處理及對照苗木均能正常生長（圖1A），苗木生長與結(jié)瘤測定結(jié)果表明（圖1B），接種處理的苗高、地徑、根長、根瘤數(shù)、根瘤鮮質(zhì)量等均比對照有極顯著的增長（p＜0.01）。其中YZ 處理的苗木長勢最優(yōu)，苗高、地徑和根長等3 項生長指標值分別達到14.38 cm、2.26 mm、11.25 cm，與對照相比增幅超過或接近90%，YD 處理與YX 處理的3 項指標高于對照48.87%～70.59%。進行接種處理的苗木均能成功接根瘤，而對照根系未見根瘤（圖1A）；不同接種處理的結(jié)瘤數(shù)差異較明顯，數(shù)量以YZ 最多，YD 和YX 的結(jié)瘤數(shù)量相當，3 個處理的根瘤鮮質(zhì)量相差并不大。

圖1 不同處理下南洋楹苗木生長與結(jié)瘤對比圖Fig. 1 Comparison of growth and nodulation of Falcataria falcata seedlings under different treatments

2.2 不同試驗處理對南洋楹苗木生物量積累的影響

對不同試驗處理苗木的地上部分生物量和地下部分生物量分析，結(jié)果（圖2）表明，接種處理的地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量及總鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量等均顯著地高于對照（p＜0.05）。其中，地上部分鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別比對照增加4.4～7.7 倍和5.5～9.3 倍，地下部分鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別比對照增加了4.6 ～10.5 倍和12.0～21.0 倍；3 個接種處理間的根干質(zhì)量差異不顯著（p＞0.05），YZ 處理的生物量積累大于YD 和YX 處理。

圖2 不同處理下南洋楹苗木生物量對比柱狀圖Fig. 2 Contrast histograms of the biomass of Paraserianthes falcataria (L.) Nielsen seedlings under different treatments

2.3 不同試驗處理對南洋楹苗木光合及固氮的影響

對不同試驗處理南洋楹苗木的光合及固氮效應相關(guān)指標測定分析，結(jié)果（圖3）表明，不同接種處理的南洋楹苗木的相對葉綠素含量（SPAD）、總氮量、固氮效益均顯著地高于對照（p＜0.05），含氮量和固氮量與對照差異顯著（p＜0.05）。YZ、YD、YX 處理與CK 相比，SPAD 分別增長了86.18%、78.53%和74.04%，但3 個接種處理間的SPAD 值差異不顯著；含氮量分別增長了53.50%、28.25%和23.09%；總氮量分別增加了15.9、10.1、7.6 倍；固氮效益分別增長了26.51%、11.48% 和12.85%，3 個接種處理間無顯著差異。

圖3 不同處理對南洋楹苗木SPAD 和固氮效應對比柱狀圖Fig. 3 Contrast histograms of effects of different treatments on biomass of Falcataria falcata seedlings

2.4 回接根瘤內(nèi)主要細菌及其與南洋楹苗木生長的關(guān)聯(lián)性分析

2.4.1 根瘤內(nèi)主要細菌及多樣性 圖4、表1 中展示了接種YZ、YD、YX 處理后分別從對應苗木根系上收獲的根瘤內(nèi)生菌種水平的相對豐度數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，接種不同來源的根瘤提取液能夠形成不同的根瘤內(nèi)生菌群落。其中，YZ 處理的根瘤內(nèi)10 種細菌的相對豐度最為均衡，細菌Cenchrus americanus相對豐度最高，為12.12%，其次為敏捷生絲微菌（Hyphomicrobium facile） 和埃氏慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii） ，相對豐度分別為9.94% 和7.66%。YD 處理的根瘤內(nèi)，細菌Cenchrus americanus、 埃氏慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii）、 敏捷生絲微菌（Hyphomicrobium facile）處于主體地位，相對豐度分別為16.74%、8.28% 和21.08%，僅這3 種細菌的相對豐度幾乎達到全部細菌的50%；YX 處理的根瘤內(nèi)豐度最大的3 種內(nèi)生菌與YD 處理相同，其中埃氏慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii）相對豐度達22.41%；此外，YX 中還含有3.5% 的根瘤菌（Rhizobium azooxidifex），含根瘤菌最為豐富。YZ 與YD 處理的埃氏慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii）相對豐度比較接近，分別為7.66%和8.28%。YZ、YD、YX 處理的根瘤的OTU 數(shù)分別為234、206、191 依次遞減，YZ 處理的根瘤內(nèi)香農(nóng)指數(shù)分別為5.54、4.83、4.61，也呈現(xiàn)依次遞減的趨勢。

表1 不同處理根瘤內(nèi)種水平上相對豐度前十的細菌占比及多樣性指數(shù)Table 1 The proportion and diversity index of the top 10 bacteria in relative abundance at species level of nodules amomg different treatments

圖4 不同處理根瘤內(nèi)種水平多樣性柱狀圖Fig. 4 Histogram of species level diversity within the root nodules of different treatments

2.4.2 苗木重要指標的提取 對南洋楹苗木生長與結(jié)瘤、生物量積累、光合及固氮等相關(guān)指標進行主成分分析，結(jié)果（表2）表明，兩個主成分即PC1、PC2 分別解釋總變異的77.14%、15.29%，二者累積貢獻率達92.43%。其中第一主成分（PC1）主要由苗高、根長、根瘤數(shù)、總氮量和固氮量決定，均為正相關(guān)；第2 主成分（PC2）主要由SPAD 決定，載荷量為0.728 0，且表現(xiàn)正相關(guān)。因此，以苗高、根長、根瘤數(shù)、SPAD、總氮量和固氮量等指標來表征南洋楹苗木的綜合情況。

表2 南洋楹生長指標主成分特征值、貢獻率、累積貢獻率及主成分分析因子載荷陣Table 2 The eigenvalue,proportion，cumulative and eigenvectors of the principal component factors(growth index) of Falcataria falcata growth index

2.4.3 根瘤內(nèi)生菌組成與苗木生長的相關(guān)性分析

選取各樣品中相對豐度前五的7 種根瘤內(nèi)生菌（表1），和提取到的7 個主成分（表2）進行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖5）表明：內(nèi)生菌Cenchrus americanus、Pelomonas puraquae都與南洋楹苗高和根瘤數(shù)呈極顯著負相關(guān)關(guān)系（p＜0.01）；細菌denitrifying Fe-II oxidizing bacterium與苗高、根瘤數(shù)呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與含氮量、總氮量和固氮量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.05）；OTU 數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均與苗高和根瘤數(shù)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.01），且香農(nóng)指數(shù)還與含氮量、總氮量和固氮量呈顯著相關(guān)關(guān)系（p＜0.05）。

圖5 南洋楹根瘤內(nèi)生菌與生長指標、OTU 數(shù)及香農(nóng)指數(shù)的相關(guān)分析Fig. 5 Correlation coefficient between nodules of Paraserianthes falcataria (L.) Nielsen and growth index, OTU number and Shannon index

3 討論

豆科植物結(jié)瘤固氮及其生產(chǎn)實踐應用研究在花生(Arachis hypogaeaL.)、大豆（Glycine max(Linn.) Merr.)、苜蓿(Medicago sativaL. ) 等蝶形花亞科的農(nóng)作物和牧草中最為成熟[24-26]。而木本豆科植物已有相關(guān)研究結(jié)果也表明，格木（Erythrophleum fordiiOliv.）、銀合歡（Leucaena leucocephala(Lam.) de Wit）、 海南紅豆（Ormosia pinnata(Lour.) Merr.）等回接高效根瘤菌菌株后，植株的苗高、干質(zhì)量及總氮量分別比對照植株提高0.7～3.2、1.3～15.8、1.3～14.8倍[27]；回接黑木相思根瘤菌株 RITF522 的黑木相思（Acacia melanoxylonR.Br. ） 和銀合歡(Leucaena leucocephala(Lam.) de Wit)，生物量比不接種處理分別增加了 110.1%和59.8%，促生效果顯著[28]；SARR 等[29]在播種后立即接種含根瘤菌混合物的可溶藻酸鹽微珠，觀察到其對金合歡屬阿拉伯膠樹（Acacia senegal(Linn.) Willd）和阿拉伯金合歡（Acacia nilotica(L.) Delile）的生長有明顯促進作用。Dhiman 等[30]發(fā)現(xiàn)與對照植株相比，施加根瘤菌組合PGPR1 + PGPR2 能顯著提高印度黃檀（Dalbergia sissooRoxb. ex DC.）的根系和地上部生物量、結(jié)瘤狀況及固氮酶活性生長指標。而本研究以來源不同根瘤提取液為接種菌液，進行接種處理的南洋楹苗木均能成功結(jié)根瘤。不同接種處理的結(jié)瘤數(shù)差異較明顯，數(shù)量以YZ 最多，YD 和YX 的結(jié)瘤數(shù)量相當，而3 個處理的根瘤鮮質(zhì)量相差并不大，可見接種YD 和YX 的單個根瘤形態(tài)相對較大。與對照相比，苗高增長了53.74%～95.65%，地徑增加了48.74%～89.92%，根長增長了52.91%～98.41%，干質(zhì)量增加了6.4～11.0 倍，SPAD 增長了74.04%～86.18%，含氮量分別增長了23.09%～53.50%；總氮量上比CK 增加了7.6 ～15.9 倍，固氮效益增加了11.48%～26.51%?？梢姡煌囼炋幚韺δ涎箝好缒旧锪糠e累效應的影響趨勢與苗木生長結(jié)瘤效應基本一致，接種處理可顯著促進苗木生物量的積累，特別是極大促進了根系的生長發(fā)育、改變根系的空間結(jié)構(gòu)，使根系網(wǎng)絡更加錯綜復雜、緊密交織。然而，不同來源的接種菌液對南洋楹苗木的促生效果存在一定差異，其中接種菌液YZ 對生長結(jié)瘤和固氮效果最為顯著，該研究結(jié)論可為南洋楹微生物菌肥的研發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

豆科植物根瘤內(nèi)存在除共生根瘤菌外的其它細菌的現(xiàn)象，是一個不爭的事實。王浩等[31]對不同品種大豆根際細菌的種群結(jié)構(gòu)進行了分析，發(fā)現(xiàn)細菌的種群極具多樣性，以變形桿菌(Proteobacteria)類群為主；中國東北地區(qū)栽培大豆根瘤中既有慢生根瘤菌，也有其他6 個不同屬的內(nèi)生菌 (Pantoea、Acinetobacter、Bacillus、Agrobacterium、Burkholderia、Serratia)存在；段如雁[32]探索了花櫚木（Ormosia henryiPrain）根瘤細菌主要由Rhizobium、Bacillus、Bradyrhizobium、Devosia、Pseudomonas等61 屬細菌組成，且不同緯度采集的花櫚木根瘤內(nèi)細菌組成差異較大。本研究發(fā)現(xiàn)，來源不同的南洋楹根瘤提取液能夠與南洋楹根系形成具有不同內(nèi)生菌群組成的根瘤，并在種水平上都以埃氏慢生根瘤菌、慢生根瘤菌等不同根瘤菌占比最大，細菌Cenchrus americanus、敏捷生絲微菌、反硝化Fe-Ⅱ氧化細菌等也占有較大豐度；但OTU 數(shù)和香農(nóng)指數(shù)存在一定差異，以接種菌液YZ 回接根瘤中的細菌物種數(shù)最多和α 多樣性最高。對根瘤內(nèi)生細菌及其與植物生長關(guān)系的研究中，常體現(xiàn)為菌-菌互作、協(xié)同增效的互惠模式，也存在某些功能基因在根瘤內(nèi)生細菌之間發(fā)生橫向轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[33-34]，在根瘤微生態(tài)學研究上具有非常重要的意義。在本研究發(fā)現(xiàn)，與南洋楹生長結(jié)瘤及固氮效應密切正相關(guān)的是OTU 數(shù)及香農(nóng)指數(shù)，而并非某種特定細菌，由此可反映出根瘤內(nèi)生菌種類越豐富、相對豐度越均衡，對南洋楹幼苗協(xié)調(diào)增效作用越顯著。值得提出的是，南洋楹根瘤內(nèi)豐度占比較大、與重要生長指標相關(guān)性顯著的Cenchrus americanus、Pelomonas puraquae和反硝化Fe-II 氧化細菌等3 種細菌均屬于變形菌門β 變形菌綱伯克氏菌目的叢毛單胞菌科（Comamonadaceae），但細菌Cenchrus americanus與南洋楹苗高和根瘤數(shù)目呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)（p＜0.01），而反硝化Fe-Ⅱ氧化細菌與生長結(jié)瘤、固氮和相對葉綠素含量均有不同程度的正相關(guān)關(guān)系，推測是前者能降解根瘤素從而阻礙根瘤的形成，進而對南洋楹幼苗生長起到負面作用。對于后者，有研究表明，與之同屬細菌Aquabacterium pictumsp. nov.是第一個含有葉綠素a 的好氧革蘭氏陰性細菌[35]，而SPAD又與凈光合速率高度正相關(guān)[36]，故推測南洋楹根瘤中的該細菌與葉片中SPAD 具有關(guān)聯(lián)性，可通過調(diào)控光合作用效率[37]、提高植物的光合作用，加強共生固氮作用的能源的供應從而促進苗木的生長，其具體作用機制和效果有待進一步純化培養(yǎng)后觀測研究。

4 結(jié)論

南洋楹根瘤提取液能對南洋楹苗期的生長與結(jié)瘤、生物量積累、光合及固氮起到積極的促進作用，不同來源的接種菌液對苗木的促生效應及回接根瘤內(nèi)生菌群組成存在一定差異，其中來源于廣州市南洋楹苗木培育基地的接種菌液（YZ）對苗木促生、結(jié)瘤和固氮效應最為顯著；3 種接種菌液的回接根瘤中，種水平上都以埃氏慢生根瘤菌、慢生根瘤菌等不同根瘤菌占比最大，但接種菌液YZ 回接根瘤中的細菌物種數(shù)最多和α 多樣性最高，該2 項指標與南洋楹苗高、根瘤數(shù)、含氮量、總氮量和固氮量等呈極顯著或顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.01或p＜0.05），反映出根瘤內(nèi)生菌種類越豐富、相對豐度越均衡，對南洋楹幼苗促生和固氮作用越顯著。