基于石墨烯泡沫的電增強(qiáng)固相微萃取-高效液相色譜法測(cè)定魚肉中3 種磺胺類的殘留

孫瑞雪，方禹文，陳冬妍，陳全勝，陳曉梅

（集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021）

磺胺類抗生素（sulfonamides，SAs）是一類廣譜抗菌藥物，其結(jié)構(gòu)以對(duì)氨基苯磺酰胺為主，SAs的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中，SAs由于具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[1]。近年來(lái)，隨著水產(chǎn)品集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，部分養(yǎng)殖戶為減少高密度水產(chǎn)品的養(yǎng)殖病害，超量、超期使用SAs，造成水產(chǎn)品中較高的SAs殘留。消費(fèi)者長(zhǎng)期攝入此類水產(chǎn)品，將導(dǎo)致SAs在體內(nèi)蓄積，損傷人體免疫系統(tǒng)，引起胃腸道疾病，甚至出現(xiàn)休克和內(nèi)臟損害[2]。為保護(hù)消費(fèi)者的健康，中國(guó)、歐盟等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)規(guī)定，在食用動(dòng)物組織中添加SAs的最大限量為100 μg/kg[3]。但是，水產(chǎn)品中SAs殘留超標(biāo)的事件還是頻繁出現(xiàn)。SAs的傳統(tǒng)檢測(cè)方法以高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法為主，但HPLC法的前處理過(guò)程比較復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的水產(chǎn)品中SAs殘留的檢測(cè)。目前廣泛使用的前處理方法有液液萃取和固相萃取等，這些前處理方法普遍存在程序比較復(fù)雜、有機(jī)溶劑的高消耗、耗時(shí)、高環(huán)境污染、自動(dòng)化難度大、成本高和吸附劑選擇少等缺點(diǎn)。因此，開發(fā)一種高效、簡(jiǎn)便和環(huán)保的前處理方法，對(duì)于實(shí)現(xiàn)SAs的簡(jiǎn)便、高精度檢測(cè)，具有很大的現(xiàn)實(shí)意義。

圖1 SAs的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic chemical structure of SAs

固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）技術(shù)是在固相萃取[4]技術(shù)的基礎(chǔ)之上發(fā)展而來(lái)的，具有簡(jiǎn)單、高效和無(wú)毒害等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于樣品前處理中。SPME主要有纖維萃取和管內(nèi)萃取兩種模式。纖維萃取模式常見的有直接萃取[5-7]、頂空萃取[8-10]和膜保護(hù)萃取[11-12]。纖維萃取裝置組成比較簡(jiǎn)單，包括萃取頭和手柄，與注射器相似。纖維萃取模式的基體支持物主要是石英纖維、不銹鋼絲等材料，將固定相涂層涂漬在支持物表面，然后對(duì)樣品中的待測(cè)物進(jìn)行萃取和富集。管內(nèi)萃取則以石英毛細(xì)管[13-15]和peek管[16-17]等材料作為基體支持物。SPME的富集能力主要取決于涂層材料的吸附性能、極性和厚度等，而上述兩種萃取模式都存在涂層材料用量少、萃取容量不夠大的缺點(diǎn)，這在一定程度上影響了SPME的富集效率[18]。近年來(lái)，整體柱（monolith，M）作為一種新的SPME萃取模式，因其單體豐富、制作工藝簡(jiǎn)單、滲透性好、易于功能化等優(yōu)點(diǎn)而受到人們的關(guān)注。此外，隨著性能優(yōu)越的納米材料的不斷引入，M的萃取性能也顯著提升。例如，Wang Yu[19]和Wu Xinze[20]等研究表明，將碳基材料等比表面積大的材料引入M中，可以顯著增加M的比表面積，并豐富M中的官能團(tuán)，有效提高萃取效率。石墨烯是一種新型的碳質(zhì)材料，具有大比表面積、高韌性和高導(dǎo)電性等優(yōu)點(diǎn)，本課題組在前期研究中用離子液體作為石墨烯的黏合劑，制備了一種具有優(yōu)異導(dǎo)電性和表面易于更新的電極，并成功用于貝類中Pb2+、Cd2+含量的同時(shí)檢測(cè)[21]。但石墨烯間較強(qiáng)的相互作用致使其易于堆疊，造成其比表面積減小。所以，人們研制出一種三維結(jié)構(gòu)的石墨烯，它可以在維持原有超大比表面積、超高導(dǎo)電率的同時(shí)，避免石墨烯的片層間發(fā)生堆疊。本課題組在前期研究中利用水熱法合成了三維石墨烯并成功應(yīng)用蝦加工副產(chǎn)物中Hg2+的脫除[22]。氨基功能化的三維石墨烯泡沫（nitrogen-doped three-dimensional graphene foam，NGF）具有比表面積大、孔徑豐富且規(guī)則、導(dǎo)電性好等優(yōu)點(diǎn)。本研究利用NGF功能化M（M@NGF），一方面可提高M(jìn)的比表面積，增強(qiáng)萃取效果；另一方面可提高M(jìn)的導(dǎo)電性，有利于將電化學(xué)技術(shù)引入SPME中，提高萃取效率。目前鮮有研究將NGF用于功能化M，且鮮有利用M萃取SAs的報(bào)道。此外，傳統(tǒng)的SPME法主要基于被動(dòng)分配萃取目標(biāo)物，萃取速度不夠理想。近年來(lái)，科研人員開發(fā)出電輔助增強(qiáng)固相微萃?。╡lectroenhanced solid phase microextraction，EE-SPME）技術(shù)，在萃取過(guò)程中施加電場(chǎng)，帶電的待測(cè)物可以通過(guò)電泳被捕獲到固定相中，此方法的萃取速度明顯比被動(dòng)分配要快[23-24]。

本研究以檢測(cè)魚肉中磺胺噻唑（sulfathiazole，ST）、磺胺二甲基嘧啶（sulfamethazine，SM2）和磺胺二甲氧嘧啶（sulfadimethoxypyrimidine，SMM）3 種物質(zhì)為目的，用離子液體1-乙烯基-3-辛基咪唑四氟硼酸鹽（1-octyl-3-vinylimidazolium tetrafluoroborate，VOT）作為功能單體，2,2′-偶氮二異丁腈（2,2′-azobisisobutyronitrile，AIBN）作為熱引發(fā)劑，二乙烯基苯（divinylbenzene，DVB）作為交聯(lián)劑，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作為致孔劑，NGF作為導(dǎo)電增強(qiáng)劑，通過(guò)超聲、裝管、成型，得到穩(wěn)定性良好、孔徑豐富的M。采用EE-SPME法結(jié)合HPLC技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)SAs快速、準(zhǔn)確的測(cè)定。最后，將本方法應(yīng)用于草魚、羅非魚、金鯧魚、鱸魚4 種魚肉中ST、SM2、SMM含量的檢測(cè)。綜上所述，本研究基于原位聚合法制備了M@NGF，并將EE-SPME和HPLC結(jié)合，開發(fā)了一種快速、靈敏的檢測(cè)魚肉中SAs的方法，為食品中抗生素的檢測(cè)提供了新的方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚肉樣品（草魚、羅非魚、金鯧魚、鱸魚）購(gòu)自廈門市集美區(qū)水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。

磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品：ST（GBW（E）060904，99.9%）、SM2（71169，99.9%）、SMM（190-11101，99.0%）壇墨質(zhì)檢-國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；VOT（99%）中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）美國(guó)天地試劑有限公司；DVB（80%）、DMSO（98%）、AIBN（97%）、γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）、無(wú)水乙醇、甲酸（色譜純）麥克林化工有限公司；氧化石墨烯（graphene oxide，GO）分散液（2 mg/mL）蘇州碳豐科技有限公司；不銹鋼絲（stainless steel wires，SSW）上海璽帛金屬制品有限公司。

每周用乙腈配制ST、SM2、SMM原液（100 μg/mL），4 ℃保存。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在使用前要用乙腈稀釋。

1.2 儀器與設(shè)備

Sigma 300掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）德國(guó)卡爾蔡司股份公司；1260高效液相色譜系統(tǒng)（配備2998可變波長(zhǎng)檢測(cè)器（variable wavelength detector，VWD））美國(guó)安捷倫公司；KH-250E超聲波清洗機(jī) 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；DHG-9053A干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Unique-R20+UV超純水機(jī) 廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司；PS-305DM直流電源 深圳市邦企創(chuàng)源科技有限公司；RCT basic磁力攪拌器 德國(guó)艾卡有限公司；pH700型pH計(jì) 美國(guó)優(yōu)特儀器有限公司；ALPHA傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）儀德國(guó)布魯克儀器公司；ASAP2460全自動(dòng)比表面及孔隙度（BET）分析儀 美國(guó)麥克儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 NGF的制備

將20 mg的γ-PGA加入到10 mL的GO中，攪拌2 h至充分溶解。然后轉(zhuǎn)移到20 mL的反應(yīng)釜中，90 ℃水熱反應(yīng)3 h，得到NGF凝膠，再用乙醇和去離子水依次清洗，最后真空冷凍干燥2 d，即得到所需NGF[25]。

1.3.2 M@NGF的制備

根據(jù)原位聚合的方法制備多孔M@NGF[26]。具體如下：首先，稱取130 mg功能單體（VOT）、100 mg交聯(lián)劑（DVB）和5 mg熱引發(fā)劑（AIBN），溶解于100 mg致孔劑（DMSO）中，然后加入5 mg NGF，超聲5 min使其充分混合；然后，將混合溶液注入長(zhǎng)為3 cm、內(nèi)徑為2 mm的模具管中，聚合物溶液高度控制在2 cm左右。將管朝下的一端用硅膠塞密封，另一端垂直插入一根長(zhǎng)度為10 cm的SSW；最后，在70 ℃的烘箱中進(jìn)行原位聚合16 h。聚合完成后，冷卻至室溫，脫去外層模具管，即得到M@NGF。將M@NGF浸泡在甲醇中，以清除未反應(yīng)的組分。

1.3.3 M@NGF的表征

1.3.3.1 紅外光譜表征

將溴化鉀粉末與M@NGF按照質(zhì)量比1∶100的比例稱量后置于研缽中充分研磨，用壓片機(jī)壓成均勻薄片，放于FTIR儀中，測(cè)定其紅外吸收光譜。

1.3.3.2 比表面積和孔徑分布的測(cè)定

使用全自動(dòng)比表面積分析儀測(cè)量樣品的比表面積和孔徑分布。測(cè)定前，將M@NGF樣品在90 ℃條件下真空脫氣8 h。待樣品冷卻至室溫后，放入全自動(dòng)比表面積和分析儀中，以高純氮為介質(zhì)進(jìn)行吸附。采用多點(diǎn)BET方程計(jì)算比表面積，使用BJH方法計(jì)算孔徑分布。

1.3.3.3 SEM表征

將待測(cè)樣品用導(dǎo)電膠固定在樣品盤上，并對(duì)試樣進(jìn)行噴金處理，在SEM下觀察樣品結(jié)構(gòu)。

1.3.4 EE-SPME萃取SAs的過(guò)程

EE-SPME萃取SAs的過(guò)程如圖2所示。首先，將M@NGF依次浸入甲醇和超純水中10 min以活化M@NGF。然后，將M@NGF和SSW插入溶液中，分別連接直流電源負(fù)極和正極，施加-1.0 V的電壓，在300 r/min條件下對(duì)含有SAs的溶液萃取35 min。萃取完成后，將M@NGF和SSW移到1 mL的混合洗脫溶液（甲醇/水和甲酸/水）中，分別連接電源的正極和負(fù)極，施加1.5 V的電壓，在300 r/min的攪拌速度下解吸SAs。20 min后，用N2將解吸液吹干，再用1000 μL的初始流動(dòng)相重新溶解干燥的殘?jiān)?，最后?.22 μm的濾膜過(guò)濾，濾液用HPLC分析檢測(cè)。

圖2 基于M@NGF的EE-SPME HPLC法檢測(cè)SAs的示意圖Fig.2 Schematic diagram of M@NGF based EE-SPME HPLC method for the detection of SAs

1.3.5 樣品制備

將準(zhǔn)確稱量的1 g均質(zhì)魚肉樣品加入離心管中，隨后加入50 mL 30%甲醇水混合溶液，渦旋振蕩5 min，超聲處理10 min。然后將混合物在5000 r/min離心10 min。最后將上清液轉(zhuǎn)移到燒杯中，進(jìn)行1.3.4節(jié)中的操作。

1.3.6 色譜條件

色譜柱：Welch C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液（A相）和乙腈（B相）；流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量80 μL。梯度洗脫程序如表1所示。此方法用保留時(shí)間確定SAs，用色譜峰面積量化和計(jì)算萃取回收率。

表1 SAs的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures for analysis of SAs

1.3.7 萃取條件的優(yōu)化

對(duì)吸附時(shí)間（20～40 min）、攪拌速度（100～400 r/min）、吸附電壓（-2.5～-0.5 V）、離子強(qiáng)度（0%～0.8%）、樣品溶液pH值（2～10）、解吸時(shí)間（5～25 min）、解吸電壓（1.0～3.0 V）和解吸液組成（甲醇、甲酸和水的體積分?jǐn)?shù)）進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.8 萃取性能

分別從M@NGF的富集效果、萃取選擇性、使用壽命和檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性4 個(gè)方面評(píng)價(jià)M@NGF的萃取性能。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理分析采用軟件Origin 2021、Excel和PowerPoint，其中作圖使用Origin 2021和PowerPoint，線性回歸方程、偏差值、回收率采用Excel處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 M@NGF的表征

首先用傅里葉變換紅外光譜對(duì)M@NGF進(jìn)行了表征，圖譜如圖3A所示。在M@NGF的紅外曲線中，位于1640 cm-1和1058 cm-1處的吸收峰分別屬于VOT的咪唑基和BF4-基團(tuán)的吸收。在3149、1601、1554 cm-1和1456 cm-1處的吸收峰可以證明苯環(huán)的存在。3410 cm-1處的吸收峰為N—H的伸縮振動(dòng)峰，1160、1596、2357 cm-1處的吸收峰則分別為NGF的C—O—C伸縮振動(dòng)、N—H彎曲振動(dòng)和C—N的耦合以及C—N的對(duì)稱伸縮振動(dòng)。以上結(jié)果表明，M@NGF的紅外曲線中包含了VOT和NGF的特征吸收峰，說(shuō)明NGF成功對(duì)M進(jìn)行了功能化。M@NGF的BET曲線如圖3B所示，M@NGF表現(xiàn)為II型等溫線，孔徑約為40 nm，經(jīng)過(guò)計(jì)算得出M@NGF的比表面積約為25 m2/g。

圖3 NGF、整體柱以及M@NGF的FTIR曲線（A）和M@NGF的BET曲線（B）Fig.3 FTIR spectra of NGF,monolith,and M@NGF (A) and BET curves of M@NGF (B)

NGF的SEM圖如圖4A所示，可以看出NGF呈片狀堆疊狀，且具有較多孔洞，孔徑約為10 μm左右。由圖4B中M@NGF的SEM圖可以看出，SSW的表面包裹著均勻的聚合物，較為平整、光滑；由圖4B的插圖中M@NGF的照片可以看出其長(zhǎng)度約為2 cm；圖4C1為NGF的橫截面SEM圖，可以看出M@NGF內(nèi)徑約為2 mm。圖4C2為其放大的SEM圖，可以看出聚合物內(nèi)部孔洞較為豐富且均勻。這些特殊的多孔結(jié)構(gòu)可以為液體流動(dòng)提供較大的孔道，有利于加快待測(cè)物對(duì)流傳質(zhì)，進(jìn)而提高對(duì)SAs的萃取效率。

圖4 NGF（A）、M@NGF（B）和M@NGF截面（C）的SEM圖Fig.4 SEM images of NGF(A),M@NGF (B) and cross-section of M@NGF (C)

2.2 吸附和解吸條件的優(yōu)化

為獲得對(duì)SAs的最佳萃取效率，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了EE-SPME過(guò)程的條件，包括吸附和解吸電壓、吸附和解吸時(shí)間、樣品溶液的pH值、攪拌速度、解吸液組成及含水量等。

2.2.1 吸附時(shí)間、攪拌速度、離子強(qiáng)度和pH值的影響

2.2.1.1 吸附時(shí)間的影響

SPME是基于待測(cè)物在樣品及萃取相之間平衡分配的一個(gè)過(guò)程，但EE-SPME在電場(chǎng)的作用下，可以有效加快吸附速率。本研究考察了在外加電場(chǎng)的作用下，萃取量在20～40 min范圍內(nèi)的變化。結(jié)果如圖5A所示（E表示施加電壓，下同），所有目標(biāo)物的萃取量在20～35 min內(nèi)迅速增加，在35～40 min內(nèi)基本保持不變。此外，在其他因素保持不變的情況下，以不施加電場(chǎng)的SPME的吸附速率作為對(duì)照。可以看出，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，除了ST以外，SM2和SMM的萃取量都有所增加。在35～40 min之間，不施加電場(chǎng)的SPME，對(duì)3 種SAs的萃取量仍有明顯增加的趨勢(shì)，說(shuō)明還未達(dá)到吸附平衡。此外，在35 min時(shí)，未加電場(chǎng)的SPME對(duì)3 種SAs的萃取效果遠(yuǎn)差于EE-SPME的效果，說(shuō)明EE-SPME方法可以顯著增強(qiáng)對(duì)3 種SAs的萃取效率，并且在35 min時(shí)便可達(dá)到吸附平衡。

圖5 吸附時(shí)間（A）、攪拌速度（B）、離子強(qiáng)度（C）和pH值（D）對(duì)萃取效率的影響Fig.5 Effects of adsorption time (A),agitation speed (B),ionic strength (C)and pH (D) on the extraction efficiency

2.2.1.2 攪拌速度的影響

考察攪拌速度在100～400 r/min范圍內(nèi)對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果如圖5B所示。在100～400 r/min范圍內(nèi)，300 r/min的萃取效果最好。攪拌是為了提高目標(biāo)物的溶解效率，使萃取過(guò)程中的目標(biāo)物均勻分散在樣品溶液中，本實(shí)驗(yàn)采用了電壓作為輔助萃取手段，當(dāng)攪拌速度小于300 r/min時(shí)，溶液分子擴(kuò)散到電極表面速率較慢，無(wú)法在電極表面進(jìn)行有效傳質(zhì)，而當(dāng)攪拌速度太高時(shí)，電極表面的目標(biāo)物分子擴(kuò)散太快，擴(kuò)散層很薄，目標(biāo)物來(lái)不及被電極上的吸附劑吸附，導(dǎo)致信號(hào)降低，且攪拌速度過(guò)快，不利于電極表面吸附劑的穩(wěn)定性，所以本實(shí)驗(yàn)選取300 r/min作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的攪拌速度。

2.2.1.3 離子強(qiáng)度的影響

通過(guò)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%～0.8%的NaCl，研究離子強(qiáng)度對(duì)萃取量的影響。如圖5C所示，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%～0.6%時(shí)，SAs的峰面積隨著NaCl含量的增加而上升；而在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.6%時(shí)，峰面積呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這可能是由于少量的NaCl可以提高溶液的導(dǎo)電率，從而有利于分析物的傳質(zhì)；然而，過(guò)量的Cl-在電場(chǎng)的作用下可能會(huì)與電離的SAs競(jìng)爭(zhēng)，與吸附劑結(jié)合，從而不利于SAs的萃取?；诖私Y(jié)果，后續(xù)研究選擇添加0.6%的NaCl提升萃取性能。

2.2.1.4 樣品溶液pH值的影響

因?yàn)槲絼┖湍繕?biāo)物中存在極性基團(tuán)，所以樣品溶液的pH值也會(huì)影響吸附劑對(duì)目標(biāo)物的萃取性能。所以，本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)控制pH值在2.0～10.0之間驗(yàn)證溶液的pH值對(duì)萃取效果的影響。如圖5D所示，在pH值為6.0時(shí)，M@NGF對(duì)于SAs的萃取效果最好。而在pH值小于6.0時(shí)，M@NGF和SAs中的N原子發(fā)生了質(zhì)子化，吸附劑與目標(biāo)物之間會(huì)產(chǎn)生靜電排斥，不利于SAs的吸附。隨著溶液pH值的增加，靜電斥力會(huì)減弱，同時(shí)，氫鍵相互作用也會(huì)參與萃取過(guò)程，使萃取效果提升。但溶液的pH值太大，SAs的氨基可能會(huì)發(fā)生脫質(zhì)子化反應(yīng)，電場(chǎng)的增強(qiáng)作用減弱，這會(huì)導(dǎo)致萃取性能下降[24,27-28]。根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果，后續(xù)研究將樣品溶液的pH值控制在6.0。

2.2.2 電壓的影響

吸附和解吸時(shí)所施加的電壓是影響萃取效果的重要要素。本實(shí)驗(yàn)考察了吸附和解吸電壓對(duì)SAs萃取效果的影響，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)吸附電壓為-1.0 V時(shí)，3 種SAs均能達(dá)到最大的峰面積（圖6A）。在解吸步驟中（圖6B），電壓在1.0～1.5 V范圍內(nèi)，3 種SAs的峰面積都隨著電壓的升高而增加，而在1.5～3.0 V范圍內(nèi)的解吸效果明顯變差。根據(jù)此結(jié)果，將吸附和解吸步驟的外加電壓分別設(shè)置為-1.0 V和1.5 V。

圖6 吸附電壓（A）和解吸電壓（B）對(duì)萃取效率的影響Fig.6 Effects of adsorption voltage (A) and desorption voltage (B) on the extraction efficiency

2.2.3 解吸時(shí)間和解吸液的影響

2.2.3.1 解吸時(shí)間的影響

圖7A顯示了在5～25 min范圍內(nèi)解吸時(shí)間對(duì)解吸效果的影響。在電場(chǎng)作用下，20 min內(nèi)幾乎可以完全釋放出M@NGF中所萃取的SAs。而在未施加電壓的實(shí)驗(yàn)中，可以觀察到SAs有緩慢的解吸過(guò)程，但即使解吸時(shí)間延長(zhǎng)到25 min，仍不能完全解吸出SAs。以上結(jié)果表明，在萃取過(guò)程中施加電場(chǎng)可以明顯加快吸附和解吸速度，縮短樣品制備的時(shí)間。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選擇20 min作為解吸時(shí)間。

圖7 解吸時(shí)間（A）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（B）、甲酸體積分?jǐn)?shù)（C）和水體積分?jǐn)?shù)（D）對(duì)萃取效率的影響Fig.7 Effect of desorption time (A),and volume fractions of methanol (B),formic acid (C) and water (D) on the extraction efficiency

2.2.3.2 甲醇體積分?jǐn)?shù)的影響

考察了解吸液中甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%～100%時(shí)對(duì)萃取效果的影響。結(jié)果如圖7B所示，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，表現(xiàn)出最好的解吸效果。

2.2.3.3 甲酸體積分?jǐn)?shù)的影響

由于SAs的吸附中存在B-N配位、離子交換和氫鍵作用等，所以在洗脫液中加入一些酸有利于破壞相關(guān)的相互作用。基于此，在甲醇（90%）溶液中加入不同比例的甲酸，以洗脫M@NGF中吸附的SAs。如圖7C所示，2%的甲酸對(duì)SAs的洗脫效果最佳?；谏鲜鼋Y(jié)果，后續(xù)研究選擇2%的甲酸與90%的甲醇的混合溶液作為洗脫液。

2.2.3.4 水體積分?jǐn)?shù)的影響

已有研究表明，改變解吸溶劑中的水體積會(huì)改變洗脫液的導(dǎo)電性，從而影響解吸的效果。如圖7D所示，當(dāng)洗脫液中水的體積分?jǐn)?shù)由5%增加到10%時(shí)，3 種SAs的峰面積均明顯增加，此后便隨著水體積的增加而減少。這也證實(shí)了解吸溶劑中有少量的水存在時(shí)可以提高吸附劑的導(dǎo)電性，一定程度上促進(jìn)了吸附劑中SAs的釋放。但當(dāng)洗脫溶液含水量過(guò)多時(shí)，甲醇和甲酸在洗脫液中的比例會(huì)相應(yīng)降低，反而導(dǎo)致吸附的SAs不能完全從M@NGF中釋放。綜合考慮，在后續(xù)研究的中，解吸液中水的體積分?jǐn)?shù)設(shè)置為10%。

2.3 M@NGF的萃取性能

考察了基于M@NGF的EE-SPME和直接SPME對(duì)SAs的萃取效果。如圖8A所示，直接用樣品溶液進(jìn)樣只能出現(xiàn)很弱的色譜峰（曲線a），而經(jīng)過(guò)EE-SPME（曲線c）后，SAs的響應(yīng)信號(hào)增大了58～74 倍（基于M@NGF的EE-SPME法對(duì)ST、SM2和SMM的富集倍數(shù)分別為74、58和64），同時(shí)與未施加電場(chǎng)的直接SPME（曲線b）相比，SAs的響應(yīng)信號(hào)也明顯增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，在萃取過(guò)程中施加電場(chǎng)可以提高M(jìn)@NGF對(duì)SAs的萃取性能。

圖8 不同前處理的SAs色譜圖（A）和M@NGF的選擇性（B）、使用壽命（C）和重復(fù)性（D）Fig.8 Chromatograms of SAs (A) after different pre-treatments and selectivity (B),lifetime (C) and repeatability (D) of M@NGF

考察了M@NGF對(duì)SAs的選擇性。選取諾氟沙星、土霉素、氯霉素、羅紅霉素作為干擾物（含量均為50 μg/kg），研究M@NGF對(duì)SAs選擇性。如圖8B所示，在4 種抗生素存在的情況下，M@NGF對(duì)SAs的萃取仍然能保持原有效果。這表明本實(shí)驗(yàn)所制備的M@NGF對(duì)SAs具有較好的選擇性。由于物理吸附中的靜電作用與物質(zhì)的Zeta電位和pH值以及pKa（酸度系數(shù)）相關(guān)，pKa會(huì)影響分子的存在形式從而影響吸附效果，本實(shí)驗(yàn)選取的4 種干擾物的pKa普遍高于SAs的pKa。本實(shí)驗(yàn)所選取的pH值為6，通過(guò)查閱文獻(xiàn)，諾氟沙星在pH＜6.1時(shí)以陽(yáng)離子存在，不利于被吸附[29]；土霉素的最佳吸附pH值為8[30]；氯霉素在pH值為6時(shí)被吸附量最低[31]；羅紅霉素在pH 7.2時(shí)才能達(dá)到最大吸附[32]；所以，在pH值為6時(shí)，均不利于另外4 種抗生素的吸附，因此，在優(yōu)化好的條件下，本實(shí)驗(yàn)對(duì)SAs表現(xiàn)出最好的吸附行為。

考察了M@NGF的使用壽命，用同一根M@NGF連續(xù)萃取30 次后，得到的結(jié)果如圖8C所示，M@NGF的萃取性能沒有明顯變化，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）范圍為1.3%～3.0%，說(shuō)明M@NGF具有良好的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的使用壽命。

考察了M@NGF的重復(fù)性，在優(yōu)化的萃取條件下，選擇平行制備的5 根M@NGF對(duì)SAs進(jìn)行萃取、檢測(cè)。結(jié)果如圖8D所示，5 根M@NGF萃取到的SAs量無(wú)顯著差異，RSD為5.7%，表明M@NGF具有較好的重復(fù)性。

2.4 線性范圍和檢出限

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最佳萃取條件：吸附時(shí)間35 min、吸附電壓-1.0 V、吸附液pH 6、解吸時(shí)間20 min、解吸電壓1.5 V、甲醇體積分?jǐn)?shù)90%、甲酸體積分?jǐn)?shù)2%。在優(yōu)化的萃取條件下，對(duì)5～5000 μg/kg系列含量的SAs用基于M@NGF的EE-SPME、基于M@NGF的直接SPME以及未摻雜NGF的EE-SPME進(jìn)行萃取、測(cè)定。以峰面積y對(duì)SAs的含量x繪制工作曲線，基于M@NGF的EE-SPME，ST、SM2和SMM的檢出限分別為1.78、3.16 μg/kg和1.84 μg/kg，定量限均為5 μg/kg，決定系數(shù)（R2）均大于0.9990，結(jié)果如表2所示?；贛@NGF的EE-SPME相對(duì)于基于M@NGF的直接SPME和基于未摻雜NGF的EE-SPME兩種方式不管是在檢測(cè)范圍還是檢出限方面均表現(xiàn)出更好的檢測(cè)性能，說(shuō)明所建立的基于M@NGF的EE-SPME方法可以在前處理中有效提高SAs的萃取效率，實(shí)現(xiàn)對(duì)SAs的高效、快速測(cè)定。

表2 基于M@NGF的EE-SPME和直接SPME以及未摻雜NGF的EE-SPME對(duì)SAs的線性范圍和檢出限Table 2 Linear ranges and detection limits of SAs using EE-SPME and direct SPME based on M@NGF and non-NGF-doped EE-SPME

2.5 實(shí)際樣品分析和回收率的測(cè)定

選取草魚、羅非魚、金鯧魚、鱸魚4 種市場(chǎng)銷售的魚進(jìn)行分析檢測(cè)，均未檢出ST、SM2和SMM。

為考察食品基質(zhì)對(duì)萃取效果的影響，選取草魚、羅非魚、金鯧魚、鱸魚4 種魚進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)并計(jì)算回收率，結(jié)果如表3所示，3 種SAs的加標(biāo)回收率范圍為79.2%～110.1%（n＝5），RSD范圍為1.4%～9.8%，說(shuō)明此法的精密度和重復(fù)性都比較好。

表3 4 種魚肉樣品中3 種SAs的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of three SAs in four spiked fish samples

2.6 與其他方法的比較

為了驗(yàn)證本方法的優(yōu)越性，將此EE-SPME與其他已報(bào)道的SPME檢測(cè)方法進(jìn)行比較。結(jié)果如表4所示，所建立的基于M@NGF的EE-SPME方法在檢測(cè)SAs時(shí)，表現(xiàn)出更寬的檢測(cè)范圍和更低的檢出限。相對(duì)于傳統(tǒng)的SPME方法，本方法不僅保留了傳統(tǒng)SPME固有的優(yōu)點(diǎn)，還增加了氨基功能化的石墨烯材料和高效的電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的功能，在增大吸附劑的比表面積的同時(shí)還可以有效加快吸附、解吸過(guò)程中的傳質(zhì)，提高前處理的效率。說(shuō)明本方法對(duì)SAs的檢測(cè)具備良好的分析性能。

表4 各種 SAs 檢測(cè)方法的性能比較Table 4 Comparison of analytical figures of merit of various SA detection methods

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種基于M@NGF的EE-SPME前處理方法，結(jié)合HPLC法快速測(cè)定4 種魚肉中的ST、SM2、SMM殘留。研究結(jié)果表明，所制備的M@NGF不僅能提高SAs的富集效果，還表現(xiàn)出良好的選擇性和穩(wěn)定性。另外，EE-SPME可以有效驅(qū)動(dòng)電場(chǎng)，提高萃取效率。以吸附時(shí)間35 min、吸附電壓-1.0 V、吸附液pH 6、解吸時(shí)間20 min、解吸電壓1.5 V、解吸液中含有90%的甲醇和2%的甲酸為最佳萃取條件，本方法對(duì)ST、SM2和SMM的檢出限分別為1.78、3.16 μg/kg和1.84 μg/kg，定量限均為5 μg/kg，加標(biāo)回收率為79.2%～110.1%，RSD范圍為1.4%～9.8%，方法準(zhǔn)確度較高，可滿足魚肉中3 種SAs殘留定性、定量分析的要求。本方法集萃取和濃縮為一體，具有過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性較好等優(yōu)點(diǎn)，為魚肉中抗生素殘留安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供了新的可行途徑。