青蒿油對(duì)銀屑病小鼠模型的干預(yù)作用

黃虎，楊志波，萬江波，陶侃，郭莉莉，秦紫嫣，何彰華，劉興

（1.上海上美化妝品股份有限公司，上海 200065；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；3.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650106；4.湖南謳睿生物科技有限公司，湖南 長沙 410205）

銀屑病是皮膚科常見的慢性、炎癥性皮膚病[1-2]，其特征為皮損部位形成鱗屑、丘疹、紅斑斑塊，并伴有劇烈的瘙癢，加之遷延不愈、易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響了患者的日常生活和工作[3-4]。目前，臨床上尚未有完全治愈銀屑病的方法，因此，如何有效治療銀屑病，緩解銀屑病嚴(yán)重程度已成為研究皮膚疾病的重中之重。

青蒿是中醫(yī)治療中常用的中草藥[5]，蔣嵐等[6]研究表明，青蒿及其有效成分可通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及表皮角化過程而治療銀屑病。青蒿油（Artemisia Naphta oil，AN）是青蒿素提取過程中的殘余物質(zhì)進(jìn)一步提純獲得的活性成分。近年來，對(duì)于青蒿的研究重點(diǎn)主要集中于青蒿素及其衍生物，而針對(duì)AN 的研究鮮有報(bào)告，增加了青蒿的應(yīng)用成本，影響了青蒿相關(guān)藥物的廣泛應(yīng)用。因此，本研究擬通過使用不同濃度的AN 干預(yù)銀屑病小鼠模型，以探討AN 對(duì)銀屑病小鼠模型的干預(yù)作用及對(duì)血清炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 32 只6 周齡無特定病原體（SPF）級(jí)BALB/c 雌性小鼠購自湖南斯萊克景達(dá)公司。嚴(yán)格遵循國家動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物 咪喹莫特乳膏購自四川明欣藥業(yè)有限公司，吐溫購自國藥集團(tuán)，無菌無酶水購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 HE 染色試劑盒、多聚甲醛購于北京索萊寶科技有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)試劑盒購于上海鑫樂生物科技有限公司；石蠟切片機(jī)購自德國萊卡公司；光學(xué)顯微鏡購于日本Olympus 公司；多功能酶標(biāo)儀購自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 AN 的提取 將青蒿葉與石油醚共同加熱，過濾獲得含有AN 的溶液，將溶液加熱，蒸發(fā)去除溶液內(nèi)的石油醚，進(jìn)一步在100～110 ℃下蒸餾，獲得AN 的粗產(chǎn)物。將AN 的粗產(chǎn)物放入精煉罐中110 ℃加熱30 min 后冷卻。在AN 中加入硅膠，攪拌30 min后過濾以使AN 提取物脫色。分別配制0.5%、1.0%、1.5%、3.0%、5.0%AN（換算成人體使用濃度分別為0.06%、0.11%、0.16%、0.30%和0.55%）：在400 μL吐溫中分別加入50、100、150、300、500 μL AN，再加入無菌無酶水配置成10 mL 溶液。

1.2.2 構(gòu)建動(dòng)物模型 小鼠背部脫毛處理，面積約為2 cm×3 cm。涂抹5%咪喹莫特乳膏42 mg/次，1 次/d，連續(xù)7 d，構(gòu)建銀屑病小鼠模型。

1.2.3 藥物干預(yù)方法 將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、陰性對(duì)照（NC）組、0.5%AN 組、1.0% AN 組、1.5% AN 組、3.0% AN 組和5.0% AN組，每組4 只。對(duì)照組和模型組不進(jìn)行任何干預(yù)措施；將配制成不同濃度的AN 放入18 mL 小噴壺中，其余各組按照相應(yīng)濃度進(jìn)行噴霧方式噴涂給藥干預(yù)。連續(xù)干預(yù)2 周。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 小鼠皮損狀況 參照銀屑病計(jì)分評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（Psoriasis area and severity index，PASI）進(jìn)行評(píng)分：將小鼠皮損部位出現(xiàn)的紅斑、浸潤、脫屑情況分為無、輕、中、重、極重5 個(gè)程度（按照小鼠背部皮損最嚴(yán)重的程度計(jì)分），0～4 分，4 項(xiàng)指標(biāo)的分?jǐn)?shù)即該小鼠PASI 評(píng)分。評(píng)分越高，銀屑病皮損程度越嚴(yán)重。

1.3.2 HE 染色觀察小鼠病理情況 實(shí)驗(yàn)完成后將小鼠處死，取背部皮損程度最嚴(yán)重部位的組織，在多聚甲醛溶液中固定、脫水、石蠟包埋、制作切片、HE 染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察皮損組織病理改變并拍照。

1.3.3 ELISA 檢測(cè) 采用ELISA 檢測(cè)血清IL-1β、TNF-α 和IL-6 表達(dá)水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。加入檢測(cè)抗體并在室溫孵育，加入親和素過氧化物酶復(fù)合物溫室孵育1 h，加入顯色劑顯色反應(yīng)5～30 min，加入中止液。測(cè)定波長450 nm 處吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算炎性因子的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由GraphPad 處理，最終數(shù)據(jù)由3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的皮損情況及PASI 評(píng)分 本研究通過背部涂抹咪喹莫特乳膏構(gòu)建銀屑病小鼠模型，分別使用0.5%、1.0%、1.5%、3.0%、5.0%等不同濃度的AN 干預(yù)，觀察各組小鼠的皮損狀況并進(jìn)行評(píng)分，見圖1～2，以探討不同濃度AN 緩解銀屑病嚴(yán)重程度的效果。與模型組比較，使用AN 干預(yù)的小鼠PASI評(píng)分均降低，其中5.0%AN 組小鼠PASI 評(píng)分降低最顯著。與NC 組比較，使用3.0%、5.0%AN 干預(yù)的小鼠PASI 評(píng)分均降低。

圖1 各組小鼠的皮損情況

圖2 各組小鼠PASI 評(píng)分比較

2.2 各組小鼠皮膚組織HE 染色結(jié)果 將各組小鼠皮損部位進(jìn)行HE 染色，見圖3。對(duì)照組小鼠組織無異常病理變化，其余各組小鼠病理可見表皮組織增厚，棘突增長并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤。使用不同濃度AN 干預(yù)后，與模型組和NC 組比較，上述病理損傷均有不同程度好轉(zhuǎn)，其中5.0%AN 組小鼠病理損傷最輕微。

圖3 各組小鼠皮膚組織病理情況（HE 染色×50）

2.3 ELISA 檢測(cè)血清相關(guān)炎性因子的表達(dá)情況 銀屑病是一種慢性、免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚疾病。本研究通過ELISA 檢測(cè)AN 干預(yù)后各組小鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達(dá)水平，見圖4。與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 表達(dá)水平均顯著上調(diào)。使用不同濃度AN 干預(yù)后，與模型組或NC 組比較，IL-1β、TNF-α、IL-6 表達(dá)水平均有不同程度的下降，其中1.0%、5.0%AN 干預(yù)的小鼠，上述炎性因子均顯著下降。

圖4 ELISA 檢測(cè)血清相關(guān)炎性因子的表達(dá)情況

3 討論

青蒿是我國傳統(tǒng)的中草藥，有良好的藥用價(jià)值[7]。青蒿及其有效成分在治療銀屑病中的作用也已被驗(yàn)證[8-9]。AN 是青蒿中重要的活性成分之一，由青蒿素產(chǎn)生過程中的殘?jiān)腿√峒儷@得，是一種有止咳平喘、抗菌消炎、抗真菌、抗腫瘤的油性混合物[10-14]。目前，針對(duì)AN 干預(yù)銀屑病及其作用的報(bào)告較少，為增加青蒿的應(yīng)用效率，本研究進(jìn)一步探索青蒿中的AN 是否在緩解銀屑病中發(fā)揮作用。首先構(gòu)建銀屑病小鼠模型，分別使用0.5%、1.0%、1.5%、3.0%、5.0%的AN 進(jìn)行干預(yù)，觀察小鼠皮損情況、PASI 評(píng)分、病理情況，以探討AN 干預(yù)銀屑病小鼠模型的作用。結(jié)果顯示，與模型組比較，使用AN 干預(yù)的小鼠PASI評(píng)分均降低，其中5.0%AN 組小鼠PASI 評(píng)分降低最顯著。與NC 組比較，使用3.0%、5.0%AN 干預(yù)的小鼠PASI 評(píng)分均降低。結(jié)果表明，3.0%AN 即可有效緩解銀屑病的皮損狀況。對(duì)照組小鼠組織無異常病理變化，其余各組小鼠病理可見表皮組織增厚，棘突增長并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤。使用不同濃度AN 干預(yù)后，與模型組和NC 組比較，上述病理損傷均有好轉(zhuǎn)，其中5.0%AN 組小鼠病理損傷最輕微。即AN 可有效緩解銀屑病的皮損狀況，5.0%AN 效果最為顯著。

銀屑病是由于角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖的皮膚疾病，這一過程由一系列復(fù)雜的炎性反應(yīng)介質(zhì)驅(qū)動(dòng)的，因此，銀屑病的發(fā)生發(fā)展與炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平密切相關(guān)[15-16]。IL-1β、TNF-α、IL-6 等炎性因子已被廣泛證實(shí)在皮膚炎性反應(yīng)和銀屑病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用[17-19]。Chen 等[20]研究表明，AN 可通過抑制胱天蛋白酶-1（Caspase-1）和IL-1β 加工和細(xì)胞焦亡，抑制NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）炎性體活化，進(jìn)而起到抗炎的作用。AN 還可通過抑制JAK/STATs 激活來抑制炎性反應(yīng)[21]。因此，本研究進(jìn)一步探討AN 在干預(yù)銀屑病的過程中對(duì)血清炎性因子的影響，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6 表達(dá)水平均顯著上調(diào)，使用不同濃度AN 干預(yù)后，與模型組或NC 組比較，IL-1β、TNF-α、IL-6 表達(dá)水平均有不同程度的下降，1.0%、5.0%AN 干預(yù)的小鼠，上述炎性因子下降最顯著。即0.5%AN 即可有效緩解銀屑病的炎性反應(yīng)，1%、5.0%AN 緩解效果顯著。

綜上所述，3.0%（成人體使用濃度約0.30%）及以上的AN 可有效緩解銀屑病的皮損狀況；0.5%（成人體使用濃度約0.06%）AN 即可有效緩解銀屑病的炎性反應(yīng)，1.0%、5.0%（成人體使用濃度約0.16%和0.55%）AN 緩解效果顯著。