玻璃態(tài)液氮速凍對藍(lán)莓品質(zhì)特性的影響

黃碧飛，李 洋，胡澤茜

（東北林業(yè)大學(xué)土木與交通學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

藍(lán)莓，又名越橘，果實(shí)香氣宜人、皮薄汁多，果肉細(xì)膩、酸甜可口[1]。藍(lán)莓富含花青素、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，素有“漿果之王”的美稱，被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織認(rèn)定為人類五大健康食品之一，研究表明經(jīng)常食用藍(lán)莓有助于消除眼睛疲勞、強(qiáng)化視力、抗氧化和延緩衰老等[2-3]。藍(lán)莓鮮果水分極多，采后呼吸代謝旺盛，易造成水分流失和霉菌生長，導(dǎo)致果實(shí)腐爛變質(zhì)和營養(yǎng)成分流失，不能長期存放[4]。因此需要有效的方法延長藍(lán)莓果實(shí)保質(zhì)期且最大限度地保留其營養(yǎng)成分。冷凍是食品保鮮的基礎(chǔ)和核心技術(shù)，是保持食品原始質(zhì)量并延長貯藏壽命最廣泛使用的方法之一，許多食品甚至可以直接在冷凍狀態(tài)食用[5]。

食品的冷凍貯藏溫度高于安全貯藏溫度會對其新鮮度和其他重要的質(zhì)量參數(shù)產(chǎn)生負(fù)面的影響，因此，在安全溫度下貯藏對于增強(qiáng)食品的穩(wěn)定性是必要的[6]?；诓ＡЩD(zhuǎn)變的概念，當(dāng)貯藏溫度低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，分子遷移率顯著降低[7]，所以食物在玻璃化狀態(tài)下高度穩(wěn)定。因此，可以采用貯藏溫度低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度方式，最大限度地控制食品內(nèi)部營養(yǎng)成分的流失。對于含水量高（含有冷凍水）的食品，玻璃化轉(zhuǎn)變和結(jié)冰是較為復(fù)雜的過程，食品的穩(wěn)定性可以根據(jù)其狀態(tài)圖的特征玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg′或Tg″）和特征凍結(jié)終點(diǎn)溫度（Tm′）確定[8]。一些研究報道，低于Tg′的冷凍貯藏可以提供更高的食品質(zhì)量。Li Xianxian等[9]的研究表明，Tg′、Tm′對芒果冷凍貯藏過程中的穩(wěn)定性十分重要。Xu Congcong等[10]建立了芹菜的狀態(tài)圖，發(fā)現(xiàn)低于Tg′的溫度是保持冷凍芹菜質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的最佳選擇。Tian You等[11]得出結(jié)論，低于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的冷凍儲存更能保持冬蟲夏草的質(zhì)量。

為了實(shí)現(xiàn)完全的玻璃化轉(zhuǎn)變，通常需要106K/s的降溫速率，而在實(shí)際應(yīng)用過程中，對于水分含量高的食品，很難達(dá)到這么高的冷凍速率[12]。液氮速凍傳熱速率快，能夠促進(jìn)短時間內(nèi)細(xì)小冰晶的形成，從而提供質(zhì)量更好的冷凍食品。對荔枝[13]、楊梅[14]研究表明，相比于浸漬冷凍和冰柜冷凍，液氮噴霧速凍在凍荔枝、凍楊梅的品質(zhì)保持上具有顯著優(yōu)勢。Cao Xuehui等[15]將藍(lán)莓在液氮中浸漬冷凍約30 s至中心溫度達(dá)到-18 ℃，發(fā)現(xiàn)果實(shí)出現(xiàn)霜凍開裂，導(dǎo)致更高的滴水損失和其他品質(zhì)下降。Cheng Lina等[16]評估了液氮噴霧冷凍（-100～-20 ℃）藍(lán)莓至中心溫度-20 ℃的質(zhì)量變化，認(rèn)為液氮-80 ℃是藍(lán)莓的最佳冷凍溫度。趙遠(yuǎn)恒等[17]認(rèn)為液氮速凍可以實(shí)現(xiàn)食品處于玻璃化狀態(tài)。

目前關(guān)于藍(lán)莓玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的報道相對匱乏，尤其是液氮速凍結(jié)合特征玻璃化轉(zhuǎn)變溫度冷凍藍(lán)莓?；诖耍狙芯客ㄟ^測定藍(lán)莓的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，構(gòu)建狀態(tài)圖確定其特征玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，以藍(lán)莓特征玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為凍結(jié)終點(diǎn)，對比分析超低溫冰箱冷凍（-80 ℃）、液氮速凍（-80、-100、-120 ℃）對冷凍藍(lán)莓品質(zhì)特性的影響，探究適宜的冷凍條件保持冷凍藍(lán)莓的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘北村’藍(lán)莓采自哈爾濱紅旗鄉(xiāng)中沃藍(lán)莓基地，挑選無病蟲害、無機(jī)械損傷、成熟度一致、大小均勻的新鮮果實(shí)于4 ℃冷藏備用。

氯化鋰、乙酸鉀、氯化鎂、碳酸鉀、溴化鈉、碘化鉀、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀、百里香酚、聚乙烯吡咯烷酮（均為分析純），變色硅膠（化學(xué)純）西隴科學(xué)股份公司；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、酚酞指示劑、淀粉指示劑 廣州和為醫(yī)藥科技有限公司；淀粉指示劑、碘酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、戊二醛固定液、磷酸鹽緩沖液 福州飛凈生物科技有限公司；鹽酸、甲醇、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、聚乙二醇6000、曲拉通X-100、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫溶液、鄰苯二酚、無水乙醇國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1A-80真空冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器有限公司；ML204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DH3600II電熱恒溫培養(yǎng)箱 河北菲斯福儀器有限公司；DSC214 Polyma差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC）德國NETZSCH公司；MDF-U33V 型-86 ℃超低溫冰箱 日本PHC bi公司；BCD215SEEB多溫度冰箱 青島海爾電器有限公司；YET-640X溫度記錄儀 興化市蘇瑪電器儀表有限公司；GY-3硬度計 衢州艾普計量儀器有限公司；Master RI手持式折光儀 上海儀電分析儀器有限公司；TGL-20B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；T6新世紀(jì)型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DDS-11A電導(dǎo)率儀 上海越平科學(xué)儀器有限公司；Sigma500掃描電子顯微鏡 德國ZEISS公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

藍(lán)莓果實(shí)放入真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，冷阱溫度為-60 ℃，絕對壓力為10 Pa，持續(xù)干燥48 h，將凍干樣品打成粉末，并將其放置于含有變色硅膠的干燥器中2 周，使藍(lán)莓粉脫水至恒質(zhì)量，即為藍(lán)莓凍干粉。參考Zhao Jinghong等[18]的方法，為獲得不同水分活度（aw）的樣品，分別稱取1 g藍(lán)莓凍干粉于稱量瓶內(nèi)，放置于裝有不同飽和鹽溶液的干燥器上方，當(dāng)aw＞0.75時，在干燥器內(nèi)放置一個裝有適量百里香酚的稱量瓶防止樣品發(fā)霉，然后將干燥器轉(zhuǎn)移至溫度為25 ℃的恒溫箱內(nèi)平衡48 h。使用不同飽和鹽溶液（氯化鋰、乙酸鉀、氯化鎂、碳酸鉀、溴化鈉、碘化鉀、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀），得到aw分別為0.11、0.23、0.33、0.43、0.58、0.69、0.75、0.84、0.97的樣品。此外，為獲得aw＞0.97的樣品，將預(yù)先計算好的蒸餾水和凍干粉直接加入到稱量瓶中，并將密封后的稱量瓶置于4 ℃干燥器中平衡24 h。樣品的含水率通過平衡前后凍干粉的質(zhì)量差計算。

1.3.2 玻璃化轉(zhuǎn)變溫度測定

參照楚文靖等[19]的方法并略作修改，使用DSC測定不同含水率樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。將5～10 mg樣品放入坩堝中并密封，于室溫條件下加載到儀器上，每次分析均使用空的密封坩堝作為參考，使用雙重掃描程序。aw為0.11～0.69的樣品測定條件：溫度范圍為-80～40 ℃，升溫和降溫速率均為10 ℃/min，并在-80 ℃保持5 min。aw＞0.75的樣品測定條件：溫度范圍為-100～20 ℃，升溫和降溫速度率均為10 ℃/min，并在-100 ℃保持5 min。使用與儀器搭配的Proteus軟件分析掃描熱流曲線，得到不同含水率樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變初始點(diǎn)（Tgi）、中點(diǎn)（Tgm）和終點(diǎn)（Tge），以及部分樣品的初始凍結(jié)溫度（TF）和凍結(jié)終點(diǎn)溫度（Tm）。本實(shí)驗(yàn)以Tgm為樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，TF為冰晶熔融吸熱峰的峰值溫度，Tm為冰晶熔融吸熱曲線的基線與吸熱曲線左邊的交點(diǎn)處溫度。

利用Gordon-Taylor（GT）方程（式（1））對樣品濕基含水率和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tgm）之間的關(guān)系進(jìn)行模擬，利用Clausius-Clapeyron（CC）方程（式（2））對樣品濕基含水率和凍結(jié)溫度（TF）之間的關(guān)系進(jìn)行模擬，由固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的樣品Tm平均值計算得出最大凍結(jié)濃縮狀態(tài)Tm′，繪制出藍(lán)莓的狀態(tài)圖，確定藍(lán)莓的Tg′（即Tm′垂直線與玻璃化轉(zhuǎn)變曲線交點(diǎn)處溫度）和Tg″（即凍結(jié)曲線與玻璃化轉(zhuǎn)變曲線交點(diǎn)處溫度）及其對應(yīng)的固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)Xs′和Xs″。

式中：Tgm為樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度/℃；Tgs為固體的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度/℃；Tgw為水的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（-135 ℃）；Xs為樣品固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)（濕基）/%；Xw為樣品含水率（濕基）/%；k為GT方程擬合參數(shù)。

式中：ΔT為凍結(jié)溫度降低值/℃（ΔT＝Tw-TF，Tw水的凍結(jié)點(diǎn)溫度/℃，TF為樣品的初始凍結(jié)溫度/℃）；β為水的凍結(jié)常數(shù)（1 860 kg·K/（kg·mol））；λw為水的分子質(zhì)量；E為水和固體分子質(zhì)量之比（E＝λw/λs，λs為固體分子質(zhì)量）；Xs為樣品的固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)（濕基）/%。

1.3.3 藍(lán)莓冷凍處理

將藍(lán)莓果實(shí)分別在超低溫冰箱-80 ℃（記為RF-80 ℃）冷凍和液氮-80、-100、-120 ℃浸漬冷凍（以下分別用LN-80 ℃、LN-100 ℃、LN-120 ℃表示），當(dāng)果實(shí)中心溫度降至-53 ℃（低于藍(lán)莓Tg′＝-52.55 ℃）時，冷凍完成。冷凍后的樣品放置在-60 ℃（低于藍(lán)莓Tg′）冰箱中貯藏72 h，于4 ℃冰箱解凍后進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.3.4 凍結(jié)曲線的測定

使用K型熱電偶和溫度記錄儀測定冷凍過程中藍(lán)莓果實(shí)中心溫度的變化，記錄不同冷凍處理組所花費(fèi)的時間。根據(jù)不同冷凍條件下藍(lán)莓果實(shí)通過最大冰晶生成帶（-5～-1 ℃）的時間計算凍結(jié)速率[11]，如式（3）所示：

式中：T1＝-5 ℃；T2＝-1 ℃；Δt為通過最大冰晶生成帶的時間/s。

1.3.5 藍(lán)莓品質(zhì)指標(biāo)的測定

汁液損失率測定參考張曉敏等[20]的方法并略作修改，分別測定藍(lán)莓果實(shí)冷凍前和解凍后的質(zhì)量，按式（4）計算：

硬度用硬度計測定（單位為N/cm2）?？偪扇苄怨绦挝铮╰otal soluble solids，TSS）質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）用手持折光儀測定。可滴定酸（titratable acid，TA）質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）用酸堿滴定法測定[21]?？箟难幔╒C）含量用碘酸鉀滴定法測定[21]，單位為mg/100 g?；ㄇ嗨睾坑米贤夥止夤舛扔嫹y定[21]，單位為ΔOD/g。丙二醛（malondialdehyde，M D A）含量用紫外分光光度法測定[21]，單位為nmol/g。相對電導(dǎo)率測定參考張曉敏等[20]的方法，單位為%，用相對電導(dǎo)率表示細(xì)胞膜透性。過氧化物酶（peroxidase，POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性分別用愈創(chuàng)木酚比色法和鄰苯二酚比色法測定[21]。

1.3.6 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考Cheng Lina等[16]的方法，使用掃描電鏡觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水分含量藍(lán)莓的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度

食品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度與食品自身的水分含量、溶質(zhì)的成分和分子質(zhì)量密切相關(guān)，大多數(shù)物料呈含水率越高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度越低的變化規(guī)律，可根據(jù)樣品的DSC熱流曲線是否有熔融峰出現(xiàn)判斷樣品含非凍結(jié)水或凍結(jié)水[8]。如表1所示，由于水的塑化作用，藍(lán)莓的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度隨著含水率的增加而降低，當(dāng)樣品（濕基）水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由2%增加至80%時，其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度由-7.99 ℃降至-60.56 ℃。如圖1A所示，當(dāng)藍(lán)莓凍干粉樣品的aw＜0.75、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜23%時，僅發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變，未檢測出樣品的Tm和TF，說明這些樣品在凍結(jié)過程中并沒有冰晶生成，含非凍結(jié)水。這與楚文靖等[19]的研究結(jié)果保持一致。如圖1B所示，當(dāng)藍(lán)莓凍干粉樣品（濕基）水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在31%～80%時，DSC熱流曲線同時檢測出樣品的Tm、TF和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，說明這些樣品含凍結(jié)水。當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞80%時，藍(lán)莓鮮果（Xw＝85%）的熱流曲線如圖1C所示，只觀察到Tm和TF出現(xiàn)，未檢測到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。隨著固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)由15%增加至69%，藍(lán)莓的Tm從-14.20 ℃降至-35.41 ℃，而當(dāng)樣品固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞39%時，樣品的Tm十分接近，幾乎保持不變。當(dāng)固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53%和69%時，Tm的平均值為-34.17 ℃。

圖1 藍(lán)莓的典型DSC熱流曲線Fig.1 Typical DSC heat flow curves of blueberries

表1 不同水分含量藍(lán)莓的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Table 1 Glass transition temperature of blueberries at different moisture contents

狀態(tài)圖是食品不同狀態(tài)時的水分含量或固體含量和溫度的關(guān)系圖，可用于評估低水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)食品和冷凍食品的貯藏穩(wěn)定性，以及選擇合適的溫度和水分含量條件進(jìn)行加工[22]。藍(lán)莓的狀態(tài)圖由玻璃化轉(zhuǎn)變曲線（EF）、凍結(jié)曲線（AC）和最大凍結(jié)濃縮狀態(tài)（B點(diǎn)）組成。如圖2所示，玻璃化轉(zhuǎn)變曲線經(jīng)由GT方程擬合（R2＝0.983），得出方程參數(shù)Tgs和k分別為0.22和2.04。凍結(jié)曲線由CC方程擬合（R2＝0.972），得出參數(shù)E為0.1，藍(lán)莓中固形物的相對分子質(zhì)量為218.28。當(dāng)所有可凍結(jié)的水完全轉(zhuǎn)化為冰，并且在實(shí)際的時間尺度上停止冰的形成，凍結(jié)濃縮達(dá)到其組成的最大值，并被稱為最大凍結(jié)濃縮狀態(tài)[8]。最大凍結(jié)濃縮狀態(tài)B點(diǎn)即特征凍結(jié)終點(diǎn)Tm′為-34.17 ℃，對應(yīng)的Xs′為76%，而對應(yīng)的Xw′（24%）被認(rèn)為是不可凍結(jié)水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。不可凍結(jié)水包括未結(jié)晶的自由水和附著在固體基質(zhì)上的結(jié)合水。根據(jù)狀態(tài)圖確定藍(lán)莓的特征玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg′（D點(diǎn)）和Tg″（C點(diǎn)）分別為-52.55 ℃和-46.03 ℃，對應(yīng)的固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為76.0%和79.6%。

圖2 藍(lán)莓的狀態(tài)圖Fig.2 State diagram of blueberries

根據(jù)玻璃化轉(zhuǎn)變概念，當(dāng)溫度降至食品最大冷凍濃縮狀態(tài)的Tg′以下，則可以認(rèn)為此時食物處于玻璃化狀態(tài)，穩(wěn)定性最高。因此，本研究的冷凍實(shí)驗(yàn)選擇-53 ℃（低于-52.55 ℃）作為藍(lán)莓的凍結(jié)終點(diǎn)。

2.2 不同冷凍方式對藍(lán)莓凍結(jié)曲線的影響

如圖3所示，RF-80 ℃、LN-80 ℃、LN-100 ℃、LN-120 ℃組的藍(lán)莓果實(shí)中心溫度降至終點(diǎn)溫度Tg′所需時間分別為4 057.50、799.08、673.26、550.44 s，通過最大冰晶生成帶的時間分別為153.33、137.95、124.88、108.76 s，凍結(jié)速率分別為1.57、1.74、1.92、2.21 ℃/min。冷凍過程中，液氮冷凍的總時間和通過最大冰晶生成帶的時間明顯短于冰箱冷凍，凍結(jié)速率明顯高于冰箱冷凍，這是因?yàn)橐旱獋鳠崴俣缺容^快。液氮冷凍組隨著冷凍的環(huán)境溫度的降低，總冷凍時間和通過最大冰晶生成帶的時間也縮短，凍結(jié)速率提高。冷凍速率與冷凍食品的質(zhì)量有直接關(guān)系，一般來說，快速冷凍有利于在果實(shí)細(xì)胞內(nèi)外形成細(xì)小且分布均勻的冰晶，進(jìn)而保護(hù)果實(shí)內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，從而有利于保持冷凍果實(shí)的品質(zhì)[23]。

圖3 不同冷凍冷凍方式下的藍(lán)莓凍結(jié)曲線Fig.3 Freezing curves of blueberries under different freezing methods

2.3 不同冷凍方式對藍(lán)莓汁液流失和硬度的影響

水分是保持果實(shí)品質(zhì)及感官良好的決定性物質(zhì)，水分流失會導(dǎo)致果實(shí)硬度下降，破壞其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，降低各類感官品質(zhì)[24]。冷凍樣品解凍后的水分通常會產(chǎn)生一定的損失，這會影響樣品整體的品質(zhì)變化，因此，汁液流失是評價其質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。如圖4A所示，4 種不同冷凍溫度對藍(lán)莓樣品汁液流失的影響存在顯著差異，且果實(shí)的汁液流失率隨冷凍溫度的降低而減少。LN-120 ℃冷凍組的汁液流失率最低，為1.57%，與LN-100 ℃組樣品無顯著差異，與LN-80 ℃組和RF-80 ℃組差異顯著；而RF-80 ℃冷凍組的汁液流失率最高，為2.44%。Cheng Lina等[16]研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度的進(jìn)一步降低，汁液流失不斷減少，這表明一定程度上高冷凍速率有利于果實(shí)內(nèi)部水分的保持。

圖4 不同冷凍方式下的藍(lán)莓果實(shí)汁液流失率（A）和硬度（B）Fig.4 Juice loss (A) and hardness (B) of blueberry fruit under different freezing methods

冷凍樣品經(jīng)歷冷凍和解凍（冰晶的形成和冰晶的融化）兩次相變過程會對果實(shí)的組織結(jié)構(gòu)造成一定程度的不可逆破壞，進(jìn)而影響樣品的質(zhì)地。研究發(fā)現(xiàn)，與緩凍相比，速凍形成的小尺寸冰晶對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞更小，對樣品質(zhì)地的影響更小[25]。冷凍果實(shí)的質(zhì)地變化通常由果實(shí)的硬度反映，如圖4B所示。樣品經(jīng)過冷凍再解凍后硬度顯著降低，RF-80 ℃、LN-80 ℃、LN-100 ℃、LN-120 ℃冷凍藍(lán)莓的硬度分別是鮮果的43.27%、45.03%、45.92%、47.46%，經(jīng)過冷凍處理后的果實(shí)硬度都不足鮮果的50%，呈現(xiàn)出冷凍溫度越高，硬度越低的規(guī)律。RF-80 ℃和LN-120 ℃存在顯著差異，其他處理組之間的差異不顯著。

2.4 不同冷凍方式對藍(lán)莓營養(yǎng)物質(zhì)的影響

藍(lán)莓果實(shí)的口感風(fēng)味與TSS和TA含量有關(guān)；VC和花青素是藍(lán)莓主要的營養(yǎng)成分和抗氧化成分，其含量與果實(shí)品質(zhì)密切相關(guān)；這些營養(yǎng)物質(zhì)都是水溶性物質(zhì)，容易伴隨汁液流失而減少。如圖5A、B所示，與鮮果相比，冷凍后藍(lán)莓果實(shí)的TSS和TA含量都有所降低。RF-80 ℃、LN-80 ℃、LN-100 ℃、LN-120 ℃冷凍藍(lán)莓的TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為11.83%、12.10%、12.37%、13.67%，TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.85%、0.85%、0.87%、0.90%，LN-120 ℃冷凍藍(lán)莓的TSS和TA保留率最高。如圖5C、D所示，與TSS和TA含量的變化類似，冷凍后的藍(lán)莓果實(shí)的VC和花青素含量也出現(xiàn)不同程度的降低。RF-80 ℃、LN-80 ℃、LN-100 ℃、LN-120 ℃冷凍藍(lán)莓的VC含量分別為27.34、28.12、29.36、30.41 mg/100 g，花青素含量依次為LN-120 ℃＞LN-100 ℃＞LN-80 ℃＞RF-80 ℃，其中LN-120 ℃的花青素含量最高，為1.12 ΔOD/g。RF-80 ℃冷凍組藍(lán)莓的TSS、TA、VC和花青素含量都比液氮速凍組低，液氮速凍組藍(lán)莓的營養(yǎng)物質(zhì)含量隨著冷凍溫度的降低有所增長。

圖5 不同冷凍方式下的藍(lán)莓果實(shí)TSS含量（A）、TA含量（B）、VC含量（C）和花青素含量（D）Fig.5 TSS (A),TA (B),VC (C) and anthocyanin (D) contents of blueberry fruit under different freezing methods

水分是維持藍(lán)莓風(fēng)味營養(yǎng)物質(zhì)的必要條件，當(dāng)大量水分流失時，溶于果實(shí)水分中的營養(yǎng)成分也隨之流失[26]。楊瑾莉等[23]的研究結(jié)果顯示，隨著液氮速凍溫度下降，火龍果的汁液流失率下降，TSS和TA含量上升。王喜芳等[27]的研究結(jié)果顯示，凍結(jié)溫度越低，草莓中VC和花青素的保留率越高。結(jié)合冷凍藍(lán)莓的汁液流失情況與TSS、TA、VC和花青素含量的變化結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓TSS、TA、VC和花青素含量的變化隨汁液流失的增加而降低。由此推斷，低溫液氮速凍使果實(shí)內(nèi)部水分在短時間內(nèi)快速凍結(jié)，在一定程度上抑制水分發(fā)生大規(guī)模遷移和內(nèi)部結(jié)構(gòu)損傷，因而有助于減緩藍(lán)莓營養(yǎng)物質(zhì)的流失。

2.5 不同冷凍方式對藍(lán)莓細(xì)胞膜完整性的影響

當(dāng)果蔬受到損傷時，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)會遭到破壞，膜透過性增高，繼而膜內(nèi)電解質(zhì)外泄，使得相對電導(dǎo)率升高；MDA是生物細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化的產(chǎn)物，會破壞膜結(jié)構(gòu)，增加膜透性，因此，相對電導(dǎo)率和MDA含量可以評判細(xì)胞膜完整性和破損程度[28]。如圖6所示，冷凍處理后的藍(lán)莓的相對電導(dǎo)率和MDA皆顯著升高，且凍結(jié)速率越慢上升幅度越大。對比鮮果，RF-80 ℃、LN-80 ℃、LN-100 ℃、LN-120 ℃冷凍藍(lán)莓的相對電導(dǎo)率分別升高71.00%、53.97%、40.92%、32.71%，MDA含量分別增加34.41%、32.13%、28.30%、24.61%，LN-120 ℃組顯著低于其他冷凍處理組。有研究表明，冷凍處理對草莓細(xì)胞膜透性有顯著影響，-80 ℃快速凍結(jié)組相對電導(dǎo)率較-18 ℃慢凍組小，細(xì)胞破壞程度輕[29]。張曉敏等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍過程中加入超聲波能夠使冷凍速率更快，在一定程度上抑制相對電導(dǎo)率和MDA含量的升高，保護(hù)藍(lán)莓果實(shí)細(xì)胞膜的完整性。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，說明提高凍結(jié)速率有利于保護(hù)果實(shí)的細(xì)胞膜完整性。

圖6 不同冷凍方式下的藍(lán)莓果實(shí)相對電導(dǎo)率（A）和MDA含量（B）Fig.6 Relative conductivity (A) and MDA content (B) of blueberry fruit under different freezing methods

2.6 不同冷凍方式對藍(lán)莓酶活性的影響

PPO和POD會引起酚類化合物的氧化，造成酚類化合物的降解和果實(shí)褐變。研究表明，POD和PPO活性越低，越有利于藍(lán)莓的實(shí)際生產(chǎn)[30]。Zhu Zhiwei等[31]研究發(fā)現(xiàn)，冷凍后枸杞PPO和POD活性顯著降低，因?yàn)橹参锛?xì)胞中的PPO和POD以游離和結(jié)合狀態(tài)存在，冷凍可以部分滅活游離態(tài)酶，而細(xì)胞壁和其他細(xì)胞器中的部分結(jié)合態(tài)酶可以釋放從而轉(zhuǎn)化為游離態(tài)。如圖7所示，經(jīng)過冷凍處理后的藍(lán)莓的POD和PPO活力并沒有降低，與Zhu Zhiwei等[31]的研究結(jié)果不同。冷凍后藍(lán)莓的POD和PPO活性均顯著高于鮮果。這一趨勢與液氮噴霧冷凍板栗的酶活性變化相同，隨著冷凍速率的提高，POD和PPO活性逐漸降低[32]。對比鮮果，RF-80 ℃冷凍組的POD和PPO活力分別增加了41.75%和35.23%，而LN-120 ℃組的POD和PPO活力僅增加10.84%和8.81%。這可能是由于較高的冷凍速率生產(chǎn)較小的冰晶，對細(xì)胞的損傷較小，這使得酶位于最初的細(xì)胞區(qū)域內(nèi)，更好地保護(hù)了酶的結(jié)構(gòu)，因此對酶活力影響較小。

圖7 不同冷凍方式下的藍(lán)莓果實(shí)POD活性（A）和PPO活性（B）Fig.7 POD (A) and PPO (B) activity of blueberry fruit under different freezing methods

2.7 不同冷凍方式對藍(lán)莓微觀結(jié)構(gòu)的影響

在冷凍過程中，藍(lán)莓果實(shí)內(nèi)部水分發(fā)生相變，冰晶的形成和生長過程中內(nèi)部水分會發(fā)生遷移，果實(shí)的內(nèi)部細(xì)胞形態(tài)也隨之變化[33]。如圖8所示，經(jīng)過冷凍后的藍(lán)莓果實(shí)內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化。藍(lán)莓鮮果的內(nèi)部組織無明顯的變形和斷裂，組織結(jié)構(gòu)飽滿；RF-80 ℃組的內(nèi)部組織出現(xiàn)大小不一的孔洞和空隙，結(jié)構(gòu)變形程度比較嚴(yán)重。液氮冷凍組的藍(lán)莓結(jié)構(gòu)同樣也出現(xiàn)不同程度的變形，LN-120 ℃組的藍(lán)莓樣品無較大孔洞，結(jié)構(gòu)更接近新鮮藍(lán)莓；LN-100 ℃組藍(lán)莓產(chǎn)生一些大小比較接近的孔洞；LN-80 ℃組藍(lán)莓產(chǎn)生大小不一的孔洞且大孔洞居多；LN-120 ℃組樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性和緊密性明顯優(yōu)于LN-80 ℃和LN-100 ℃組。經(jīng)過冷凍處理的藍(lán)莓果實(shí)內(nèi)部結(jié)構(gòu)不可避免地遭到破壞，提高冷凍速率在一定程度上能減輕冷凍對果實(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的損傷。這與張方方[34]和Cheng Lina等[16]觀察到的趨勢一致，凍結(jié)速度越快越有利于維持冷凍過程中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

本研究以藍(lán)莓的特征玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg′為凍結(jié)終點(diǎn)，采用液氮-120 ℃的冷凍條件對藍(lán)莓進(jìn)行冷凍處理，該條件能夠很好地保持凍結(jié)藍(lán)莓的品質(zhì)特性。LN-120 ℃明顯縮短了藍(lán)莓的冷凍總時間和通過最大冰晶生成帶的時間，提高冷凍速率；該條件下藍(lán)莓的TSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)、TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)、VC含量和花青素含量分別為13.67%、0.90%、30.41 mg/100 g和1.12 ΔOD/g，保留率均在90%以上，能夠最大限度地減少藍(lán)莓營養(yǎng)成分的流失；相比于鮮果，相對電導(dǎo)率和MDA含量分別提高了32.71%和24.61%，POD和PPO活力提高了10.84%和8.81%，微觀結(jié)構(gòu)的完整性和緊密性與鮮果更接近，可有效減緩藍(lán)莓的膜脂過氧化和組織損傷程度。本研究可為藍(lán)莓速凍加工提供理論支撐和技術(shù)參考。