牡丹花青素苷合成關(guān)鍵基因PsDFR啟動子活性分析

周 琳，袁 夢，齊 宇,2，張夢杰，王 雁*

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250100)

花色是觀賞植物重要的園藝性狀，也是吸引傳粉者的主要因素[1-3]。花青素苷對植物呈色起重要作用[4]。在其生物合成途徑中，二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是下游階段的關(guān)鍵酶，可催化二氫黃酮醇還原為無色花青素苷元，進(jìn)而轉(zhuǎn)變成橙色到磚紅色的天竺葵素糖苷、紅色的矢車菊素糖苷和藍(lán)色到紫色的飛燕草素糖苷，與花色的產(chǎn)生直接相關(guān)[4]。目前，DFR基因的克隆及其功能分析已在亞洲百合（LiliumAsiatic hybrids）[5]、 玫 瑰 （Rosa rugosaThunb.）[6]、牽牛花（Ipomoea nil(L.) Roth.）[7]、一品紅（Euphorbia pulcherrimaWilld. ex Klotzsch）[8]、馬櫻杜鵑（Rhododendron delavayiFranch.）[9]和橙花龍膽（Gentiana luteaL. var.aurantiaca(M. Laínz) M. Laínz）[10]等多種觀賞植物中得到研究。

對不同植物的研究發(fā)現(xiàn)，DFR在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，受光照、溫度、激素等一系列外部環(huán)境和內(nèi)部因子的影響。孟祥春等[11]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過短暫光照處理的非洲菊（GerberahybridaHort.）花青素苷含量及DFR基因表達(dá)量均顯著增加，且基因表達(dá)水平與光照時間呈正相關(guān)。在蕪菁（Brassica rapaL.）中，與花青素苷積累相關(guān)的BrDFR對冷脅迫表現(xiàn)出明顯響應(yīng)[12]。紫花苜蓿（Medicago sativaL.）[13]、歐洲油菜（Brassica napusL.）[14]和金魚草（Antirrhinum majusL.）[15]中的DFR基因可分別響應(yīng)干旱、鹽和植物激素等非生物脅迫，轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯變化。

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）是我國的傳統(tǒng)名花，具有極高的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值。研究表明，PsDFR在牡丹花色形成中起重要作用[16-18]，不僅作為轉(zhuǎn)錄因子PsbHLH1 的靶基因參與調(diào)控花青素苷的生物合成，還可能與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PsGSTF3互作，與花青素苷的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累相關(guān)[19-20]。啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因上游的一段DNA 序列，包含控制基因表達(dá)的多種調(diào)控元件，能夠特異性結(jié)合RNA 聚合酶，在基因表達(dá)調(diào)控中起核心作用[21]。開展啟動子研究對于理解基因的時空表達(dá)模式[22]、環(huán)境響應(yīng)機(jī)制[23]等具有重要意義。

本研究利用染色體步移法從牡丹花瓣中克隆了PsDFR的啟動子序列，對其順式作用元件進(jìn)行了分析，探究了不同長度缺失啟動子的活性及其對ABA、MeJA、光照等不同脅迫處理的響應(yīng)，并初步確定了相關(guān)調(diào)控區(qū)域，為進(jìn)一步研究PsDFR啟動子的功能及其在牡丹花色形成中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以‘黑花魁’牡丹（P.Suffruticosa‘Hei Hua Kui’）盛花期花瓣為試材。于4 月中下旬，取自中國林業(yè)科學(xué)研究院玉泉山牡丹資源圃，用錫箔紙包好，經(jīng)液氮速凍后，保存于-80 ℃超低溫冰箱。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 購自北京天根生化科技有限公司。煙草（Nicotiana benthamiana）野生型為本實(shí)驗(yàn)室保存，在 23 ℃、16 h/8 h 光暗周期下生長。

1.2 PsDFR 啟動子的克隆和順式作用元件分析

參照北京天根生化科技有限公司Plant Genomic DNA Kit 說明書提取‘黑花魁’花瓣基因組DNA。根據(jù)課題組已克隆的PsDFR基因cDNA 序列（Accession No：HQ283448）及前期獲得的牡丹花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（ Accession No：PRJNA594258）， 利用生物學(xué)軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計特異引物PsDFR-F/PsDFRR（表1），用于PsDFR基因的gDNA 全長序列擴(kuò)增。根據(jù)測序得到的DNA 序列，在啟動子下游不同位置設(shè)計3 條特異性嵌套反向引物SP1、SP2、SP3（表1），以花瓣基因組DNA 為模板，按照TaKaRa 公司的Genome Walking Kit 說明書，連續(xù)開展3 輪PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收清晰條帶，連接到pMD-19T 載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化平板上的白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)，通過菌液PCR 和質(zhì)粒酶切鑒定陽性克隆后，委托生工生物公司（上海）測序。

表1 PsDFR 啟動子克隆和活性分析相關(guān)引物 Table 1 The primers used in cloning and functional analysis of PsDFR promoters

利用在線軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和PLACE（https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?acti on=newplace）分析啟動子序列所包含的調(diào)控元件，并用TBtools 軟件繪制各順式作用元件分布圖；通過TSSP 在線網(wǎng)站（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=programs&subgro up=promoter）預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

1.3 不同缺失表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)PsDFR啟動子的全長序列，設(shè)計了5′端分別含有相應(yīng)側(cè)翼序列和酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增引物1301-PsDFRp0-F 和1301-PsDFRp0-R（表1），以包含全長啟動子序列的質(zhì)粒為模板，通過同源重組方法將PsDFR啟動子構(gòu)建至pCAMBIA1301-GUS 表達(dá)載體上。根據(jù)PsDFR啟動子順式作用元件的分布情況，設(shè)計了4 條啟動子系列缺失引物，分別命名為PsDFR(1287)-F、PsDFR(980)-F、PsDFR(507)-F 和PsDFR(140)-F（表1）。以上述構(gòu)建好的PsDFR全長啟動子重組質(zhì)粒為模板，以1301-PsDFRp0-R 為共用反向引物，通過同源重組方法，構(gòu)建了不同長度啟動子片段的pCAMBIA1301-GUS 融合表達(dá)載體。最后，對含有 5 個不同長度啟動子片段，即1 687 bp （-1 623至 + 64）、1 287 bp （-1 223 至 + 64）、980 bp（-916 至 + 64）、507 bp（-443 至 + 64 ）和140 bp（-76 至 + 64）的重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR 和測序驗(yàn)證后，用于啟動子瞬時表達(dá)分析。

1.4 重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)化煙草的瞬時表達(dá)分析

將構(gòu)建好的5 個不同長度啟動子融合表達(dá)載體的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101 中。菌液PCR 驗(yàn)證后，取2 mL 接種于50 mL LB 液體培養(yǎng)基（含50 mg·L-1Rif 、50 mg·L-1Kan 和25 mg·L-1Gen）中過夜培養(yǎng)至OD600=1.0 左右。離心收集菌體，用懸浮液（含10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES 和100 μmol·L-1AS）重懸至OD600約等于0.6，室溫避光靜置3 h 以上后，取2 mL 分別注射到4～5 葉期的煙草葉片中。72 h后取侵染后的葉片放入GUS 染色液進(jìn)行組織化學(xué)染色。70% 乙醇浸泡脫色后拍照記錄。以注射pCAMBIA1301-35S-GUS 空載體的葉片為陽性對照，注射無菌水的葉片為陰性對照。

1.5 不同處理下PsDFR 啟動子的GUS 活性分析

為分析PsDFR啟動子對不同激素的響應(yīng)，取不同菌液注射2 d 后的煙草植株，對其葉片正反面分別噴灑外源茉莉酸甲酯（MeJA，100 μmol·L-1）和脫落酸（ABA，100 μmol·L-1）直到葉面呈滴水狀態(tài)，其中MeJA 噴灑后進(jìn)行套袋密閉處理。以噴灑清水的煙草葉片為對照，每組設(shè)置5 個重復(fù)，處理24 h 后取樣（每12 h 追加噴灑一次）。同時，為了解啟動子對光照誘導(dǎo)的響應(yīng)，對侵染2 d 后的煙草植株分別進(jìn)行暗培養(yǎng)24 h 后取樣，以及暗培養(yǎng)24 h 后恢復(fù)全光照培養(yǎng)12 h 后再取樣兩種處理。每組設(shè)置5 個重復(fù)。所有樣品經(jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱保存。參照陰霞等[24]的方法，利用熒光分光光度計檢測GUS 酶活。

運(yùn)用SPSS19.0 的Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PsDFR 啟動子克隆及順式作用元件分析

以牡丹基因組DNA 作為模板，利用染色體步移法進(jìn)行3 次巢式PCR 后，擴(kuò)增到1 條長為1 687 bp 的目的片段（圖1）。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，PsDFR啟動子含有多個CAAT-box，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始密碼子ATG 上游63 bp處。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游16 bp 處有一個TATAbox 結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖1 牡丹PsDFR 啟動子的 PCR 擴(kuò)增Fig. 1 PCR production of PsDFR promoter from tree peony

圖2 PsDFR 基因啟動子序列Fig. 2 The sequence of the PsDFR promoter

如表2、圖3 所示，PsDFR啟動子除含有核心啟動子元件TATA-box 和CAAT-box 外，還包含參與大多數(shù)植物啟動子轉(zhuǎn)錄起始過程的Inr 元件INRNTPSADB 和大量光調(diào)控元件，有G-Box、Box 4、GA-motif、GATA-motif、TCCC-motif 、TCT-motif、GT1-motif 、I-Box 、SORLIP1AT 和TBOXATGAPB 等，以及多個激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)元件。其中，激素響應(yīng)元件包括：ABA 響應(yīng)元件ABRE 和DPBFCOREDCDC3；細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)相關(guān)元件ARR1AT；乙烯誘導(dǎo)相關(guān)元件ERE；GA 響應(yīng)元件GARE-motif 和TATCCAOSAMY；茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG-motif 等。逆境脅迫響應(yīng)元件包括： 水分脅迫相關(guān)響應(yīng)元件ACGTATERD1 和CBFHV ； 低溫響應(yīng)元件CRTDREHVCBF2 以及受傷和病原體應(yīng)答相關(guān)元件W box 等。值得注意的是，其他作用元件中類黃酮生物合成相關(guān)的調(diào)控元件或轉(zhuǎn)錄因子識別位點(diǎn)MYBCORE 、MYBPLANT 和MYCCONSEN-SUSAT 多達(dá)17 個。 這些元件的存在表明PsDFR在牡丹花青素苷的生物合成中發(fā)揮重要作用，并可能在轉(zhuǎn)錄水平上受到光照、激素（如GA、ABA、乙烯）和非生物脅迫（如干旱、低溫）等多種因素的調(diào)節(jié)。此外，在PsDFR啟動子序列中還發(fā)現(xiàn)了葉肉細(xì)胞特異表達(dá)作用元件 CACTFTPPCA1 、 花粉特異激活元件POLLEN1LELAT52 和GTGANTG10 等控制基因器官特異表達(dá)的作用元件，說明PsDFR在植物體內(nèi)的表達(dá)可能具有一定的器官特異性。

圖3 PsDFR 啟動子順式作用元件分布圖Fig. 3 Distribution map of the cis-elements of PsDFR promoter

2.2 啟動子不同缺失片段的表達(dá)載體構(gòu)建

5 個不同長度的缺失片段（圖4）是根據(jù)PsDFR啟動子順式作用元件預(yù)測結(jié)果，從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 623 bp 的5′端對啟動子序列進(jìn)行逐步刪除，最終獲得：1 687 bp（P0，-1 623 至+ 64）、1 287 bp（P1，-1 223 至 + 64）、980 bp（P2，-916 至 + 64）、507 bp（P3，-443 至+ 64 ）和140 bp（P4；-76 至 + 64）。

圖4 PsDFR 啟動子缺失片段Fig. 4 Schematic diagram of the PsDFR promoter deletions

利用同源重組的方法將獲得的PsDFR啟動子全長序列P0構(gòu)建到pCAMBIA1301-GUS 表達(dá)載體上，菌液PCR 和測序結(jié)果證明該序列已經(jīng)替換了原有的35S 啟動子并與GUS 基因融合（圖5），重組質(zhì)粒被命名為pCAM-PsDFRp0。以該質(zhì)粒為模板，通過同樣的方法，經(jīng)菌液PCR 和測序驗(yàn)證，獲得了另外4 個不同缺失片段的pCAMBIA1301-GUS 融合表達(dá)載體pCAM-PsDFRp1、pCAMPsDFRp2、pCAM-PsDFRp3 和pCAM-PsDFRp4（圖5）。

圖5 PsDFR 啟動子及其缺失片段的融合表達(dá)載體驗(yàn)證Fig. 5 Verification of PsDFR promoter and deletion fragment fusion expression vector

2.3 啟動子缺失片段在煙草葉片中的瞬時表達(dá)及GUS 染色分析

為研究PsDFR啟動子各區(qū)域的表達(dá)活性，將含有不同缺失片段的融合表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，注射至煙草葉片中進(jìn)行GUS 組織化學(xué)染色分析。結(jié)果由圖6 所示，注射無菌水的陰性對照的葉片沒有染色，而由啟動子CaMV35S 驅(qū)動的陽性對照GUS 染色最明顯。在不同PsDFR啟動子缺失片段的瞬時表達(dá)中，隨著啟動子5′端序列的缺失，染色程度由深到淺變化，染色部位也越來越小。特別是全長啟動子P0在相繼缺失了-1 623 至-1 223（P1）以及-1 223 至-916（P2）之間的區(qū)域后，缺失材料的GUS 染色明顯變淺，最后僅在葉脈周圍觀察到稀疏分散的藍(lán)色斑點(diǎn)，表明5 個缺失片段均具有啟動子活性，但活性隨片段的縮短而減弱，-1 623 至-916 之間的區(qū)域?qū)τ谄浠钚跃哂兄匾饔谩?/p>

圖6 PsDFR 啟動子缺失片段瞬時轉(zhuǎn)化煙草染色結(jié)果Fig. 6 Detection of transient expression of different PsDFR promoter deletion regions in tobacco leaves

2.4 光照和激素對啟動子不同缺失片段活性的影響

對不同農(nóng)桿菌侵染48 h 后的煙草分別進(jìn)行ABA、MeJA、黑暗和光照處理后，檢測葉片GUS活性，結(jié)果如圖7 所示，對照中，GUS 活性隨啟動子缺失片段的縮短而不斷降低，這與染色結(jié)果（圖6）相一致。黑暗處理后，所有啟動子缺失片段誘導(dǎo)的GUS 酶活性均受到不同程度抑制，恢復(fù)光照后，除P4外其余啟動子活性均有顯著升高（p＜0.05）；ABA 處理明顯抑制了P0和P1下游GUS 的表達(dá)活性，與對照相比，分別下降了51.85%和56.12%，但隨著5′端序列的逐漸缺失，ABA 對啟動子P2的抑制作用明顯降低，并反而促進(jìn)了P3的啟動子活性，約達(dá)對照的1.28倍；MeJA 明顯抑制了不同啟動子片段誘導(dǎo)的GUS 活性，與對照相比，均下降了40%以上。

圖7 光照和激素誘導(dǎo)下PsDFR 啟動子缺失片段驅(qū)動的GUS 活性分析Fig. 7 Analysis of the GUS activity driven by PsDFR promoter deletion regions in response to light and hormone treatments

3 討論

本研究利用染色體步移法從牡丹花瓣中分離到PsDFR基因長1 687 bp 的啟動子序列。該序列位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的-1 623 bp 處，除了包含調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始精確度和效率的核心啟動子元件外，還具有光響應(yīng)元件、激素和逆境脅迫相關(guān)元件以及組織特異性表達(dá)相關(guān)元件等。

前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著花朵的著色，PsDFR基因的表達(dá)量與花青素苷的含量呈正相關(guān)，并且在花瓣中特異高表達(dá)，在葉片、萼片、雄蕊和心皮中的表達(dá)水平很低[16,25]。然而，除一些花粉特異激活元件外，在PsDFR啟動子中未發(fā)現(xiàn)其他花器官相關(guān)特異元件。Roh 等[26]通過啟動子缺失發(fā)現(xiàn)，花瓣特異性啟動子PISTILLATA（BnPI）中的光響應(yīng)元件G-box 可能與花瓣特異性表達(dá)有關(guān)。Imai 等[27]發(fā)現(xiàn)在菊花（Dendranthema morifolium(Ramat.)Tzvel.）CmCCD4a的ATG 上游存在一些與花瓣特異性表達(dá)相關(guān)的未知順式元件。在非洲菊中，不同花器官間的著色差異與DFR啟動子的結(jié)構(gòu)無關(guān)，而是由調(diào)控其表達(dá)的上游轉(zhuǎn)錄因子啟動子上的空間特異性順式作用元件調(diào)控的[28]。因此，為了明確哪些順式元件在PsDFR的花瓣特異性高表達(dá)中起重要作用，還需對其啟動子或與其互作的轉(zhuǎn)錄因子啟動子進(jìn)行更全面、細(xì)致的片段缺失分析。

在啟動子缺失片段的GUS 染色分析中，發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域的PsDFR啟動子表達(dá)活性具有明顯差異。全長啟動子片段（P0）活性最高，但隨著5′端序列的逐步缺失，活性不斷降低。特別是刪除-1 623 至-916 之間707 bp 的片段后，啟動子活性迅速下降，推測該片段中可能含有與啟動子活性相關(guān)的核心元件。根據(jù)順式元件分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該片段包含2 個Inr 元件（INRNTPSADB）。Nakamura等[29]證實(shí)該元件可在缺乏TATA-box 的情況下對轉(zhuǎn)錄激活起關(guān)鍵作用。在PsDFR啟動子中，Inr 元件是否在TATA-box 存在的情況下也具有激活轉(zhuǎn)錄起始的作用，還有待進(jìn)一步研究。

光照是影響植物合成花青素苷的重要環(huán)境因子之一，不同光質(zhì)、光照強(qiáng)度和光周期信號可通過促進(jìn)或抑制類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控花青素苷的合成和積累。Hartmann 等[30]在擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.）CHS啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個由G-Box 核心元件（ACGT）和MYB 識別元件（ACCWACCNN）組成的光響應(yīng)單元LRU。小麥（Triticum aestivumL.）TaDFRB在花青素苷積累的部位高表達(dá)，并受光誘導(dǎo)明顯上調(diào)，也與其啟動子中包含這兩個元件有關(guān)[31]。本研究中，PsDFR啟動子也含有該元件組合（GBox 和MYBPZM），并同時具有Box4、GAmotif、TCT-motif、GT1-motif、I-Box 等多個光響應(yīng)元件。光處理后，不同啟動子缺失片段對光照變化均有明顯響應(yīng)，即在黑暗條件下啟動子活性降低，恢復(fù)光照后啟動子活性升高，這與Gollop等[32]對葡萄（Vitis viniferaL.）DFR啟動子的研究結(jié)果一致，推測這些元件在牡丹花青素苷生物合成對光照的響應(yīng)中起重要作用。

除光照外，DFR在表達(dá)過程中還受ABA、MeJA 等多種激素影響。如ABA 可上調(diào)草莓（Fragaria ananassaDuch.）[33]和葡萄[34]果實(shí)中DFR的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)花青素苷的積累；紅肉蘋果（Malus sieversiif.niedzwetzkyana(Dieck) Langenf.）MdDFR的轉(zhuǎn)錄受MeJA 正調(diào)控，但受ABA 負(fù)調(diào)控[35]。目前，關(guān)于激素如何影響牡丹DFR的表達(dá)以及DFR的啟動子活性如何響應(yīng)激素處理的報道很少。在PsDFR啟動子中，發(fā)現(xiàn)了典型的ABA 響應(yīng)元件ABRE 和DPBFCOREDCDC3 以及MeJA 響應(yīng)元件TGACGmotif 和T/GBOXATPIN2 。ABA 處理抑制了P0和P1的啟動子活性，但對啟動子缺失片段P2的抑制作用明顯降低，而P3的啟動子活性顯著高于對照，推測這與啟動子-443 至-76 bp 序列區(qū)段存在ABA 應(yīng)答相關(guān)元件有關(guān)，且-1 623 至-916 bp 之間可能存在抑制ABA 響應(yīng)的未知元件。在MeJA 方面，盡管MeJA 處理通常被認(rèn)為可促進(jìn)花青素苷的積累[36]，但在擬南芥、甘薯（Ipomoea batatasLam.）等植物中發(fā)現(xiàn)，受糖信號、品種及組織特異性或處理濃度的影響，MeJA 處理也會對DFR基因的表達(dá)及花青素苷合成起抑制作用[37-38]。本研究中，MeJA 處理后各缺失片段的啟動子活性均有明顯下降，推測100 μmol·L-1MeJA 在‘黑花魁’牡丹花青素苷的合成中可能起負(fù)調(diào)控作用。

4 結(jié)論

DFR 是植物花青素苷生物合成下游階段的關(guān)鍵酶。本研究通過染色體步移法分離了牡丹PsDFR基因長1 687 bp 的啟動子序列。順式作用元件分析結(jié)果表明PsDFR的表達(dá)可能受光信號、激素和脅迫等多種信號的共同調(diào)節(jié)。通過對瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片的GUS 組織化學(xué)染色和酶活性進(jìn)行分析，明確了PsDFR啟動子活性受光的正調(diào)控以及MeJA 的負(fù)調(diào)控；-1 623 至-916 bp 間的區(qū)域?qū)τ趩幼踊钚跃哂兄匾饔茫?443 至-76 bp 是響應(yīng)ABA 處理的核心區(qū)域。上述結(jié)果為進(jìn)一步揭示PsDFR響應(yīng)不同環(huán)境信號參與牡丹花色形成的調(diào)控機(jī)制提供參考。