肉蓯蓉總苷對HepG2肝癌荷瘤小鼠的影響

馮 朵，王 靖，蔣勇軍，周士琦，段 昊，李靜圓，閆文杰,*

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100023；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所，北京 100081；3.內(nèi)蒙古三口生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000）

肉蓯蓉具有多種保健功能，具有明顯的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。肉蓯蓉作為食藥同源物質(zhì)，在肝癌治療中可以在早期預(yù)防、中晚期輔助治療方面起到預(yù)防和治療兼顧的作用。已有多項(xiàng)研究證明，肉蓯蓉具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等多種營養(yǎng)保健作用[2-6]。

研究表明肉蓯蓉總苷（total glycosides，TG）具有保肝護(hù)肝、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化和改善記憶的作用。研究發(fā)現(xiàn)荒漠肉蓯蓉TG可激活核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor NF-E2-related factor 2，Nrf2）/Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap-1）通路，保護(hù)急性酒精性肝損傷[7]。此外，肉蓯蓉TG對神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用[8]，表觀改善大鼠認(rèn)知功能[9-10]。還可與枸杞多糖配伍提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，抑制腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平[11]。

人體的生物屏障、免疫系統(tǒng)與龐大的腸道菌群之間形成一種微妙的和諧共生關(guān)系[12]，始終處于動(dòng)態(tài)、復(fù)雜的人體生態(tài)系統(tǒng)中[13]。腸道微生物群組成及其代謝物與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[14]，之間存在復(fù)雜的相互作用[15]。腸-肝軸雙向連接調(diào)節(jié)腸道微生物群的組成、腸上皮屏障和血管屏障的完整性，研究發(fā)現(xiàn)可以利用微生物治療肝細(xì)胞癌[16]。其中，微生物組成和功能是了解肝癌進(jìn)展的重要方面[17]。

調(diào)節(jié)腸道微生物是提高肝癌免疫治療療效、減少不良反應(yīng)的很有前途的策略[14]。此外，調(diào)節(jié)腸道微生物還可重塑炎癥微環(huán)境，腸道微生物群會影響肝臟炎癥微環(huán)境，可為癌癥預(yù)防和治療開辟新思路[18]。Chen Wen等[15]在腸道菌群失衡的小鼠中可觀察到膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（sterol-regulatory element binding protein 2，SREBP2）升高，SREBP2的藥理學(xué)抑制可減弱腸道菌群失衡下小鼠肝癌的起始作用。Schneider等[18]研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物群直接影響小鼠和人的肝臟炎癥微環(huán)境，從而影響肝細(xì)胞癌的發(fā)展。隨著對肝臟相關(guān)疾病的深入研究，專家學(xué)者們發(fā)現(xiàn)腸道菌群及其代謝物是肝癌發(fā)展中的重要參與者，因此從新視角深入了解腸道微生物在肝癌中的作用機(jī)制尤為重要[19]。

目前，肉蓯蓉TG對肝癌小鼠的研究少有報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)將HepG2肝癌細(xì)胞皮下注射到小鼠右后腿處，待細(xì)胞不斷增殖成瘤，期間給小鼠灌胃不同劑量TG，觀察藥物對裸鼠體內(nèi)腫瘤的抑制作用，從氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫、改善代謝和平衡腸道微生物層面深入探討TG在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果，以期為TG深度開發(fā)為抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Balb/c-nu裸鼠（雄性，體質(zhì)號量18～22 g）（生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008）購自北京華阜康生物科技有限公司，于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測中心SPF級動(dòng)物房（使用許可證號：SYXK（京）2023-0013）單籠飼養(yǎng)，保持12 h的明/暗循環(huán)，溫度（26±1）℃，相對濕度（60±5）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4%多聚甲醛、二甲苯、無水乙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒 南京建成科技有限公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

肉蓯蓉TG（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥75%，以松果菊苷和毛蕊花糖苷合計(jì)）由內(nèi)蒙古三口生物科技有限公司提供，用水溶解至相應(yīng)質(zhì)量濃度[20-21]。

1.2 儀器與設(shè)備

AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)、Bioanalyzer 2100生物分析儀 美國安捷倫科技公司；QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國Promega生物技術(shù)有限公司；ASP200S全自動(dòng)脫水機(jī)、RM2235石蠟切片機(jī)、HI1220烤片臺、DM3000正置熒光顯微鏡 德國Leica有限公司；INFINITE M NANO多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；UV-1600紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及皮下成瘤模型建立

HepG2肝癌細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶90%時(shí)進(jìn)行傳代，傳代3 次后，使用胰酶消化，完全培養(yǎng)液終止消化細(xì)胞，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用磷酸鹽緩沖液重懸至2×107個(gè)/mL，然后取0.1 mL細(xì)胞懸液用一次性注射器接種于裸鼠右后腿處皮下。接種HepG2肝癌細(xì)胞10 d后，將造模成功的動(dòng)物隨機(jī)分為4 組，分別為A組：模型組（生理鹽水，n＝9）；B組：4 mg/kgmbTG（n＝12）；C組：16 mg/kgmbTG（n＝11）；D組：64 mg/kgmbTG（n＝12）。連續(xù)灌胃18 d，期間每4～5 d使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長度和寬度，按式（1）計(jì)算小鼠皮下實(shí)體瘤體積：

末次給藥后，稱小鼠體質(zhì)量，眼球取血后脫頸處死小鼠，解剖剝離小鼠肝、脾和腫瘤組織。將剖離的腫瘤組織稱質(zhì)量后按式（2）計(jì)算抑瘤率，對各個(gè)組織稱質(zhì)量并按（3）計(jì)算臟器指數(shù)：

1.3.2 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察組織病理變化

首先將肝臟和腫瘤組織使用多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋，切成4 μm厚的薄片。組織充分水化后用HE染色，脫水并風(fēng)干切片，中性樹膠封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組織的病理變化并拍照。

1.3.3 肝癌小鼠脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力

以刀豆蛋白A（concanavalin A，con A）誘導(dǎo)動(dòng)物脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，利用四甲基偶氮唑鹽法對淋巴細(xì)胞懸液進(jìn)行測定，待細(xì)胞培養(yǎng)到72 h時(shí)，在570 nm波長處測定其光密度值（OD570nm）。通過式（4）計(jì)算淋巴細(xì)胞的增殖能力：

1.3.4 肝臟組織抗氧化指標(biāo)檢測

準(zhǔn)確稱取肝臟組織質(zhì)量，按照質(zhì)量體積比1∶9（g/mL）加入生理鹽水，剪碎組織，冰水浴超聲勻漿，離心后取上清液，放入4 ℃待測。待測樣本準(zhǔn)備好后，使用BCA法測定各樣本的蛋白質(zhì)量濃度，按照試劑盒說明書內(nèi)容檢測肝臟CAT、GOT、GPT、AKP活力。

1.3.5 腸道內(nèi)容物16S rDNA擴(kuò)增子測序與非靶代謝組學(xué)分析

收集肝癌小鼠腸道內(nèi)容物于凍存管中，委托上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.3.5.1 16S rDNA 擴(kuò)增子測序

采用十六烷基三甲基溴化銨或十二烷基硫酸鈉方法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，并對DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測。根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物和高保真DNA聚合酶對選定的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收，膠回收采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒。參照電泳初步定量結(jié)果，對PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測定量，按照每個(gè)樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。使用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit構(gòu)建庫試劑盒構(gòu)建文庫。構(gòu)建好的文庫通過Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit進(jìn)行質(zhì)檢，文庫質(zhì)檢合格后進(jìn)行上機(jī)測序。

獲得原始數(shù)據(jù)之后，需要進(jìn)行拼接、過濾得到有效數(shù)據(jù)。然后對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)的注釋和分析，篩選組間差異顯著的菌群（線型判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞2以及P＜0.05）。

1.3.5.2 非靶代謝組學(xué)分析

提取樣本，采用預(yù)冷的甲醇-乙腈-水溶液（2∶2∶1，V/V），渦旋充分混合，4 ℃、14 000×g離心20 min，取上清液備用。

采用超高效液相色譜系統(tǒng)HILIC色譜柱進(jìn)行分離。柱溫25 ℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A為水＋25 mmol/L乙酸銨＋25 mmol/L氨水，B為乙腈；梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，5% A、95% B；0.5～7 min，5%～35% A、95%～65% B；7～8 min，35%～60% A、65%～40% B；8～9 min，60% A、40% B；9～9.1 min，60%～5% A、40%～95% B；9.1～12 min，5% A、95% B。

樣本通過色譜系統(tǒng)分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析。電噴霧離子源：正、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測：霧化氣輔助加熱氣1（Gas1和Gas2）壓力為60 psi。一級質(zhì)荷比檢測范圍：60～1 000 Da，二級子離子質(zhì)荷比檢測范圍：25～1 000 Da，一級質(zhì)譜掃描累計(jì)時(shí)間：0.20 s/spectra，二級質(zhì)譜掃描累計(jì)時(shí)間0.05 s/spectra。

獲得原始數(shù)據(jù)之后，進(jìn)一步對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和定量分析，篩選組間差異顯著的代謝物（變量權(quán)重值（variable importance for the projection，VIP）＞1以及T檢驗(yàn)（P＜0.05），然后對篩選到的顯著差異代謝物進(jìn)行定性分析。

1.3.5.3 關(guān)聯(lián)分析

基于Illumina雙端測序平臺，選擇變異區(qū)域，利用保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對高變區(qū)進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析和菌種鑒定。利用β多樣性進(jìn)行組間分析，找出在不同分類水平上的分組間豐度變化差異顯著的物種。

基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對生物樣本中的小分子代謝物進(jìn)行定性和相對定量分析。利用多維統(tǒng)計(jì)分析正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA）的VIP值和單變量統(tǒng)計(jì)分析的P值，找出分組間豐度變化差異顯著的代謝物。

利用Spearman統(tǒng)計(jì)方法分析實(shí)驗(yàn)樣本中篩選到的顯著差異菌群與顯著差異代謝物之間的相關(guān)性系數(shù)，并結(jié)合R語言和Cytoscape軟件，多角度挖掘菌群-代謝物之間的相互作用關(guān)系。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA單因素顯著性分析，結(jié)果以表示；使用Graphpad Prism 8.0.2軟件作圖。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TG對HepG2肝癌小鼠體質(zhì)量的影響

為了確定藥物干預(yù)過程是否會影響裸鼠的正常生長，在飼喂期間對裸鼠的生長、飲食、活動(dòng)能力進(jìn)行跟蹤觀察，發(fā)現(xiàn)裸鼠在整個(gè)飼喂過程中，體質(zhì)量正常生長、飲食正常，無毒副作用，這與Gao Yuqiu等[22]的研究結(jié)果一致。說明TG在抑制裸鼠實(shí)體瘤的同時(shí)，不會影響裸鼠的正常生長。

隨著腫瘤的不斷長大，在干預(yù)后期，模型組小鼠精神狀態(tài)欠佳、行動(dòng)緩慢、食欲下降、體型變瘦、活力下降、皮膚泛白，逐漸表現(xiàn)出惡病質(zhì)癥現(xiàn)象；其他處理組的裸鼠精神狀態(tài)良好、皮膚紅潤、活動(dòng)能力正常；在干預(yù)前期，TG各劑量組體質(zhì)量生長速率較其他組更高（圖1），由此推斷TG可以給裸鼠提供一定的營養(yǎng)補(bǔ)充，但TG各組之間體質(zhì)量沒有差異。

圖1 各組裸鼠平均體質(zhì)量趨勢變化Fig.1 Trends in average body mass of nude mice in each group

整體來看，裸鼠干預(yù)前期體質(zhì)量增長快速，可能是由于腫瘤的快速增長促進(jìn)了小鼠的攝食，導(dǎo)致體質(zhì)量快速增長；中間增長趨勢緩慢，可能是腫瘤的增長進(jìn)入了平臺期；而后期體質(zhì)量的增長可能是由于腫瘤增長占據(jù)了主導(dǎo)地位。

2.2 TG對HepG2肝癌小鼠腫瘤體積的影響

為了觀察藥物是否可以抑制腫瘤的增長，每5 d測量一次裸鼠皮下實(shí)體瘤體積，通過表1發(fā)現(xiàn)，在干預(yù)前期，與模型組對比，處理組的增長趨勢較為緩慢，當(dāng)癌細(xì)胞快速繁殖，瘤體積不斷擴(kuò)大時(shí)，TG具有一定的抑制體內(nèi)腫瘤體積的作用，且高質(zhì)量濃度抑制效果更好（（716.59±514.46）mm3）。

表1 TG對HepG2肝癌小鼠腫瘤體積的影響Table 1 Effect of TG on tumor volume of HepG2-bearing mice

2.3 TG對HepG2肝癌小鼠臟器指數(shù)、抑瘤率的影響

如表2所示，與模型組對比，經(jīng)TG處理后的小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均相應(yīng)地降低，且具劑量-效應(yīng)關(guān)系，但各組別之間均不存在顯著差異（P＞0.05）。各處理組的腫瘤質(zhì)量均小于模型組，說明TG對HepG2荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤均有一定程度的抑制作用，抑瘤率分別為6.133 2%、18.270 6%、26.855 7%，具有劑量依賴性。由于小鼠存在個(gè)體差異，處理組抑瘤率雖有所增長，但是各組之間并不存在顯著差異（P＞0.05）。

表2 TG對HepG2肝癌小鼠臟器指數(shù)、抑瘤率的影響Table 2 Effect of TG on visceral organ indices and tumor suppression rate of HepG2-bearng mice

2.4 TG對HepG2肝癌小鼠組織的影響

如圖2a所示，模型組顯示不規(guī)則的結(jié)構(gòu)和顆粒細(xì)胞質(zhì)，大多數(shù)肝細(xì)胞體積腫脹，細(xì)胞質(zhì)疏松，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，部分肝細(xì)胞顯示周圍微小性癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象[23]。各處理組小鼠肝臟肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較規(guī)則，壞死情況減少，炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減輕，肝細(xì)胞多角或類圓形，呈清淡的嗜酸性著色，細(xì)胞核呈圓形或多角形，位于中央，染色質(zhì)較稀疏，核膜清楚。

圖2 TG作用于小鼠組織HE染色形態(tài)學(xué)變化Fig.2 Morphological changes of TG-treated HepG2-bearing mice by HE staining

腫瘤組織HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠腫瘤細(xì)胞正常，生長旺盛，細(xì)胞核大，腫瘤細(xì)胞排列不規(guī)則，分布緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整（圖2b）。各處理組腫瘤細(xì)胞分布變得越來越稀疏，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，空泡變樣程度增加，細(xì)胞破裂乃至溶解壞死現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)不清，其中，高劑量TG組腫瘤細(xì)胞壞死效果最明顯。

2.5 TG對HepG2肝癌小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

從圖3可知，與模型組對比發(fā)現(xiàn)隨著TG質(zhì)量濃度的提高，脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力逐漸上升，分別增長了5.96%、29.57%、54.88%，呈劑量依賴性，但組間不具有顯著差異（P＞0.05）。該結(jié)果表明，TG可以通過改善小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力從而達(dá)到抑制肝癌小鼠體內(nèi)腫瘤增長的效果。

圖3 TG作用于肝癌小鼠各組脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力Fig.3 Effect of TG on proliferative capacity of splenic lymphocytes in HepG2-bearing mice

2.6 TG對HepG2肝癌小鼠肝臟組織抗氧化指標(biāo)的影響

在癌變和免疫系統(tǒng)受損發(fā)生時(shí)，機(jī)體的抗氧化能力也會下降。由圖4可知，與模型組比較，各處理組的肝臟組織CAT活力都有所上升，低、中、高劑量TG組分別提高了7.62%、18.51%、39.31%，提高幅度較大，各組與模型組之間均存在極顯著差異（P＜0.01）。與模型組對比，TG各劑量組（低、中、高）AKP活力分別下降了0.52%、3.76%、25.46%，其中，TG高劑量組與模型組存在極顯著差異（P＜0.01）。與模型組對比發(fā)現(xiàn)，隨著TG質(zhì)量濃度的提高，各TG劑量組GPT活力分別提高了35.70%、53.59%、62.46%。低、中、高TG劑量組小鼠肝組織GOT活力較模型組分別下降了2.21%、11.00%、11.58%。綜上，推測模型組的肝臟發(fā)生了非常嚴(yán)重的病變，處理組較模型組病變程度低，并且隨著TG濃度的升高，其病變程度隨之降低。結(jié)果表明TG可以提高小鼠抗氧化能力、緩解小鼠肝臟氧化損傷程度、改善肝臟抗氧化功能，從而起到抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長的作用，提示后續(xù)可采用肉蓯蓉輔助治療肝癌患者以保護(hù)肝臟器官免受損傷。

圖4 TG對HepG2肝癌小鼠肝臟組織抗氧化指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of TG on antioxidant indexes of liver tissues in HepG2-bearing mice

2.7 腸道菌群代謝組學(xué)分析

由圖5a可知，本實(shí)驗(yàn)正負(fù)離子模式合并后共鑒定得到1 889 種代謝物，其中正離子鑒定到1 163 種，負(fù)離子鑒定到726 種。對鑒定到的所有代謝物進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，按照化學(xué)分類歸屬信息主要包括有機(jī)酸及其衍生物、脂質(zhì)和類脂分子、有機(jī)雜環(huán)化合物、苯環(huán)型化合物、有機(jī)氧化合物、苯丙烷類和聚酮類、有機(jī)氮化合物、核苷酸及其類似物等。

圖5 肉蓯蓉TG作用于小鼠腸道內(nèi)容物代謝組學(xué)結(jié)果Fig.5 Metabolomics results of intestinal contents in TG-treated mice

OPLS-DA是一種對偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）進(jìn)行修正的分析方法，可以濾除與分類信息無關(guān)的噪音，提高模型的解析能力和有效性；在OPLS-DA得分圖中，有預(yù)測主成分和正交主成分，OPLS-DA將組間差異最大化的反映在t[1]上，可直接區(qū)分組間變異，而在正交主成分to[1]上則反映了組內(nèi)的變異，橢圓代表95%置信區(qū)間，點(diǎn)的分布狀態(tài)反映組間、組內(nèi)的差異度。由圖5b可知，OPLS-DA模型可以區(qū)分A組和D組。

顯著差異代謝物（VIP＞1，P＜0.05）的層次聚類分析結(jié)果如圖5c所示，聚在同一簇內(nèi)的代謝物具有相似的表達(dá)模式，可能具有相似的功能或者共同參與同一代謝過程或細(xì)胞通路。圖5c中每行代表一個(gè)差異代謝物，每列代表一組樣品，紅色代表顯著上調(diào)，藍(lán)色代表顯著下調(diào)，顏色深淺表示上下調(diào)的程度，表達(dá)模式接近的代謝物聚在左側(cè)同一聚類下。結(jié)果表明A組和D組代謝物明顯不同，D組中茴香霉素、伊馬替尼、拉貝洛爾、巨大戟醇、DL-正纈氨酸和原海蔥苷A的含量較高，水楊酸含量較低，表明TG可顯著調(diào)節(jié)肝癌小鼠腸道代謝物水平。

2.8 腸道菌群轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

群落結(jié)構(gòu)組分圖（圖6a）可以展示每個(gè)樣本或分組在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)，根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取A組和D組在屬水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖，以便直觀查看在屬水平上相對豐度較高的物種及其比例。由圖6a可知，D組中擬桿菌屬（Bacteroides）較A組升高，羅氏菌屬（Roseburia）、丹毒絲梭菌屬（Erysipelatoclostridium）較A組降低。

圖6 肉蓯蓉TG作用于小鼠腸道內(nèi)容物16S rDNA檢測結(jié)果Fig.6 16S rDNA sequencing results of intestinal contents in TG-treated mice

微生物覆蓋率為測序深度指數(shù)，均在0.99以上，品種間文庫覆蓋率指數(shù)通過Tukey和Wilcox秩和檢驗(yàn)，如圖6b所示，A組和D組存在顯著差異（P＝0.045＜0.05），D組菌群多樣性高于A組，表明測序深度已基本覆蓋樣品所有的物種，可進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。

β多樣性指數(shù)組間差異分析中，箱形圖可以直觀地反映組內(nèi)物種多樣性的中位數(shù)、離散程度、最大值、最小值、異常值。通過Wilcox秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A和D組間物種多樣性差異極顯著（P＝0.000 659 4＜0.01），組間差異大于組內(nèi)差異（圖6c），表明分組具有意義。

圖6d、e分別是不同處理組小鼠樣本LDA值分布柱狀圖及具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker柱狀圖，代表在A組和D組起重要作用的微生物類群。重點(diǎn)關(guān)注兩組中差異菌屬的相對豐度，A組中卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）、魯杰氏菌屬（Ruegeria）和Tyzzerella_3菌屬的豐度較高；D組中丁酸球菌屬（Butyricicoccus）豐度較高。

2.9 顯著差異菌群和顯著差異代謝物聯(lián)合分析

關(guān)聯(lián)分析是數(shù)據(jù)深入挖掘的一種方式，主要用來發(fā)現(xiàn)隱藏在數(shù)據(jù)集中的關(guān)聯(lián)性或相關(guān)性。16S rDNA與代謝的關(guān)聯(lián)分析主要是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的算法發(fā)現(xiàn)顯著差異菌群與顯著差異代謝物之間的關(guān)聯(lián)。為直觀地反映顯著差異菌群和顯著差異代謝物表達(dá)模式的異同，對差異顯著的菌群和代謝物進(jìn)行Spearman相關(guān)性層次聚類分析。

層次聚類熱圖中每一行表示一個(gè)差異顯著的菌屬，每一列表示一種差異顯著的代謝物。左側(cè)樹杈表示對差異菌屬進(jìn)行聚類的結(jié)果，上側(cè)樹杈表示對差異代謝物進(jìn)行聚類分析的結(jié)果。聚類出現(xiàn)在同一個(gè)聚類的顯著差異代謝物或者差異的菌屬具有相似的相關(guān)性模式。層次聚類熱圖中每一個(gè)格子包含兩種信息（相關(guān)系數(shù)r和P值）。r以顏色表示，r＞0表示正相關(guān)（紅色）；r＜0表示負(fù)相關(guān)（藍(lán)色），顏色越深表示相關(guān)性越強(qiáng)。圖7展示了185 對顯著性相關(guān)的差異菌屬和代謝物，其中58 對的P＜0.01，相關(guān)性極顯著。

圖7 顯著差異菌群與顯著差異代謝物的Spearman相關(guān)性分析層次聚類熱圖Fig.7 Hierarchical clustering heatmap of Spearman correlation analysis of significantly differential intestinal microflora and metabolites

A組和D組樣本在代謝組學(xué)層面上以及菌群多樣性上具有明顯的區(qū)分，共篩選到12 個(gè)顯著差異菌群與60 個(gè)顯著差異代謝物。通過Spearman統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，對兩者之間的相關(guān)性進(jìn)行計(jì)算，共找到72 對具有顯著性正相關(guān)的菌群-代謝物，113 對具有顯著性負(fù)相關(guān)的菌群-代謝物。

3 討論與結(jié)論

前期研究TG在體外水平上，可以顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死[21]。因此需利用動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)檢測，從而對抗腫瘤藥物進(jìn)行全面分析解釋，為肉蓯蓉臨床應(yīng)用提供更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。選用HepG2細(xì)胞接種在裸鼠右后腿處，建立裸鼠皮下實(shí)體瘤模型，造模成功后，灌胃不同質(zhì)量濃度TG，在整個(gè)飼喂過程中，測量小鼠體質(zhì)量變化并分析小鼠的腫瘤體積增長趨勢，監(jiān)督觀察其精神狀態(tài)、飲食和活動(dòng)能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠精神狀態(tài)較差，而處理組精神狀態(tài)良好，且皮膚紅潤，此外，TG不會影響小鼠的正常生長，可以抑制小鼠皮下腫瘤體積的增長。

在HE染色中，蘇木精染液呈堿性，可使細(xì)胞核著藍(lán)紫色；伊紅染液呈酸性，可使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)著紅色。該實(shí)驗(yàn)采用HE染色小鼠肝臟和腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)TG可以減輕肝臟病理變化，緩解炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。此外，TG在保護(hù)肝臟的同時(shí)[23]，破壞腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。HE染色結(jié)果直觀地反映了肉蓯蓉在肝癌小鼠中的肝保護(hù)和抗癌作用。

CAT是過氧化物酶體的標(biāo)志酶，促使過氧化氫分解為水和氧分子，使細(xì)胞和組織器官免受H2O2的毒害[24]。GPT是一種參與人體蛋白質(zhì)新陳代謝的酶，是肝細(xì)胞損傷最敏感和特異的指標(biāo)。GOT是反映肝細(xì)胞壞死程度的標(biāo)準(zhǔn)，主要存在于肝細(xì)胞線粒體中，可以通過檢測肝臟組織中GOT的含量確定肝臟組織病變程度。AKP是一種膜結(jié)合酶，廣泛存在于人體各臟器中，其中以肝臟含量最高。臨床研究表明，當(dāng)肝系統(tǒng)受到惡性腫瘤細(xì)胞刺激時(shí)，AKP水平增加[25]。通過檢測肝組織抗氧化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)TG可以緩解小鼠肝臟氧化損傷程度，改善肝臟抗氧化功能，減輕肝癌小鼠肝臟病變程度，從而起到抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長的作用。阻止腫瘤細(xì)胞侵害肝臟，為肉蓯蓉作為輔助治療或中醫(yī)治療藥物在肝癌臨床應(yīng)用上提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

有大量臨床數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)研究表明，許多癌癥患者均有免疫功能低下的癥狀，首先是細(xì)胞免疫功能較低，在腫瘤生長過程中，體液免疫也在慢慢降低。有研究報(bào)道，肉蓯蓉及其活性成分可以緩解化療藥物對免疫細(xì)胞造成的損傷，改善機(jī)體免疫功能[26-27]。此外，肉蓯蓉多糖能夠促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖并釋放Ca2＋，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋的升高能夠促進(jìn)免疫因子的表達(dá)，循環(huán)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖[28]。本實(shí)驗(yàn)表明肉蓯蓉可以成為化學(xué)藥物治療中解決免疫能力低下的方法之一。

研究報(bào)道肝細(xì)胞癌患者在門靜脈和糞便樣本中的亞油酸和苯酚水平低于健康對照組，亞油酸和苯酚可顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，表明代謝物在肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[29]。研究發(fā)現(xiàn)茴香霉素激活p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通過介導(dǎo)H3S10磷酸化促進(jìn)HCC細(xì)胞的鐵死亡[30]。伊馬替尼可能通過miR-124和STAT3/HLF/IL-6通路發(fā)揮其抗肝纖維化活性[31]。巨大戟醇可減輕肝和胃腸道損傷，減少腹水體積，加劇H22細(xì)胞凋亡程度，改善異常的促炎細(xì)胞因子[32]。Nair等[33]發(fā)現(xiàn)拉貝洛爾與細(xì)胞分裂周期因子20表現(xiàn)出顯著的相互作用，可作為一種潛在的抗肝癌靶向藥物。原海蔥苷A對多種HCC細(xì)胞系具有很強(qiáng)的抗癌作用，可顯著抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與細(xì)胞凋亡、線粒體損傷、自噬密切相關(guān)，且對MHCC97H異種移植裸鼠中HCC細(xì)胞也有明顯的抑制作用[34]。本研究結(jié)果顯示，肉蓯蓉可通過調(diào)節(jié)代謝物水平抑制肝癌的發(fā)展。此外，負(fù)離子模式下，D組中正纈氨酸較A組升高，水楊酸較A組降低，這與肉蓯蓉多糖緩解腸道微生物失調(diào)相關(guān)患者的學(xué)習(xí)和記憶障礙結(jié)果[35]一致。

研究發(fā)現(xiàn)，卟啉單胞菌屬會產(chǎn)生纖維化介質(zhì)（例如轉(zhuǎn)化生長因子-β1），加劇非酒精性脂肪型肝炎的纖維化[36]。D組中較A組卟啉單胞菌屬相對豐度低，表明TG可以緩解肝纖維化，從而抑制肝癌的發(fā)生。此外，一項(xiàng)研究中提到Tyzzerella_3可作為預(yù)測胃癌的潛在標(biāo)志物[37]，由此推測模型組可能已經(jīng)發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移情況，后續(xù)需要進(jìn)一步研究探討。TG可以改善丁酸球菌屬相對豐度，這與Mu Hongna等[38]研究柚皮苷減輕高脂肪飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病結(jié)果一致。表明TG可通過改善腸道微生物組成，減輕肝細(xì)胞持續(xù)損傷，抑制肝炎的發(fā)生，并在肝損傷后及時(shí)進(jìn)行肝修復(fù)，在肝癌未發(fā)生時(shí)起到預(yù)防干預(yù)作用。

綜上，肉蓯蓉作為食藥同源物質(zhì)，富含營養(yǎng)價(jià)值和功能成分，可改善機(jī)體免疫能力，抑制腫瘤生長代謝，阻止腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)機(jī)體代謝水平，改善機(jī)體腸道微生物組成等，表現(xiàn)出一定的抗肝癌作用。本實(shí)驗(yàn)關(guān)于TG抗HepG2肝癌效應(yīng)的相關(guān)研究可以為肉蓯蓉的后期開發(fā)利用和推廣提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。