枇杷葉三萜酸聯(lián)合重組人表皮生長因子對激素依賴性皮炎豚鼠皮膚屏障功能的修復(fù)及免疫失衡的影響

姚瑩，張杰

（河南科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 洛陽 471000）

激素依賴性皮炎（Hormonedependencedermatitis，HDD）指長期使用含有糖皮質(zhì)激素的藥物后，一旦停用病情會復(fù)發(fā)或加重的皮膚炎性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為毛細血管擴張、紅斑、痤瘡、脫屑和燒灼感等，使患者的身體和心理受到雙重損害[1]。我國化妝品皮膚病中青年女性約占95%，其中21～40 歲為高發(fā)年齡，面部HDD 約占整個化妝品皮膚病患者的20%[2]。HDD 具體發(fā)病機制尚不清楚，可能與炎性細胞因子活化、機體免疫功能失衡、皮膚屏障受損、微生物感染、代謝物堆積和軸突反射有關(guān)。臨床上多以抗炎、修復(fù)皮膚屏障、抗微生物及心理干預(yù)等治療為主，但治療周期相對較長，容易產(chǎn)生藥物依賴性，且治療后容易復(fù)發(fā)，徹底治愈比較困難[3]。因此，探討周期短、不良反應(yīng)小、安全性高的聯(lián)合治療方法是臨床關(guān)注的重要話題。重組人表皮生長因子（Recombinant human-epidermal growth factor，rh-EGF）有促進外胚層和內(nèi)胚層各種細胞增殖遷移的作用，臨床常用于修復(fù)創(chuàng)傷及各類皮膚炎性反應(yīng)[4]。枇杷葉三萜酸（TAL）類化合物是枇杷葉的主要活性成分之一，有明顯的抗菌消炎和免疫調(diào)節(jié)藥理功能[5]。本實驗通過建立豚鼠HDD 模型，探討TAL 和rh-EGF聯(lián)合用藥對皮膚屏障功能及免疫功能的改善效果，旨在為臨床治療提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 40 只無特定病原（SPF）級豚鼠，雌雄各半，2～3 個月齡，體質(zhì)量270～350 g，購自吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（吉）2019-0010。環(huán)境溫度：20～24 ℃，濕度40%～60%。分籠飼養(yǎng)，定期清潔鼠籠，每日1 次，定期補充維生素C 預(yù)防足部潰瘍。

1.1.2 試劑與儀器 TAL 粉末（純度≥98%，安徽省安泰醫(yī)藥生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、rh-EGF 凝膠（杭州紐龍生物科技有限公司）、鹵米松乳膏（重慶華邦制藥股份有限公司）、豚鼠免疫球蛋白E（IgE）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測試劑盒（北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司，貨號：15596018）、SOFT1160 型多功能皮膚生理參數(shù)檢測儀（美國安捷倫科技有限公司）、石蠟包埋機（德國萊卡公司）、USorvall ST40R 臺式高速離心機（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 HDD 豚鼠模型建立 所有豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按體質(zhì)量排序編號，利用計算機生成隨機數(shù)分為：對照組、模型組、rh-EGF 組、TAL 組和聯(lián)合組，每組8 只。除對照組外，其余各組參與HDD 模型建立：每只豚鼠背部左右兩側(cè)選取3 cm×3 cm 大小的區(qū)域，剔除毛發(fā)，用0.05%鹵米松乳膏外用涂抹，按摩1～2 min，各組給藥每日2 次，連續(xù)45 d[6]。制模過程中每日觀察豚鼠皮膚組織變化，藥物停用3 d 后，制模區(qū)皮膚出現(xiàn)紅斑、腫脹、結(jié)痂等炎性反應(yīng)，表明制模成功[7]。對照組常規(guī)飼養(yǎng)，剔除3 cm×3 cm 毛發(fā)，不做其他處理。

1.2.2 分組及給藥 制模成功后7 d，對照組和模型組用0.9%氯化鈉溶液涂抹處理，rh-EGF 組在皮損處均勻涂抹薄層rh-EGF 凝膠；TAL 組涂抹TAL溶液，參照文獻[8]用量，按450 mg/kg 體質(zhì)量，將TAL 用2 mL 0.9%氯化鈉溶液稀釋后均勻涂抹于皮損處；聯(lián)合組涂抹rh-EGF 凝膠，晾干后，再涂抹TAL 溶液。每日涂抹2 次，連續(xù)15 d[9]。自給藥開始，每天觀察并記錄實驗豚鼠背部激發(fā)部位皮膚變化情況。

1.2.3 皮膚炎性程度評分 每日觀察并記錄豚鼠背部皮膚變化，參照文獻[10]方法對各組豚鼠皮膚組織進行評分。根據(jù)皮損處水腫、紅斑和毛細血管擴張的嚴(yán)重程度評分：0 分為無癥狀；1 分為輕微；2分為中度；3 分為嚴(yán)重。評分越高表明皮膚組織病變程度越嚴(yán)重，詳細評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 評分指標(biāo)與評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 皮膚屏障功能測定 使用SOFT1160 型多功能皮膚生理參數(shù)檢測儀檢測皮膚屏障功能指標(biāo)：包括經(jīng)皮水分丟失（Transepidermal waterloss，TEWL）、角質(zhì)層含水量（Water content of the stratum corneum，WCSC）和皮脂量（Sebum content，SC）。室溫24 ℃、濕度60%，對豚鼠背部用藥處皮膚進行測量，測試過程中盡量保持測試探頭的垂直穩(wěn)定。

1.2.5 皮膚組織病理學(xué)觀察 麻醉豚鼠，分別取背部用藥區(qū)左側(cè)1 cm×1 cm 皮膚，置于4%多聚甲醛固定液中，經(jīng)脫水、石蠟包埋，切片約4 μm 厚度，脫蠟、水化后，HE 染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚各層細胞及附件的變化情況。

1.2.6 血清IgE、IL-4 及IFN-γ 含量檢測 末次涂藥結(jié)束24 h 后，選取豚鼠尾部采血3 mL，離心半徑為12 cm，4 500 r/min 離心20 min，取上清液體，保存于-80 ℃冰箱，用ELISA 法檢測總IgE、白細胞介素-4（IL-4）及干擾素-γ（IFN-γ）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚炎性損傷程度比較 對照組豚鼠皮膚狀態(tài)良好，未出現(xiàn)水腫、紅斑及結(jié)痂等癥狀；模型組背部皮膚可見明顯紅斑、水腫及脫屑等，實驗結(jié)束后癥狀未見消退。rh-EGF 組和TAL 組從涂藥第9 天開始，紅斑、水腫逐漸消退明顯，實驗結(jié)束后癥狀輕微。聯(lián)合組從第6 天開始皮損癥狀逐漸明顯減輕，至實驗結(jié)束時發(fā)炎處已基本痊愈。

與模型組比較，rh-EGF 組、TAL 組和聯(lián)合組第6、9、12、15 天皮膚組織炎性損傷程度評分降低（P＜0.05）。與rh-EGF 組和TAL 組比較，聯(lián)合組第9、12、15 天皮膚組織炎性損傷程度評分均降低（P＜0.05）。rh-EGF 組與TAL 組各時間皮膚組織炎性損傷程度評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組皮膚組織炎性損傷程度評分比較 （分，±s）

表2 各組皮膚組織炎性損傷程度評分比較 （分，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05；與rh-EGF 組比較，#P＜0.05；與TAL組比較，▽P＜0.05。

組別模型組rh-EGF 組TAL 組聯(lián)合組n 8 8 8 8 F P第3 天第6 天第9 天第12 天第15 天3.00±0.00 2.77±0.15 2.75±0.162.76±0.142.73±0.11 3.00±0.00 2.64±0.12△2.30±0.10△ 1.57±0.10△ 1.04±0.16△3.00±0.00 2.65±0.13△2.31±0.13△ 1.54±0.12△ 1.06±0.14△3.00±0.00 2.60±0.16△1.98±0.16△#▽0.95±0.18△#▽0.16±0.07△#▽2.16340.987241.326593.128 0.115＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 皮膚屏障功能比較 與對照組比較，模型組TEWL 增加，WCSC 和SC 減少（P＜0.05）。與模型組比較，rh-EGF 組、TAL 組和聯(lián)合組TEWL 減少，WCSC 和SC 增加（P＜0.05）。與rh-EGF 組和TAL 組比較，聯(lián)合組TEWL 減少、WCSC 和SC 增加（P＜0.05）。rh-EGF 組與TAL 組TEWL、WCSC 和SC 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組皮膚屏障功能指標(biāo)比較（±s）

表3 各組皮膚屏障功能指標(biāo)比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與rh-EGF組比較，#P＜0.05；與TAL 組比較，▽P＜0.05。

組別對照組模型組rh-EGF 組TAL 組聯(lián)合組n 8 8 8 8 8 F P TWEL[g/（h·m2）]WCSC（U）SC（U）15.24±2.0450.59±3.1038.81±1.98 32.83±3.65*22.19±1.79*16.40±1.55*25.52±1.66*△32.34±2.73*△28.28±1.77*△26.35±2.13*△31.27±2.84*△30.03±1.86*△17.31±1.61*△#▽ 45.10±2.51*△#▽ 36.54±1.49*△#▽75.189150.643203.697＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 皮膚組織病理學(xué)觀察 對照組皮膚組織結(jié)構(gòu)完整清晰，真皮層膠原纖維排列致密，復(fù)層扁平上皮層較薄，角化層明顯，染色均一。模型組皮膚組織病變明顯，表皮明顯增厚，細胞層數(shù)減少，排列紊亂，角質(zhì)層上皮細胞角化不全或角化過度，真皮層膠原纖維數(shù)量減少，排列紊亂。rh-EGF 組、TAL 組和聯(lián)合組表皮結(jié)構(gòu)較紊亂，表皮角質(zhì)層改善，棘層增生情況好轉(zhuǎn)，真皮層成纖維細胞增多，真皮網(wǎng)狀層膠原纖維數(shù)量恢復(fù)，細胞排列整齊致密，基本恢復(fù)正常。其中聯(lián)合組較rh-EGF 組、TAL 組改善更明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠皮膚組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE 染色×100）

2.4 免疫因子水平比較 與對照組比較，模型組豚鼠IgE 和IL-4 水平升高，IFN-γ 水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，rh-EGF 組、TAL 組和聯(lián)合組豚鼠IgE 和IL-4 水平降低、IFN-γ 水平升高（P＜0.05）。與rh-EGF 組和TAL 組比較，聯(lián)合組豚鼠IgE 和IL-4水平降低、IFN-γ 水平升高（P＜0.05）。rh-EGF 組與TAL 組IgE、IL-4 和IFN-γ 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組免疫因子IgE、IL-4 和IFN-γ（±s）

表4 各組免疫因子IgE、IL-4 和IFN-γ（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與rh-EGF組比較，#P＜0.05；與TAL 組比較，▽P＜0.05。

組別對照組模型組rh-EGF 組TAL 組聯(lián)合組n 8 8 8 8 8 F P IgE（ng/mL）IL-4（ng/L）IFN-γ（pg/mL）96.65±2.8740.65±2.1432.55±2.01 145.35±2.89*70.68±2.94*18.82±1.59*110.04±3.21*△55.34±2.50*△26.36±2.49*△111.72±3.09*△56.49±2.72*△27.01±2.24*△98.98±2.92*△#▽ 43.69±2.89*△#▽ 30.16±1.68*△#▽337.973161.46952.459＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

本實驗豚鼠皮膚炎性觀察可以看出，模型構(gòu)建成功后，豚鼠皮膚出現(xiàn)水腫、紅斑、毛細血管擴張，結(jié)痂和脫屑等癥狀，各治療組用藥后癥狀逐漸恢復(fù)。豚鼠皮膚病理學(xué)觀察也可以看出，構(gòu)建的豚鼠模型，皮膚表皮受損嚴(yán)重，出現(xiàn)細胞排列紊亂、壞死等癥狀，各治療組用藥后細胞狀態(tài)逐漸恢復(fù)，且聯(lián)合組與單用rh-EGF 和TAL 比較，見效早、恢復(fù)更好，表明TAL 聯(lián)合rh-EGF 可減輕HDD 臨床癥狀，且比單獨使用rh-EGF 和TAL 效果更好。

皮膚屏障的檢測中，TEWL 是指水從真皮和表皮通過角質(zhì)層擴散到皮膚表面的通量密度，即皮膚表面的水蒸氣壓梯度來表明水分散失情況。皮膚屏障功能的優(yōu)劣與代表角質(zhì)層水分流失量的TEWL呈負相關(guān)關(guān)系，當(dāng)屏障受損時，TEWL 值增高[11]。皮膚屏障功能與WCSC 和SC 成正比，WCSC 和SC 越多說明皮膚屏障功能越好。與對照組比較，模型組TEWL 增加，WCSC 與SC 減少，說明皮膚屏障功能受損；與模型組比較，rh-EGF、TAL 單獨及聯(lián)合用藥治療后，TEWL 減少，WCSC 與SC 增加，說明rh-EGF 和TAL 均對皮膚屏障功能有修復(fù)作用，且二者聯(lián)合用藥后對皮損的改善更顯著，說明TAL 聯(lián)合rh-EGF 能夠起到皮膚屏障修復(fù)作用，且比rh-EGF、TAL 單獨使用效果更好。

當(dāng)免疫因子失衡時，就會導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)紊亂，引起自身免疫性疾病的發(fā)生。IgE 是一類免疫球蛋白，可通過結(jié)合肥大細胞和嗜堿粒細胞，進而共同誘發(fā)Ⅰ型超敏反應(yīng)，其含量高低與過敏性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。IL-4 是一種經(jīng)典的Th2 型細胞因子，可刺激活化B 細胞和T 細胞增殖、誘導(dǎo)B 細胞產(chǎn)生IgE，引起過敏反應(yīng)，在人體免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[13]。IFN-γ 由Th1 細胞分泌，能明顯減少IgE 的合成和發(fā)展，從而抑制超敏反應(yīng)，IFN-γ 水平與病情嚴(yán)重程度呈負相關(guān)[14]。臨床研究表明，在激素依賴性皮炎中存在免疫失衡現(xiàn)象，患者IgE、IL-4水平較高，IFN-γ 水平較低，經(jīng)治療后，IgE、IL-4 水平逐漸降低，而IFN-γ 水平逐漸升高[15]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組IgE 和IL-4 水平顯著升高，IFN-γ 水平顯著降低，提示模型豚鼠發(fā)生免疫失衡；與模型組比較，rh-EGF 組、TAL 組和聯(lián)合組IgE 和IL-4 水平顯著降低，IFN-γ 水平升高，且聯(lián)合組效果更加顯著，說明TAL 聯(lián)合rh-EGF 治療能夠調(diào)節(jié)皮膚免疫因子，抑制豚鼠皮膚炎性反應(yīng)，較rh-EGF、TAL 單獨使用效果更佳。

本次實驗驗證TAL 聯(lián)合rh-EGF 對于治療HDD 有顯著的改善作用，可能與TAL 的抗炎、抑菌、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)[16-17]。郭磊等[8]研究枇杷葉三萜酸對慢性支氣管炎大鼠的作用效果，猜測其作用機制可能與降低炎性細胞因子表達、減輕機體氧化損傷有關(guān)。Jian 等[5]報告，TAL 可通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，抑制炎性反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激，改善慢性阻塞性肺病小鼠肺組織損傷。本研究結(jié)果顯示，TAL 聯(lián)合rh-EGF 可以改善HDD 豚鼠的臨床癥狀及體征，還能夠改善豚鼠皮膚屏障功能及免疫功能，且改善效果較單獨使用rh-EGF 的效果好，可為臨床HDD 的治療提供新的思路和理論依據(jù)。