共包埋姜黃素和還原型谷胱甘肽的納米脂質(zhì)體的制備、修飾與表征

于少軒，逄格雨，張子豪，李世陽，徐 碩，肖海芳，朱蘭蘭，宋元達(dá)

（山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000）

脂質(zhì)體是由磷脂（磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿等）及其他組分如膽固醇和親水性聚合物共軛脂質(zhì)形成的雙層封閉球形囊泡[1]。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，脂質(zhì)體的制備工藝不斷完善，被廣泛研究和應(yīng)用[2-3]。親脂性差異很大的藥物可以同時(shí)封裝在脂質(zhì)體中，根據(jù)藥物的溶解性，既可以封裝在磷脂雙分子層中，也可以截留在水中，還可以封裝在雙層界面處[1,4]。近年來，兩種或多種藥物的聯(lián)合使用因具有減少每種藥物的個(gè)體攝入量和提高其協(xié)同效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，引起人們的廣泛關(guān)注[5-6]。研究表明，當(dāng)兩種藥物被同一個(gè)載體遞送到細(xì)胞或動物體內(nèi)時(shí)，可以通過逐步暴露和吸收，提高其穩(wěn)定性、生物利用率和治療效果[7-8]。例如，Zhang Chuanmin等[7]制備用于聯(lián)合遞送生存素siRNA和紫杉醇的陽離子脂質(zhì)體，并通過其在肺癌中的協(xié)同作用，降低紫杉醇的劑量，增強(qiáng)抗腫瘤療效。Zhang Lu等[8]設(shè)計(jì)并合成一種具有順序釋放特性的納米脂質(zhì)體（nanoliposomes，LIP），可同時(shí)遞送地塞米松和多烯紫杉醇，以調(diào)節(jié)腫瘤基質(zhì)，并協(xié)同殺死腫瘤細(xì)胞；因?yàn)榈厝姿膳c膽固醇結(jié)構(gòu)相似，可能與膽固醇一樣被包裹在磷脂層中，而多烯紫杉醇由于其較強(qiáng)的疏水性被包裹在兩層磷脂層之間。

姜黃素（curcumin，CUR）被認(rèn)為是姜黃制劑中最活躍的成分，具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂和預(yù)防老年癡呆等多種生理功能，還可作為天然著色劑、防腐劑等用于食品加工[9]。還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸組成的三肽，其分子結(jié)構(gòu)中含有γ-谷氨?；汀猄H兩種活性基團(tuán)，在生物體內(nèi)廣泛存在且具有多種重要的生理功能，如抗氧化、解毒、消除疲勞、延緩衰老、預(yù)防糖尿病和癌癥以及參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)和糖代謝等[10-11]。盧均坤等[12]發(fā)現(xiàn)CUR和GSH聯(lián)合使用對阿霉素所致大鼠急性心肌損傷具有保護(hù)作用，能夠抑制心肌細(xì)胞變性及線粒體損傷。雖然CUR和GSH都具有優(yōu)異的生物活性，在膳食補(bǔ)充中具有重要作用，但它們穩(wěn)定性差，易受溫度、氧氣、光照、金屬離子、pH值等環(huán)境因素的影響，同時(shí)代謝速度快、生物利用率低，而且CUR的水溶性很差[13]。因此，CUR和GSH在食品、保健品和藥品中的應(yīng)用受到很大限制。通過合理的遞送載體設(shè)計(jì)，將CUR和GSH同時(shí)包埋到一種納米顆粒中，并實(shí)現(xiàn)足夠的裝載能力，可能是同時(shí)提高二者穩(wěn)定性和協(xié)同作用的可行思路。然而，脂質(zhì)體作為載體材料存在包埋率較低、穩(wěn)定性差、顆粒易融合或絮凝、藥物易泄漏等問題，通過與其他化合物結(jié)合可以提高脂質(zhì)體的包埋率和穩(wěn)定性[14-15]。最近，本團(tuán)隊(duì)通過靜電層層自組裝技術(shù)在包埋GSH的脂質(zhì)體表面依次修飾殼聚糖（chitosan，CH）和海藻酸鈉（sodium alginate，AL），制備出雙層多糖修飾的LIP[11,16]；與未修飾的脂質(zhì)體相比，CH單層修飾和AL-CH雙層修飾都可以明顯增加GSH的包埋率，增強(qiáng)脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性，減緩其在模擬腸消化液中的崩解，起到緩釋GSH的作用。

本研究制備同時(shí)包埋CUR和GSH的納米脂質(zhì)體（curcumin-glutathione nanoliposomes，CGLIP），將CH和AL逐層結(jié)合到LIP表面得到多糖修飾的CGLIP（ALCH-CGLIP），并通過各種光譜學(xué)手段和電子顯微鏡對LIP的包埋率、緩釋作用、粒徑、表面電位、微觀形貌、化學(xué)組成、熱穩(wěn)定性等進(jìn)行表征，考察LIP作為CUR和GSH協(xié)同傳遞載體的潛力，以期為同時(shí)添加CUR和GSH或其他生物活性物質(zhì)的新型功能食品或藥品開發(fā)提供一定的理論參考和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆卵磷脂、谷胱甘肽 上海麥克林生化科技股份有限公司；膽固醇（分析純）北京索萊寶科技有限公司；吐溫-80、殼聚糖、膽鹽（分析純）、海藻酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；CUR標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；L530型水平離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Centrifuge 5810R型高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；RG-18型磁力攪拌器 河南金博儀器制造有限公司；KYC-100B恒溫培養(yǎng)搖床 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì)、IRAffinity-1S型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 日本島津公司；FreeZone?6 L冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；JY99-IIDN超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer Nano ZS90納米粒度分析儀 英國馬爾文帕納科公司；H-9500透射電子顯微鏡 日本日立公司；DSC-Q2000型差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 不同LIP的制備

參考前期工作并適當(dāng)修改后，通過薄膜水合法結(jié)合超聲技術(shù)制備不同負(fù)載的LIP[16-17]。準(zhǔn)確稱取250 mg大豆卵磷脂和25 mg膽固醇于燒杯中，加入25 mL無水乙醇，40 ℃攪拌直至完全溶解。制備包埋CUR的LIP時(shí)，稱取4 mg CUR加入上述混合溶液中，在40 ℃、避光條件下繼續(xù)攪拌，直到CUR全部溶解。將混合溶液全部轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，用10 mL乙醇分次洗滌燒杯，將洗液倒入圓底燒瓶中，在40 ℃、-0.1 MPa條件下旋蒸。待乙醇完全除去，燒瓶內(nèi)壁形成均勻的薄膜，加入20 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.05 mol/L、pH 6）或者含有4 mg/mL GSH的PBS，在40 ℃、常壓條件下旋轉(zhuǎn)水合30 min，使燒杯內(nèi)壁的薄膜洗脫。將燒瓶中的洗脫液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，并在冰浴中通過超聲波細(xì)胞破碎儀超聲10 min（250 W，工作3 s、間隔3 s）。將經(jīng)超聲處理的溶液在4 ℃靜置2 h，然后以4 ℃、3 000 r/min離心10 min，上清液即為制得的LIP。分別制備空LIP（BLIP）、單包埋CUR的LIP（CLIP）、單包埋GSH的LIP（GLIP）和共包埋CUR和GSH的LIP（CGLIP），并將所有LIP樣品在4 ℃、避光條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 LIP的多糖修飾

對BLIP、CLIP、GLIP和CGLIP 4 種LIP分別進(jìn)行CH修飾和CH-AL修飾。脂質(zhì)體的CH修飾：稱取100 mg CH，加入100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的冰醋酸溶液，攪拌至完全溶解后，用1 mol/L的氫氧化鈉溶液將CH溶液的pH值調(diào)至5.5，用0.45 μm水相過濾器過濾。分別取20 mL BLIP、CLIP、GLIP和CGLIP樣品溶液，在100 r/min的攪拌條件下將樣品溶液按體積比1∶1逐滴滴加到CH溶液中，靜置1 h，得到CH修飾的脂質(zhì)體，分別記為CHBLIP、CH-CLIP、CH-GLIP和CH-CGLIP。脂質(zhì)體的CH-AL修飾：稱取100 mg AL，加入100 mL蒸餾水，攪拌至完全溶解后，用5 mol/L的鹽酸溶液將AL溶液的pH值調(diào)至5.5，用0.45 μm水相過濾器過濾。分別取20 mL CHBLIP、CH-CLIP、CH-GLIP和CH-CGLIP溶液，在100 r/min的攪拌條件下按體積比1∶1逐滴滴加到AL溶液中，靜置1 h，得到CH-AL修飾的脂質(zhì)體，分別記為AL-CHBLIP、AL-CH-CLIP、AL-CH-GLIP和AL-CH-CGLIP。將修飾后的LIP也置于4 ℃、避光條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 測定CUR和GSH的包埋率

1.3.3.1 繪制CUR和GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線

以無水乙醇為溶劑，制備不同質(zhì)量濃度的（1.25、2.5、5、10、20 μg/mL）CUR溶液，各取200 μL于96 孔板中測吸光度，并繪制CUR的標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。另外，根據(jù)GSH檢測試劑盒的方法繪制GSH的標(biāo)準(zhǔn)曲線。CUR和GSH的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y＝0.064 237 5＋0.005 127X（R2＝0.999）和Y＝0.096 41＋0.001 85X（R2＝0.999）。

1.3.3.2 測定CUR和GSH的包埋率

萃取步驟：收集制備LIP時(shí)在離心過程中產(chǎn)生的沉淀（1.3.1節(jié)），加水分散并定容為10 mL，取1 mL沉淀溶液加等體積氯仿，劇烈振蕩混合2 min后，將溶液靜置分層，分別收集上層水溶液（可能含有GSH）和下層氯仿溶液（可能含有CUR）。重復(fù)上述萃取步驟，直到氯仿溶液無色為止。將每次萃取的下層氯仿溶液合并，用氮吹儀將氯仿吹干，加入200 μL無水乙醇將離心管壁上的殘留物質(zhì)充分溶解。

用酶標(biāo)儀在424 nm波長處測定溶液的吸光度[18]。同時(shí)，合并每次萃取的上層溶液，取200 μL合并溶液，加入到96 孔板中，根據(jù)GSH檢測試劑盒說明書測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算沉淀中殘留CUR和GSH的質(zhì)量。

取100 μL待測脂質(zhì)體，加400 μL PBS稀釋后，轉(zhuǎn)移到Millipore超濾管（截留分子質(zhì)量為100 kDa）中，4 ℃、5 000 r/min離心10 min。向過濾器中加入500 μL PBS，將濃縮的樣品重新分散后再次離心10 min。經(jīng)過分離和洗滌后，游離的CUR和GSH在收集管中回收，而包埋CUR和/或GSH的脂質(zhì)體則被截留在過濾器中。將收集管中的溶液全部取出，用PBS定容至2 mL，加入等體積的氯仿，按照上述萃取步驟將溶液中的CUR萃取出來，使其與GSH分開。使用酶標(biāo)儀測定CUR和GSH的吸光度，計(jì)算溶液中CUR和GSH的質(zhì)量，最后按照式（1）計(jì)算CUR和GSH的包埋率：

式中：mtotal為制備脂質(zhì)體時(shí)加入總CUR或GSH的質(zhì)量/mg；mfree為計(jì)算出沉淀和收集液中游離CUR或GSH的質(zhì)量/mg。

為了進(jìn)一步確定脂質(zhì)體中CUR和/或GSH的含量，過濾器中的脂質(zhì)體通過反向旋轉(zhuǎn)的方法被重新回收，并通過萃取的方法測定了脂質(zhì)體包埋CUR和/或GSH的量[19]。具體步驟：在截留管中加入500 μL PBS將濃縮的脂質(zhì)體重新溶解，然后將倒置的過濾器置于干凈的收集管中并以5 000 r/min離心10 min，將收集管中的液體全部取出，用PBS定容至2 mL，加入等體積的氯仿，按照上述萃取法將脂質(zhì)體中的CUR和GSH分離。測定CUR和GSH的質(zhì)量，按照式（2）計(jì)算CUR和GSH的包埋率：

式中：me為脂質(zhì)體中CUR或GSH的質(zhì)量/mg。

1.3.4 測定CUR和GSH的體外釋放率

采用透析法對CLIP、AL-CH-CLIP、GLIP、AL-CHGLIP、CGLIP和AL-CH-CGLIP在體外釋放CUR或/和GSH的能力進(jìn)行測定[20]。分別取2 mL不同樣品溶液于截留分子質(zhì)量為3.6 kDa的透析袋中，將透析袋浸沒于50 mL含體積分?jǐn)?shù)2%吐溫-80的PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）后，在37 ℃的恒溫?fù)u床（100 r/min）中透析72 h。分別在0、3、6、12、24、48、72 h取5 mL透析液于15 mL離心管中，并向燒杯中補(bǔ)加5 mL新鮮的透析液，即含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%吐溫-80的PBS。在取出的透析液中加入等體積的氯仿，按照1.3.3節(jié)中描述的方法分離透析液中的CUR和GSH。測定透析液CUR和GSH的吸光度，計(jì)算透析液中二者的質(zhì)量。根據(jù)式（3）計(jì)算CUR或/和GSH在不同時(shí)間點(diǎn)的體外釋放率：

式中：mi為i時(shí)間點(diǎn)透析液中累積釋放CUR或GSH的質(zhì)量/mg。

1.3.5 粒徑、多分散系數(shù)（polymer dispersity index，PDI）和Zeta電位測定

分別取BLIP、CH-BLIP、AL-CH-BLIP、CLIP、CHCLIP、AL-CH-CLIP、GLIP、CH-GLIP、AL-CH-GLIP和CGLIP、CH-CGLIP、AL-CH-CGLIP樣品溶液1 mL，加入9 mL超純水稀釋后，測量各個(gè)脂質(zhì)體樣品的平均粒徑、PDI和Zeta電位。測量時(shí)將折射率設(shè)置為1.330，吸收率設(shè)置為0.001，且每個(gè)樣品溶液循環(huán)測定10 次。

1.3.6 不同LIP的微觀形貌表征

采用負(fù)染法對CGLIP、CH-CGLIP和AL-CH-CGLIP的形貌進(jìn)行表征[11]。將銅網(wǎng)格先放置在樣品溶液的液滴上4 min，然后用2%的磷鎢酸溶液染色4 min，用濾紙除去多余的液體后，在室溫下風(fēng)干。最后，在120 kV電壓下用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察銅網(wǎng)。

1.3.7 FTIR表征

通過壓片法對樣品進(jìn)行表征[21]。取CUR標(biāo)準(zhǔn)品、GSH、CH、AL、凍干的CGLIP、凍干的CH-CGLIP和凍干的AL-CHCGLIP樣品各2 mg，將樣品與適量的溴化鉀混合研磨成均勻粉狀，然后將粉末壓制成透明薄片，在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)對樣品進(jìn)行掃描，測定樣品的透光率。

1.3.8 熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）

分別取10 mg凍干的CGLIP和AL-CH-CGLIP樣品進(jìn)行TGA，比較二者的熱穩(wěn)定性。溫度范圍為20～800 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氣體環(huán)境為氮?dú)狻?/p>

1.3.9 差示掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）分析

采用DSC儀進(jìn)一步對CGLIP和AL-CH-CGLIP的熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較[11]。分別稱取10 mg凍干的CGLIP樣品和AL-CH-CGLIP樣品于鋁皿中，加蓋密封后，鋁皿在DSC中以10 ℃/min的速率從20 ℃加熱到140 ℃。同時(shí)，加熱一個(gè)密封的空鋁皿，作為參比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 9 種LIP樣品中CUR和GSH的包埋率

包埋率是評價(jià)LIP載藥能力的重要指標(biāo)之一。因?yàn)槌恋砗褪占転V液均未檢測出CUR，而氯仿萃取的脂質(zhì)體中CUR的量與制備時(shí)CUR的添加量基本一致，所以本研究得到的CUR包埋率為100%（圖1A）。另外，過濾器倒置后反向旋轉(zhuǎn)測定的結(jié)果與該結(jié)果一致。同時(shí)，與GSH共包埋對CUR的包埋率也沒有產(chǎn)生顯著影響（圖1B），這可能是因?yàn)樵谥苽鋯伟窈凸舶竦腖IP時(shí)所添加的4 mg CUR均被包埋進(jìn)了脂質(zhì)體中或嵌入吸附在磷脂雙分子層上[22]。與已有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果（41%～90%）[23-25]相比，本研究中CUR的包埋率略高，產(chǎn)生差異的原因可能是磷脂的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)不同，或是CUR與脂質(zhì)體主要成分如大豆卵磷脂和膽固醇的質(zhì)量比不同。經(jīng)測定，單層CH修飾和雙層AL-CH修飾后，脂質(zhì)體中CUR的包埋率沒有顯著差異，依然接近100%（圖1A、B）。

圖1 CUR和GSH在9 種LIP中的包埋率Fig.1 Encapsulation efficiency of CUR and GSH in nine LIPs

與CUR相似，兩種方法測定的GSH包埋率也基本一致。然而，與CUR共包埋以及多糖修飾對GSH在脂質(zhì)體中的包埋率產(chǎn)生了顯著影響。由圖1C、D可以看出，隨著多糖修飾層數(shù)的增多，脂質(zhì)體對GSH的包埋率逐漸增大（P＜0.05）。在單包埋GSH的脂質(zhì)體中，GSH的包埋率先從7.90%（GLIP）增加到16.72%（CH-GLIP），再增加到37.52%（AL-CH-GLIP）。類似地，在CURGSH共包埋的脂質(zhì)體中，GSH的包埋率先從27.03%（CGLIP）增加到了32.09%（CH-CGLIP），再增加到了41.22%（AL-CH-CGLIP）。脂質(zhì)體對GSH的包埋率在兩種體系中均顯著增加的原因可能有兩個(gè)：一是CH與AL在層層自組裝到脂質(zhì)體表面的過程中將溶液中部分游離的GSH一起包埋進(jìn)去；二是經(jīng)多糖修飾后脂質(zhì)體更加穩(wěn)定，減少了洗滌純化過程中GSH的損失[26]。在CUR和GSH共包埋時(shí)，未修飾、CH單層修飾和AL-CH雙層修飾的脂質(zhì)體中GSH的包埋率均高于單包埋GSH脂質(zhì)體，分別為單包埋GSH脂質(zhì)體的4、2 倍和1.2 倍左右。因此，脂質(zhì)體同時(shí)包埋疏水性CUR和親水性物質(zhì)也許可以提高其對親水性物質(zhì)的包埋能力，且該現(xiàn)象可以通過CUR對磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的影響解釋。研究表明，CUR能夠以跨雙分子層的方向插入脂質(zhì)雙分子層深處，并通過與脂質(zhì)的磷酸基團(tuán)形成氫鍵固定[27]，而CUR的插入可以使脂質(zhì)體的?；渽^(qū)域緊致，使脂質(zhì)體膜的通透性降低，減少GSH在制備、離心、洗滌等過程中泄漏[28]。另外，多糖修飾對GSH包埋率的影響可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于與CUR共包埋對GSH包埋率的影響，所以AL-CH-CGLIP與AL-CH-GLIP對GSH的包埋率相差不大。

2.2 平均粒徑、PDI和Zeta電位分析

雖然脂質(zhì)體具有生物相容性好、能同時(shí)包埋疏水性和親水性物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，但是脂質(zhì)體的穩(wěn)定性差，顆粒之間容易黏結(jié)，從而產(chǎn)生粒徑變大、絮凝、內(nèi)容物泄漏等問題，而脂質(zhì)體是否會出現(xiàn)上述問題與其粒徑大小、粒徑分布及Zeta電位等膠體性質(zhì)緊密相關(guān)[22]。脂質(zhì)體粒徑的大小影響其分散和通透性，當(dāng)PDI小于0.3時(shí)，通常認(rèn)為體系具有較好的分散性[11]。另外，無論脂質(zhì)體帶正電荷還是負(fù)電荷，脂質(zhì)體帶電荷的絕對值越大，其穩(wěn)定性越強(qiáng)，泄漏率越低[18]。

由圖2、3可知，BLIP、CLIP、GLIP和CGLIP的平均粒徑分別為（95.02±1.93）、（87.30±0.91）、（117.77±1.00）nm和（132.47±18.14）nm，PDI分別為0.200±0.023、0.146±0.007、0.184±0.008和0.317±0.011，Zeta電位分別為（-22.47±1.96）、（-24.80±0.29）、（-15.67±0.67）mV 和（-14.70±0.46）mV。4 種LIP溶液的PDI均較?。ㄐ∮?.35），說明它們的粒徑大小都比較均勻[22]。與BLIP相比，CLIP的平均粒徑減小了7.7 nm，而Zeta電位沒有明顯變化。CUR分子的高共軛結(jié)構(gòu)使其具有較強(qiáng)親脂性，在大豆卵磷脂形成雙分子層過程中，CUR可能深深插入到雙分子層內(nèi)部，誘導(dǎo)脂質(zhì)體的?；渽^(qū)域更加緊致，而不是吸附在脂質(zhì)體表面，導(dǎo)致CLIP粒徑略微減小而表面電荷沒有發(fā)生明顯變化[28]。相反地，GLIP的平均粒徑增加了約13 nm，Zeta電位增加了約7 mV，表明GSH被包埋進(jìn)脂質(zhì)體水相空腔，且可能有部分GSH吸附在脂質(zhì)體表面。GSH溶解于pH 6的PBS中，pH值接近于GSH的等電點(diǎn)（5.93），GSH本身僅帶有微弱的負(fù)電荷，因此，GSH除了被包埋進(jìn)脂質(zhì)體內(nèi)部的水相空腔，還可能通過氨基與磷酸根之間形成氫鍵或范德華力等分子間相互作用吸附在脂質(zhì)體表面，這個(gè)推論可以由FTIR分析結(jié)果證實(shí)。與BLIP相比，CGLIP平均粒徑增加了37.45 nm，Zeta電位增加了約8 mV，這可能是因?yàn)镚SH與CUR共包埋時(shí)，更多GSH被包埋進(jìn)了脂質(zhì)體內(nèi)，且也有部分GSH吸附在脂質(zhì)體表面，與前面包埋率分析的結(jié)果一致。類似地，梁曉飛等[29]報(bào)道殼聚糖季銨鹽乙醇脂質(zhì)體共載長春新堿和消炎痛后，脂質(zhì)體的粒徑和Zeta電位也略有增加。

圖2 12 種LIP的平均粒徑及PDIFig.2 Average particle sizes and PDI of 12 LIPs

圖3 12 種LIP的Zeta電位Fig.3 Zeta potentials of 12 LIPs

經(jīng)CH單層修飾后，CH-BLIP、CH-CLIP、CH-GLIP和CH-CGLIP的平均粒徑分別為（116.37±4.80）、（115.93±1.60）、（123.33±1 8.04）nm 和（151.90±1.80）nm，Zeta電位分別為（0.77±1.08）、（5.98±0.36）、（7.49±0.49）mV和（9.00±0.68）mV；經(jīng)AL-CH 雙層修飾后，AL-CH-BLIP、AL-CH-CLIP、AL-CH-GLIP和AL-CH-CGLIP的平均粒徑分別為（133.23±16.26）、（130.50±1.93）、（149.87±12.25）nm和（161.97±5.58）nm，Zeta電位分別為（-43.93±2.08）、（-39.07±1.64）、（-38.23±2.41）mV和（-40.87±1.79）mV。因此，脂質(zhì)體的Zeta電位經(jīng)多糖修飾后先由負(fù)變?yōu)檎?，再由正變?yōu)樨?fù)，這說明CH和AL通過靜電相互作用依次自組裝到脂質(zhì)體的表面。該結(jié)果與本課題組之前報(bào)道的結(jié)果[11,16]一致。另一方面，隨著多糖修飾層數(shù)的增多，脂質(zhì)體的粒徑逐漸增大（P＜0.05），PDI也明顯增大，特別是經(jīng)CH修飾后，脂質(zhì)體的最大PDI約為0.9，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)脂質(zhì)體Zeta電位的絕對值最小，導(dǎo)致其穩(wěn)定性最差，顆粒之間容易發(fā)生交聯(lián)，使得粒徑分布不均勻。雖然LIP粒徑分布的均勻程度減弱，但該結(jié)果再次證明CH和AL修飾到了脂質(zhì)體表面，而且相比于CH單層修飾的脂質(zhì)體，AL-CH雙層修飾的脂質(zhì)體具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性。這與朱雨晴等[21]的研究結(jié)果相似。

2.3 不同LIP對CUR和/或GSH的體外釋放率

如圖4所示，所有類型的納米脂質(zhì)體都具有緩慢釋放CUR或/和GSH的作用。但是經(jīng)AL-CH雙層修飾后，納米脂質(zhì)體對CUR和GSH的釋放率更小，具有更好的緩釋作用。透析72 h后，AL-CH-CLIP和CLIP對CUR的釋放率分別為8.4%和14.6%，AL-CH-GLIP和GLIP對GSH的釋放率分別為32.7%和51.2%，AL-CH-CGLIP和CGLIP對CUR的釋放率分別為9.1%和13.4%，對GSH的釋放率分別為30.6%和31.4%。因此，AL-CH雙層修飾的納米脂質(zhì)體對CUR和GSH的緩釋作用優(yōu)于未經(jīng)修飾的納米脂質(zhì)體。這可能是AL、CH和磷脂膜兩兩之間具有較強(qiáng)的靜電相互作用，增加了脂質(zhì)體納米顆粒的膠體穩(wěn)定性，從而減緩了CUR和GSH的釋放速率。這與Yu Shaoxuan[11]和朱雨晴[21]等的研究結(jié)果一致。與CUR或GSH單包埋的納米脂質(zhì)體相比，當(dāng)CUR和GSH共包埋時(shí)，納米脂質(zhì)體對CUR的釋放率沒有顯著影響，但GSH的釋放率減小了。這可能是因?yàn)镃UR的嵌入能夠增加磷脂雙分子層碳?xì)滏湺逊e的有序性和剛性，提高納米脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。另外，AL-CHGLIP在前6 h對GSH的釋放率高于GLIP，AL-CH-CGLIP在前12 h對GSH的釋放率高于CGLIP，可能是由多糖復(fù)合到脂質(zhì)體表面的過程中包埋的GSH引起。這部分GSH吸附在脂質(zhì)體表面，很容易被釋放，而包裹在脂質(zhì)體內(nèi)部的GSH比較難釋放[11]。

圖4 6 種納米脂質(zhì)體在體外緩慢釋放CUR（A、C）和/或GSH（B、D）的能力Fig.4 In vitro sustained release capacity of CUR (A and C) and/or GSH (B and D) loaded in six LIPs

2.4 不同納米脂質(zhì)體的微觀形貌

如圖5A所示，CGLIP是規(guī)則的球形顆粒，很好地分散在觀察視野中，核為中空、殼為白色明亮的雙分子層，粒徑在40～100 nm范圍內(nèi)變化[18]。CH-CGLIP也是比較規(guī)則的球形顆粒（圖5B），粒徑分布在75～155 nm范圍內(nèi)。但是CH-CGLIP顆粒之間有比較明顯的聚集，這可能與其表面電荷的含量相對較少有關(guān)，與前面Zeta電位和PDI測定的結(jié)果相印證。而且CH-CGLIP周圍有強(qiáng)烈的染色痕跡，這可能是磷鎢酸與帶正電的CH離子結(jié)合引起。磷鎢酸是一種陰離子染色劑，可與脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中帶正電荷的部分結(jié)合[11]。而AL-CH-CGLIP的形狀變得不規(guī)則（圖5C），粒徑分布在90～180 nm之間。相對于CGLIP，CH-CGLIP和AL-CH-CGLIP的粒徑明顯增大，與粒度分析儀的測定結(jié)果一致。

圖5 CGLIP（A）、CH-CGLIP（B）和AL-CH-CGLIP（C）的TEMFig.5 TEM micrographs of CGLIP (A),CH-CGLIP (B) and AL-CH-CGLIP (C)

2.5 納米脂質(zhì)體的組成及其相互作用

磷脂的存在可以通過以下幾個(gè)官能團(tuán)特征峰的出現(xiàn)進(jìn)行表征：位于3 000～2 800 cm-1范圍內(nèi)的由于丙烯鏈對稱和不對稱CH2伸縮振動產(chǎn)生的特征峰，位于1 765～1 720 cm-1之間的由于C＝O伸縮振動產(chǎn)生的特征峰，位于1 200～1 145 cm-1之間的由于P＝O對稱振動產(chǎn)生的特征峰，以及位于1 145～970 cm-1范圍內(nèi)由于P—O—C對稱振動產(chǎn)生的特征峰[16,25,28]。如圖6所示，在CGLIP的光譜中，CH2的對稱和不對稱伸縮振動特征峰出現(xiàn)在2 926 cm-1和2 855 cm-1處，C＝O的伸縮振動特征峰出現(xiàn)在1 741 cm-1處，但是P＝O的對稱振動特征峰出現(xiàn)在1 245 cm-1處，發(fā)生了藍(lán)移，這可能是因?yàn)镃UR和GSH的存在導(dǎo)致。但CUR的很多特征峰在CGLIP的光譜中沒有出現(xiàn)，如酚羥基伸縮振動的特征峰（3 515 cm-1處）、C＝C環(huán)和C＝O振動重疊產(chǎn)生的特征峰（1 508 cm-1處）以及烯醇結(jié)構(gòu)中C—O振動產(chǎn)生的特征峰（1 270 cm-1處）等，而位于1 185、1 119、1 154 cm-1和1 026 cm-1處的特征峰強(qiáng)度也明顯減小，表明CUR主要被包埋進(jìn)脂質(zhì)體雙分子層中，有極少游離的CUR可能吸附在脂質(zhì)體表面[30]。GSH的很多特征峰（如位于2 522、1 710、1 555、811 cm-1處分別由硫醇基團(tuán)中S—H伸縮振動、羧基中C＝O伸縮振動、仲酰胺基團(tuán)C—N伸縮振動和C—S伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰）在CGLIP的光譜中也沒有觀察到，但出現(xiàn)了位于3 400到2 700 cm-1處由于O—H和N—H的伸縮振動及其重疊產(chǎn)生的多重吸收峰，強(qiáng)度明顯減弱，表明GSH主要被包埋在脂質(zhì)體內(nèi)部，部分游離的GSH可能吸附在脂質(zhì)體表面[31]。對比CH-CGLIP、ALCH-CGLIP和CGLIP的光譜，可以發(fā)現(xiàn)大豆卵磷脂的丙烯鏈對稱和不對稱CH2伸縮振動產(chǎn)生的特征峰和P＝O對稱振動產(chǎn)生的特征峰位置基本保持不變，但峰強(qiáng)度明顯減小，初步證明CH和AL覆蓋在脂質(zhì)體的表面。另外，在CH-CGLIP的光譜中觀察到CH的特征峰酰胺I帶（1 656 cm-1處），且該峰的位置發(fā)生輕微的偏移[32]。結(jié)合前面磷酸基團(tuán)特征峰的偏移和強(qiáng)度變換，進(jìn)一步證明CH通過靜電相互作用成功修飾在脂質(zhì)體表面。CH位于1 255 cm-1處代表C—O的特征峰在CH-CGLIP中沒有出現(xiàn)，且3 500 cm-1處的特征峰發(fā)生了紅移，表明CH還可能通過分子間氫鍵的形成與脂質(zhì)體的磷脂結(jié)合[32]。然而，在AL-CH-CGLIP中，CH的酰胺I帶特征峰和AL的羧基特征峰（1 617 cm-1處）都沒有出現(xiàn)，表明AL主要通過靜電相互作用與CH結(jié)合，修飾在納米脂質(zhì)體上，與先前報(bào)道的結(jié)果[16,33]一致。

圖6 AL-CH-CGLIP、CH-CGLIP、CGLIP、CUR、GSH、CH和AL的FTIRFig.6 FTIR spectra of CGLIP,CH-CGLIP,AL-CH-CGLIP,CUR,GSH,CH,and AL

2.6 CGLIP和AL-CH-CGLIP的熱穩(wěn)定性

如圖7A所示，CGLIP和AL-CH-CGLIP的質(zhì)量損失大致分為3 個(gè)階段。在20～150 ℃范圍內(nèi)，CGLIP和ALCH-CGLIP的質(zhì)量損失率分別為4.62%和7.08%。因?yàn)樵谠摐囟确秶鷥?nèi)的質(zhì)量損失主要是由水分蒸發(fā)散失引起，所以結(jié)果表明AL-CH-CGLIP在加熱過程中散失的水分多于CGLIP散失的水分，這可能是因?yàn)锳L和CH分子結(jié)構(gòu)中存在的—OH、—COOH和—CONH等官能團(tuán)結(jié)合了較多水分[34]。在150～500 ℃范圍內(nèi)，CGLIP和AL-CH-CGLIP在質(zhì)量損失率分別為56.95%和52.02%，這主要是由納米脂質(zhì)體的主要成分卵磷脂、膽固醇、CUR、GSH、CH和AL分解造成，結(jié)果表明CGLIP在加熱過程中的分解程度略高于AL-CH-CGLIP[35-36]。在溫度高于500 ℃時(shí)，CGLIP和AL-CH-CGLIP均出現(xiàn)了緩慢的質(zhì)量損失，這是由樣品碳化導(dǎo)致?？傮w而言，CH-AL修飾的脂質(zhì)體在加熱過程中的質(zhì)量損失明顯低于未修飾的脂質(zhì)體，表明CH-AL雙層修飾可以在一定程度上增加脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性。

圖7 CGLIP和AL-CH-CGLIP的TGA（A）和DSC（B）分析圖譜Fig.7 TGA (A) and DSC (B) profiles of CGLIP and AL-CH-LIP

如圖7B所示。一般大分子物質(zhì)的DSC曲線不會出現(xiàn)尖銳的峰，只會出現(xiàn)緩慢而平滑的峰。CGLIP和ALCH-CGLIP的DSC曲線均出現(xiàn)一個(gè)寬的吸熱峰，峰值分別位于88.42 ℃和91.42 ℃。與之前報(bào)道的結(jié)果[11,25]相比，CGLIP吸熱峰出現(xiàn)的溫度稍高于空脂質(zhì)體和單包埋CUR的脂質(zhì)體，表明在該條件下CUR和GSH共包埋可能增加了納米脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性，這與侯麗芬等[36]研究結(jié)果相似。與CGLIP相比，AL-CH-CGLIP的吸熱峰向溫度升高方向發(fā)生了偏移，這表明AL-CH存在于AL-CH-CGLIP的外層，可以增強(qiáng)它們對溫度的抵抗力，與TGA的結(jié)果一致。另外，Liu Yujia等[25]也發(fā)現(xiàn)組裝在CUR脂質(zhì)體表面的CH在高溫條件下可以對脂質(zhì)體起到保護(hù)作用，減少CUR泄漏。

3 結(jié)論

本研究制備了同時(shí)包埋CUR和GSH的納米脂質(zhì)體，并通過靜電相互作用將CH和AL依次修飾到了納米脂質(zhì)體的表面，以增強(qiáng)納米脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，與GSH共包埋、CH單層修飾或AL-CH雙層修飾對CUR的包埋率均沒有顯著影響；但與CUR共包埋時(shí)，GSH的包埋率從7.90%（GLIP）增加到了27.03%（CGLIP），且經(jīng)多糖修飾后，GSH的包埋率進(jìn)一步增加到了32.09%（CH-CGLIP）和41.22%（AL-CH-CGLIP）。與BLIP、CLIP和GLIP相比，CGLIP的平均粒徑和Zeta電位略有增加；隨著多糖修飾層數(shù)的增多，脂質(zhì)體的平均粒徑也逐漸增大，但與CH單層修飾的脂質(zhì)體相比，AL-CH雙層修飾的脂質(zhì)體的Zeta電位絕對值更大，具有更高的分散穩(wěn)定性。在37 ℃振蕩孵育的條件下，CGLIP和AL-CH-LIP對CUR的釋放率都明顯高于對GSH的釋放率，而且ALCH-CGLIP對CUR和GSH的緩釋作用都優(yōu)于CGLIP。另外，AL-CH-CGLIP在加熱過程中的變性溫度略高于未修飾的脂質(zhì)體而質(zhì)量損失率明顯低于未修飾的脂質(zhì)體，表明AL-CH雙層修飾可以在一定程度上增加脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性。本研究闡明了CUR和GSH共包埋以及AL-CH雙層修飾對納米脂質(zhì)體的包埋率、緩釋作用和穩(wěn)定性的影響，可為同時(shí)包埋疏水性和親水性活性物質(zhì)的新型功能食品或藥品開發(fā)提供一定參考價(jià)值。