基于JAK2/STAT3通路研究周氏固金消瘤湯含藥血清對人肺腺癌A549細(xì)胞侵襲遷移能力的影響

文 靜,王理槐,侯 超

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007;2.深圳市中醫(yī)院,廣東 深圳 518033)

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,肺癌占2020年全球新發(fā)癌癥病例的11.4%,位居第二,但其病死率位居首位[1-2]。非小細(xì)胞肺癌是肺癌最常見的組織學(xué)類型[3-4]。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)展過程中最具危險(xiǎn)性的階段,是造成患者死亡的主因,因而抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移一直是治療研究的重點(diǎn)。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移級聯(lián)過程涉及克隆形成、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)缺失、細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞運(yùn)動、血管生成等多個(gè)步驟,大量信號通路參與調(diào)節(jié)腫瘤侵襲過程,如JAK/STAT3通路的激活能通過促進(jìn)EMT,進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力[5-6]。張雅麗等[7]研究通過抑制JAK3/STAT6信號通路,從而抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成。有研究證實(shí)中藥能夠抑制肺癌大鼠腫瘤進(jìn)展,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)JAK/STAT通路有關(guān)[8-9]。中醫(yī)認(rèn)為腫瘤病機(jī)以虛為本,邪實(shí)為標(biāo),痰瘀互結(jié),邪毒內(nèi)阻,發(fā)為本病,其中氣虛痰阻證多見,治宜益氣化痰[10],治療時(shí)權(quán)衡標(biāo)本虛實(shí)之輕重,施以化痰、清熱、補(bǔ)虛之法[11]。陳虹宇等[12]探討益氣除痰法治療非小細(xì)胞肺癌的療效,發(fā)現(xiàn)益氣除痰方能通過多靶點(diǎn)、多途徑逆轉(zhuǎn)EMT、血管生成等,進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。周氏固金消瘤湯(ZSGJXLT)作為國醫(yī)大師周岱翰教授治療肺癌的經(jīng)驗(yàn)方,有益氣除痰、化瘀解毒、軟堅(jiān)散結(jié)的功效。前期研究發(fā)現(xiàn)ZSGJXLT對人肺腺癌荷瘤裸鼠有顯著抑瘤作用[13]。為證實(shí)ZSGJXLT的抗肺癌侵襲轉(zhuǎn)移活性,本研究擬采用血清藥理學(xué)方法,基于JAK2/STAT3信號通路對ZSGJXLT抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥效機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:40只SD大鼠,SPF級,雄性,6～8周齡,體重(225±25)g,揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供,許可證號:SCXK(蘇)2017-0007。本研究經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)動物倫理審查委員會批準(zhǔn)(YXYLL-2020-110)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:CCK-8試劑盒(批號NM598,同仁化學(xué)研究所);超敏ECL化學(xué)反應(yīng)發(fā)光試劑盒(批號19091716,新賽美生物科技有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號23225,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);p-STAT3(批號9145,美國CST公司);STAT3(批號12640,美國CST公司);p-JAK2(批號4406,美國CST公司);JAK2(批號3230,美國CST公司);β-actin抗體(批號4970,美國CST公司);N-cadherin(4)、E-cadherin(6)及HRP標(biāo)記二抗(批號7074,美國CST公司);MMP-2(批號M01263224,萬類生物科技有限公司);MMP-9(批號M01193096,萬類生物科技有限公司);VEGFA抗體(批號AF5131,美國Affinity Biosciences公司);基質(zhì)膠(批號356234,美國康寧公司);Transwell小室(批號3413,美國康寧公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號3107,美國Forma scientific公司);高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(型號Operetta CLS,美國Perkin Elmer公司);多功能酶標(biāo)儀(型號Synergy HTX,美國伯騰儀器有限公司);倒置熒光顯微鏡(型號Ti-U,日本尼康公司);凝膠成像系統(tǒng)(型號ChemiDoc XRS+,美國Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 周氏固金消瘤湯含藥血清制備:周氏固金消瘤湯由守宮6 g,薏苡仁30 g,人參、生南星各15 g,百部、浙貝母、龍葵各20 g,干蟾皮10 g組成,由揚(yáng)州市中醫(yī)院中藥房提供,按煎藥機(jī)規(guī)程操作煎煮成湯劑,60 ℃濃縮生藥濃度為3 g/ml,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)均分為周氏固金消瘤湯(ZSGJXLT)組和空白血清組,每組20只,ZSGJXLT組每日予ZSGJXLT 52 g/kg灌胃,空白血清組每日予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃,2 ml/次,2次/d,連續(xù)2周,末次給藥1 h后麻醉,取血,靜置30 min后3000 r/min常溫離心15 min,取上清,56 ℃滅活30 min,無菌微孔濾膜過濾除菌,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):人肺腺癌A549細(xì)胞株,購于上海中科院細(xì)胞庫,培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)基中,置于5%CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),傳代至第3代備用。

1.2.3 CCK-8檢測A549細(xì)胞活力:將對數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板(5×103個(gè)/孔),分為5%、10%、20%、30%及40% ZSGJXLT含藥血清組,同時(shí)設(shè)立空白血清組和空白對照組,每組5個(gè)復(fù)孔,含藥血清及空白血清的總體積分?jǐn)?shù)均為20%,藥物作用12、24、36 h后,加入CCK-8試劑10 μl,孵育1 h后用酶標(biāo)儀(450 nm波長)測吸光度值(OD)。細(xì)胞活性抑制率=(空白血清孔OD-含藥血清孔OD)/(空白血清孔OD-空白孔OD)×100%。

1.2.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的二維運(yùn)動能力:將對數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板(1×106個(gè)/ml),細(xì)胞過夜貼壁,培養(yǎng)到匯合度約80%,用20 μl槍頭垂直于孔板表面劃痕,PBS洗3次,分別用5%、10%、20% ZSGJXLT含藥血清及空白血清處理細(xì)胞24 h,顯微鏡下觀察痕道寬度并拍照,導(dǎo)入Image J軟件中評估細(xì)胞劃痕愈合率。

1.2.5 高內(nèi)涵細(xì)胞成像技術(shù)觀察細(xì)胞的三維運(yùn)動能力:將對數(shù)期細(xì)胞接種到96 孔板(2×103個(gè)/孔),加入5%、10%、20% ZSGJXLT含藥血清及空白血清,貼壁過夜,將平板放入Operetta CLS高內(nèi)涵成像系統(tǒng)動態(tài)觀察12 h。然后使用Harmony 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

1.2.6 Transwell小室法檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力:在進(jìn)行侵襲/遷移實(shí)驗(yàn)時(shí),Transwell上室分別加入/不加入稀釋基質(zhì)膠,將對數(shù)期細(xì)胞接種到Transwell上室(4×104個(gè)/孔),培養(yǎng)于100 μl無血清培養(yǎng)基中,下室分別加入5%、10%、20% ZSGJXLT含藥血清及空白血清液0.5 ml,培養(yǎng)箱孵育24 h,取出Transwell小室,棄去培養(yǎng)基,無菌棉簽輕拭去上室殘留細(xì)胞,4%多聚甲醛固定上室底面細(xì)胞,室溫放置15 min,PBS洗去固定液,結(jié)晶紫染色30 min,顯微鏡下觀察并拍照,Image J軟件分析圖像,計(jì)算細(xì)胞相對侵襲與遷移百分比。

1.2.7 Western blot檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白:取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,不同濃度的ZSGJXLT含藥血清及空白血清處理24 h后提取蛋白,取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,冰浴中電壓100 V轉(zhuǎn)膜2 h,取出PVDF膜,7%脫脂奶粉封閉液封閉1 h,置于一抗稀釋液中,4 ℃脫色搖床上孵育過夜,回收一抗,TBST洗膜3次×15 min,二抗37 ℃孵育2 h后,回收二抗,TBST洗膜3次×15 min,暗房用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,Image J軟件檢測各蛋白條帶A值,計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間兩兩比較采用Dunnett’s檢驗(yàn),多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,計(jì)數(shù)資料的比較使用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法;以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 周氏固金消瘤湯含藥血清可以抑制A549細(xì)胞活性 與空白血清組相比,ZSGJXLT含藥血清對A549細(xì)胞的活性有顯著抑制作用,與時(shí)間及濃度呈正相關(guān)性,其中5%、10%、20%、30%與40% ZSGJXLT含藥血清作用A549細(xì)胞24 h后,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞活性下降。24 h的IC50為25.42%。見表1。

表1 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細(xì)胞活性的影響(%)

2.2 周氏固金消瘤湯含藥血清可以抑制A549細(xì)胞的劃痕愈合 與空白對照組相比,5% ZSGJXLT(ZSGJXLT低劑量)、10% ZSGJXLT(ZSGJXLT中劑量)、20% ZSGJXLT(ZSGJXLT高劑量)含藥血清作用A549細(xì)胞后,細(xì)胞劃痕愈合率均下降,呈濃度依賴性,其中ZSGJXLT中劑量及高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖1(表2)。

圖1 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細(xì)胞劃痕愈合能力的影響(×200)

表2 干預(yù)24 h各組A549細(xì)胞劃痕愈合率比較(%)

2.3 周氏固金消瘤湯含藥血清可以抑制A549細(xì)胞的運(yùn)動 高內(nèi)涵細(xì)胞成像結(jié)果表明,與空白對照組相比,經(jīng)不同濃度ZSGJXLT含藥血清處理的細(xì)胞均方位移隨觀察時(shí)間的延長均呈下降趨勢(圖2),細(xì)胞移動速度也不同程度下降,其中ZSGJXLT中劑量及高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表3。細(xì)胞位移軌跡(圖3)及實(shí)時(shí)動態(tài)位移圖(圖4)觀察到隨著ZSGJXLT含藥血清濃度的增加,細(xì)胞運(yùn)動能力逐漸下降,呈濃度依賴性。

圖2 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細(xì)胞均方位移的影響

圖3 各組A549細(xì)胞實(shí)時(shí)位移軌跡變化

圖4 各組A549細(xì)胞實(shí)時(shí)動態(tài)位移圖(×20)

表3 各組A549細(xì)胞移動速度比較(mm/s)

2.4 周氏固金消瘤湯含藥血清可以抑制A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力 與空白對照組比較,ZSGJXLT低劑量、中劑量及高劑量組A549細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)量明顯減少(均P<0.05),而與藥物濃度呈正相關(guān),見表4(圖5、6)。

圖5 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

圖6 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細(xì)胞遷移能力的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

表4 干預(yù)24 h各組A549細(xì)胞相對侵襲、遷移百分比比較(%)

2.5 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細(xì)胞中JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)不同濃度ZSGJXLT含藥血清處理A549細(xì)胞24 h后,隨著含藥血清濃度的增加,p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3及VEGFA/β-actin相對表達(dá)水平下降,其中ZSGJXLT中劑量及高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);MMP-9、MMP-2及N-cadherin表達(dá)下降,E-cadherin表達(dá)升高,其中ZSGJXLT高劑量組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表5。

表5 各組細(xì)胞中JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較

3 討 論

肺癌相當(dāng)于中醫(yī)古籍中的“息賁”“肺積”等病癥,病機(jī)特點(diǎn)為“痰、瘀、毒、虛”,以“虛”“痰”為關(guān)鍵病理因素,多因稟賦不足、外感六淫、飲食失調(diào)、情志不暢等,致使肺失宣降,氣滯血瘀,津液失布,聚濕成痰,久積成塊。周岱翰教授針對肺癌“脾虛痰濕”關(guān)鍵病機(jī),基于“培土生金”理念提出“益氣除痰”為肺癌治療大法[14-15]。周氏固金消瘤湯作為益氣除痰經(jīng)典方劑,攻補(bǔ)兼施、寒溫并用,治以益氣除痰、解毒消癥,方中薏苡仁、守宮除痰散結(jié)為君,人參、百部益氣健脾、潤肺止咳,生南星、龍葵、干蟾皮燥濕化痰、散結(jié)解毒,共為臣藥,浙貝母清熱化痰,解毒散結(jié)為佐使。臨床研究初步發(fā)現(xiàn)ZSGJXLT聯(lián)合化療對非小細(xì)胞肺癌脾虛痰濕型患者有增效減毒之功[16]。有研究通過小鼠抑瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ZSGJXLT的抗肺癌活性[13]。血清藥理學(xué)能夠真實(shí)反映中藥復(fù)方及單體在體內(nèi)的消化、吸收、代謝及最終產(chǎn)生藥理效應(yīng)的成分,在藥效機(jī)制研究中具有可信度高等優(yōu)勢[17]。因而ZSGJXLT的血清藥理學(xué)研究能為復(fù)方的抗肺癌活性提供更具說服力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致手術(shù)、放化療等現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段失敗的主要原因,因而揭示腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制,尋找有效阻斷劑,是延長腫瘤患者生存期的關(guān)鍵。大量研究證實(shí)中醫(yī)藥能通過抑制腫瘤細(xì)胞運(yùn)動、遷移和腫瘤血管生成,調(diào)控腫瘤微環(huán)境及EMT等途徑逆轉(zhuǎn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[18]。張亞輝等[19]證實(shí)肺巖寧能下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)抑制人肺腺癌A549細(xì)胞EMT發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移。王鑫[20]證實(shí)爪哇黃芩素可影響腫瘤侵襲遷移相關(guān)基因,從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移。屈直[21]研究證實(shí)二陳湯可以通過多種途徑發(fā)揮抑制血管生成、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的作用。

蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號通路參與腫瘤增殖、血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)過程,涉及E-cadherin、VEGF等多種細(xì)胞因子[22],與諸多惡性腫瘤如非小細(xì)胞肺癌等的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。抑癌因子可通過靶向JAK2/STAT3通路發(fā)揮抗肺癌侵襲轉(zhuǎn)移活性,如SH2B3[23]能通過調(diào)控JAK2/STAT3通路,抑制肺癌增殖及EMT等阻礙肺癌細(xì)胞遷移。STAT3的異常激活可上調(diào)腫瘤血管生成關(guān)鍵因子VEGF的表達(dá),如巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β能通過激活STAT3和NF-κB,上調(diào)VEGFA進(jìn)而促進(jìn)血管生成[24]。N-cadherin蛋白表達(dá)升高及E-cadherin蛋白表達(dá)缺失是EMT的主要特征,可使腫瘤獲得侵襲能力[25]。EMT與腫瘤血管生成作為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié),均涉及VEGF、MMP-9及MMP-2等共同調(diào)控因子,如MMP-9可裂解細(xì)胞外基質(zhì)從而釋放VEGF,VEGF刺激局部產(chǎn)生MMP促使毛細(xì)血管進(jìn)一步延伸侵襲到細(xì)胞外基質(zhì)。

本研究結(jié)果顯示,周氏固金消瘤湯含藥血清對JAK2、STAT3總蛋白及其磷酸化蛋白都有抑制作用,下調(diào)下游因子VEGFA、N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá),上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá),提示復(fù)方的抗肺癌侵襲轉(zhuǎn)移活性可能通過靶向JAK2/STAT3信號通路來實(shí)現(xiàn)。同時(shí)本研究不足之處在于僅設(shè)計(jì)了不同濃度的ZSGJXLT含藥血清組,而未設(shè)置陽性對照組,無法充分評價(jià)該藥物的作用。盡管提到ZSGJXLT通過影響JAK2/STAT3信號通路來發(fā)揮作用,但是沒有對具體是如何影響這一通路中的特定分子相互作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。