富含蛋白質(zhì)濃稠猴頭菌乳的流變學(xué)及體外消化分析

蘇翠馨，魏世杰，常明昌,2，馮翠萍,2，曹謹(jǐn)玲,3，云少君,3，徐麗婧,3，耿雪冉,3，程菲兒,3，孟俊龍,2,*，程艷芬,3,*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西省食用菌工程技術(shù)研究中心，山西 晉中 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西省黃土高原食用菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 晉中 030801）

猴頭菌（Hericium erinaceus，HE）又名猴頭菇、猴頭蘑等，隸屬于擔(dān)子門(mén)、傘菌綱、紅菇目、猴菇科、猴頭菌屬[1]，是一種藥食兩用菌，味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富[2]，含蛋白質(zhì)、多糖等生物活性物質(zhì)[3]。Wang Mingxing等[4]在研究HE對(duì)胃的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，HE多糖可以減少胃黏膜病變和胃潰瘍的發(fā)生。馬強(qiáng)等[5]在研究HE多糖分子質(zhì)量與養(yǎng)胃活性效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，HE子實(shí)體多糖分子質(zhì)量的降低有利于提高其抗炎活性，對(duì)胃黏膜細(xì)胞的損傷修復(fù)作用可以得到進(jìn)一步發(fā)揮。Vigna等[6]發(fā)現(xiàn)口服HE有助于緩解睡眠障礙。這些生理功效使HE成為食品深加工及保健食品研發(fā)的重要原料。

世界上約8%的人口受吞咽困難的影響，其中，老年患者約為13%～38%，其中以中度吞咽困難患者為主[7]。吞咽困難會(huì)影響食物攝取和營(yíng)養(yǎng)吸收，導(dǎo)致患者出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良等并發(fā)癥[8]，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致死亡[9]。吞咽困難患者會(huì)出現(xiàn)一些生理變化，咀嚼能力下降和神經(jīng)調(diào)節(jié)減慢，在吞咽食物時(shí)出現(xiàn)問(wèn)題，如舌頭遞送食物的力量下降、會(huì)厭關(guān)閉氣管的時(shí)間延遲[10]。吞咽困難還可能引起其他不良反應(yīng)，包括脫水、營(yíng)養(yǎng)不良和社交焦慮[11]。這一問(wèn)題的主要解決方法是通過(guò)添加增稠劑，制得呈蜂蜜狀的食物[12]，使吞咽更安全。增稠劑通常分為改性淀粉基和膠基兩類[13]，前者在過(guò)去廣泛使用，但后者因具有較好的適口性、質(zhì)地和感官特征，最近越來(lái)越受歡迎[14]。但最常見(jiàn)的商品食用膠基增稠劑主要為黃原膠（xanthan gums，XG）、κ-卡拉膠（kappa carrageenan，KC）和羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose，CMC），且來(lái)源不同[13]。增加蛋白質(zhì)的攝入量可減少肌肉減弱綜合癥（肌少癥）以及骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)生，這在老年人中很常見(jiàn)[15]。2018年國(guó)際肌少癥臨床實(shí)踐指南建議對(duì)肌少癥的老年人患者進(jìn)行蛋白質(zhì)補(bǔ)充或增添富含蛋白質(zhì)的飲食[16]。Li Chunlei等[17]研究表明補(bǔ)充乳清、大豆或乳清-大豆混合蛋白都可以保持老年人身體機(jī)能。Malafarina[18]和Helena[19]等研究表明蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑可以改善老年人的肌肉狀況。

本實(shí)驗(yàn)以HE為原料，添加兩種蛋白質(zhì)（乳清蛋白（whey protein，WP）或大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）），再分別添加3 種增稠劑（XG、KC或CMC）制備成富含蛋白質(zhì)濃稠HE乳，研究其流動(dòng)性和黏彈性以及體外消化特性。旨在為吞咽困難患者和老年人設(shè)計(jì)的食物提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

HE粉由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌團(tuán)隊(duì)提供；牛奶購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

WP 美國(guó)希爾瑪乳酪公司；SPI 臨沂山松生物制品有限公司；KC 滕州市香凝生物工程有限責(zé)任公司；XG 新疆梅花氨基酸有限公司；CMC 宜興通達(dá)化學(xué)有限公司；豬胃蛋白酶 美國(guó)Sigma公司；胰酶、膽汁酸鹽 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MCR102流變儀 安東帕（上海）商貿(mào)有限公司；64R高速冷凍臺(tái)式離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特（美國(guó)）股份有限公司；UV-1100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 富含蛋白質(zhì)濃稠HE乳的制備

HE粉與牛奶按照不同比例配制基礎(chǔ)HE乳（1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100（g/mL））。蒸煮3 min，混勻，由10 名男性和10 名女性根據(jù)HE乳的氣味和口味等特征進(jìn)行評(píng)分。將不同的蛋白質(zhì)（WP或SPI）添加到基礎(chǔ)HE乳中，通過(guò)凱氏定氮法[20]測(cè)得HE乳總蛋白質(zhì)量達(dá)到總質(zhì)量的10%以上。并分別向富含蛋白質(zhì)HE乳中添加KC、XG或CMC，然后將樣品攪拌均勻，并在4 ℃保存24 h。用流變儀測(cè)定表觀黏度（η）達(dá)到約蜂蜜狀（350～1 750 mPa·s）。將50 s-1的剪切速率作為評(píng)估表觀黏度確保安全吞咽的標(biāo)準(zhǔn)[21-22]。

1.3.2 HE乳流動(dòng)黏彈性的表征

用流變儀進(jìn)行測(cè)定，椎板PP 50、間隙1 mm、溫度37 ℃、剪切速率0.01～100 s-1，上樣后等待180 s，在幾何形狀的外部添加硅油防止樣品干燥。

1.3.2.1 穩(wěn)態(tài)流變實(shí)驗(yàn)

按照1.3.2節(jié)描述的方法，進(jìn)行樣品的穩(wěn)態(tài)流動(dòng)行為測(cè)定。

1.3.2.2 黏彈性測(cè)試

通過(guò)應(yīng)力掃描測(cè)試確定HE乳的線性黏彈性區(qū)域（linear viscoelastic region，LVR）。測(cè)試條件：剪切應(yīng)變范圍0.1%～100%，角頻率0.1～100 rad/s。在LVR內(nèi)，進(jìn)行頻率掃描測(cè)試，測(cè)定條件：間距1 mm；溫度37 ℃；上樣后等待180 s；頻率1 Hz；應(yīng)變1%；角頻率掃描范圍0.1～100 rad/s。溫度掃描測(cè)試：間距1 mm；上樣后等待180 s；頻率1 Hz；應(yīng)變1%；溫度掃描范圍15～80 ℃；掃描速率10 ℃/min。測(cè)定不同條件對(duì)HE乳的彈性模量（G′）、黏性模量（G″）、損耗系數(shù)（tanδ）、凝膠性能參數(shù)以及黏彈性參數(shù)的影響。

1.3.3 體外模擬唾液、胃和小腸消化

分別收集在2 h內(nèi)未進(jìn)食的健康的5 名男性和5 名女性的唾液，將新鮮唾液充分混勻，4 400×g離心10 min，取上清液，配制0.1 g/mL的HE乳溶液，將唾液上清液與HE乳充分混勻，37 ℃孵育4 h，沸水浴5 min，使唾液中的淀粉酶失活。

將10 mL唾液消化殘液與4.0 mL的人工模擬胃液混勻，調(diào)pH值至3.0，37 ℃孵育6 h。孵育完成后，取適量消化液，沸水浴5 min，收集備用。人工模擬胃液由3.6 mL的胃電解質(zhì)液（0.053 mol/L NaCl、0.15 mol/L KCl、0.001 mol/L CaCl2·2H2O和0.007 mol/L NaHCO3）和胃蛋白酶溶液（30 mg胃蛋白酶溶解于1 mL的1 mol/L CH3COONa中）組成。

將10 mL胃消化殘液與4.0 mL模擬小腸液混勻。調(diào)pH值至7.0，37 ℃孵育6 h。孵育完成后，取適量消化液，收集備用。模擬小腸液由2.0 mL小腸電解質(zhì)液（0.092 mol/L NaCl、0.009 mol/L KCl、0.002 mol/L CaCl2·2H2O）、1.0 mL胰酶溶液（1.25 g胰酶溶于5 mL蒸餾水）和1.0 mL膽汁鹽溶液（4 g膽汁酸鹽溶于100 mL蒸餾水）組成[23]。

1.3.3.1 消化HE乳的流動(dòng)流變行為分析

利用上述消化過(guò)程，按照1.3.2節(jié)方法，對(duì)消化樣品的流動(dòng)流變性能進(jìn)行測(cè)定，采用同軸圓筒（CP25/1°），測(cè)定η、流動(dòng)系數(shù)（n）、稠度系數(shù)（K）、決定系數(shù)（R2）等參數(shù)。在10 s-1時(shí)（剪切速率接近生理學(xué)報(bào)道的值[24]）測(cè)量η值。

1.3.3.2 HE乳蛋白質(zhì)消化率的測(cè)定

對(duì)消化前和模擬體外消化后獲得HE乳的蛋白質(zhì)消化率進(jìn)行評(píng)估。測(cè)定總可溶性蛋白含量（Bradford法）、可溶性肽含量（三氯乙酸法）和游離氨基酸含量（雙指示劑甲醛滴定法）。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果由SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，均數(shù)比較采用Tukey-Kramer HSD檢驗(yàn)。用不同字母表示結(jié)果有顯著差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 富含蛋白質(zhì)濃稠HE乳的制備

由圖1a所示，當(dāng)料液比為1∶60時(shí)，基礎(chǔ)HE乳的風(fēng)味評(píng)分最高，為90 分，HE具有淡淡的香味，無(wú)苦味。如圖1b所示，隨著蛋白質(zhì)添加量的增加，SPI和WP質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，其中對(duì)照組最低，分別為1.947 6%和2.611 6%，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)添加量為10%時(shí)，SPI和WP質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)25.986 8%和30.984 4%。按照膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量標(biāo)準(zhǔn)[25]，推薦65 歲及以上老年人蛋白質(zhì)攝入量為：男65 g/d，女55 g/d，故選用SPI和WP的添加量均為10%。

圖1 HE乳的制備Fig.1 Preparation conditions of HE incorporated milk

根據(jù)李敏等[12]研究糊狀飲食對(duì)中度吞咽障礙老年患者營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)及吞咽功能的影響表明，使食物的黏度達(dá)到蜂蜜狀（351～1 750 mPa·s）有助于中度吞咽困難的患者食用。樣品在37 ℃、剪切速率為50 s-1、表觀黏度為蜂蜜狀（351～1 750 mPa·s）時(shí)，確定增稠劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表1所示。

表1 HE乳增稠劑的含量及表觀黏度Table 1 Effect of thickener type and concentrations on apparent viscosity of HE incorporated milk

2.2 HE乳的流動(dòng)特性和黏彈性

2.2.1 HE的流動(dòng)特性

用流變儀測(cè)定HE乳的穩(wěn)態(tài)流動(dòng)特性，使用Herschel-Bulkley模型擬合流變參數(shù)。由表2所示，屈服應(yīng)力（δ0）是樣品開(kāi)始流動(dòng)所需的最小剪切應(yīng)力，與其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)[26]。不同樣品的δ0不同，歸因于不同體系的緊密堆積，這是由于增稠劑提高了食物顆粒之間的凝聚力[27]。添加X(jué)G的HE乳在2 種蛋白質(zhì)中都具有δ0，更有利于吞咽困難的人食用。不同HE乳的K值不同，其中HESPI-KC的K值最高，為819.55 Pa·s，HE-WP-KC的K值最低，為6.72 Pa·s。此外，所有HE乳的n值均小于1，表明它們?cè)诔^(guò)δ0后表現(xiàn)出剪切變稀的流動(dòng)特性；n＜1的食物有利于吞咽[28]。這與Vieira等[24]為有吞咽問(wèn)題的人設(shè)計(jì)不同增稠劑溶液的研究中觀察到的結(jié)果一致。

表2 在37 ℃ HE乳穩(wěn)定流動(dòng)的流變參數(shù)Table 2 Steady rheological parameters of HE incorporated milk at 37 ℃

2.2.2 HE乳的黏彈性

圖2顯示了37 ℃ HE乳的G′、G″和tanδ值隨頻率的變化。在0.1～100 rad/s內(nèi)，所有樣品的G′＞G″，這表明樣品為弱凝膠。tanδ＞1表示稀溶液，而在0.1～1之間表示弱凝膠[29]。所有樣品的tanδ均在0.22～0.56之間，進(jìn)一步證實(shí)了它們具有弱凝膠特性。這與Ribes等[30]的研究結(jié)果一致。

圖2 不同HE乳的頻率掃描Fig.2 Frequency scanning of HE incorporated milk

通過(guò)計(jì)算對(duì)數(shù)變化下HE乳的G′和G″斜率（分別為n′和n″）與頻率的關(guān)系，進(jìn)一步了解頻率對(duì)G′和G″值的影響。用G0′-G0″值衡量凝膠強(qiáng)度，復(fù)模量（G*）與樣品的剛度和硬度有關(guān)，而復(fù)合黏度（η*）是基于角頻率評(píng)估產(chǎn)品的整體流動(dòng)阻力[31]。在37 ℃、頻率1 Hz條件下進(jìn)行頻率掃描，結(jié)果如表3所示。所有HE乳的n′和n″值都在0～1之間，表現(xiàn)為弱凝膠行為。HE乳的n″＞n′，表明G″比G′更依賴頻率。這與Alvarez等[32]在海鱸魚(yú)蔬菜泥和雞肉蔬菜泥中描述的結(jié)論一致。HE-SPI-CMC的G0′-G0″值最高，這是由于帶負(fù)電荷的羧基與蛋白質(zhì)的陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)域相互作用，使CMC形成強(qiáng)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增加凝膠強(qiáng)度[33]。所有HE乳都表現(xiàn)出彈性行為（G′＞G″），這與Ribes[30]和Herranz[34]等的研究結(jié)果一致。HE-SPI-CMC的G*和η*值最高，因?yàn)檫@是增稠劑的陰離子結(jié)構(gòu)域（帶負(fù)電荷的羧基）和蛋白質(zhì)的陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)域（氨基酸）之間形成了強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)，從而加強(qiáng)了HE乳的結(jié)構(gòu)[35]。所有HE乳的tanδ值均小于1，表明其具有彈性特性。Nystr?m等[35]指出高彈性的稀液體有利于吞咽困難的人食用。同樣，Ishihara等[36]認(rèn)為tanδ值在0.1～1之間可以作為易吞咽的流變學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。因此，考慮到具有高抗變形性（高G*值）和良好彈性（低tanδ值）的食品吞咽更安全[37]，認(rèn)為HESPI-XG、HE-SPI-CMC、HE-WP-XG、HE-WP-CMC和HE-WP-KC更適合吞咽障礙人群食用。

表3 HE乳的凝膠性能參數(shù)和黏彈性參數(shù)Table 3 Gel properties and viscoelastic parameters of HE incorporated milk

為了確定溫度對(duì)樣品結(jié)構(gòu)變化的影響，從15～80 ℃進(jìn)行溫度掃描實(shí)驗(yàn)，如圖3a、b所示，隨著溫度的升高，各樣品G′和G″值基本都在減小。因?yàn)樾枰嗟臒崮芸朔菪齼?nèi)部鏈分子內(nèi)和分子間鍵的能量。但當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，HE-WP-XG的G′和G″增加，這是因?yàn)闇囟壬?，HE乳中WP分子鏈與XG分子運(yùn)動(dòng)更加劇烈，又伴隨著WP的變性，XG與WP相互作用增強(qiáng)，說(shuō)明增稠的WP與XG具有強(qiáng)的物理糾纏網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增稠的效果最好，從而加大了HE乳G′和G″值上升的趨勢(shì)[38]。這與顏準(zhǔn)等[39]研究溶液環(huán)境對(duì)吞咽障礙食品膠基增稠劑流變學(xué)性質(zhì)的影響結(jié)果一致。如圖3c所示，所有HE乳的tanδ值都在0.1～1，表明其具有良好彈性，有利于吞咽困難的人食用[40]。

圖3 15～80 ℃不同HE乳的溫度掃描結(jié)果Fig.3 Temperature scanning results of HE incorporated milk at 15-80 ℃

2.3 消化HE乳的流動(dòng)流變特性

測(cè)定在體外胃腸消化過(guò)程中消化HE乳的流變特性參數(shù)η（10 s-1）、n、K和R2，結(jié)果見(jiàn)表4。所有HE乳基本表現(xiàn)出非牛頓剪切變稀行為（n＜1）。相比其他消化部位，口腔中η值最高。消化后的樣品中，HE-WP-KC的η值和K值最高（分別為528.160 mPa·s和5.823 Pa·s），其次是HE-WP-XG和HE-SPI-XG，表明這些樣品的結(jié)構(gòu)受口腔α-淀粉酶的影響較小。HE-WP-KC在口腔和胃相的η和K參數(shù)差異最大，這可能是由于α-淀粉酶和胃蛋白酶的作用，WP的水解程度最高。腸消化階段結(jié)束后，消化樣品的η值和K值基本無(wú)顯著差異（P＞0.05）。這與Ribes等[30]的研究結(jié)果相似。

表4 HE乳在體外胃腸消化過(guò)程中的流動(dòng)流變行為參數(shù)Table 4 Rheological parameters of HE incorporated milk during in vitro gastrointestinal digestion

2.4 HE乳蛋白質(zhì)消化率

通過(guò)測(cè)定消化期間HE乳的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性肽和游離氨基酸的含量評(píng)估HE乳的消化特性。如圖4a所示，消化前，WP可溶性蛋白含量高于SPI，不同樣品的含量在不同的消化階段呈下降趨勢(shì)。在消化后，添加不同增稠劑的HE乳可溶性蛋白含量基本無(wú)顯著差異（P＞0.05），與樣品的蛋白種類無(wú)關(guān)，這是因?yàn)棣?淀粉酶的相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀或聚集，這一階段不會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)水解[41]。如圖4b所示，與消化前相比，每個(gè)消化階段HE乳多肽含量都在增加，尤其是在胃消化階段，HE-SPI-CMC增長(zhǎng)最高，為1.413 2 mg/g，HE-WP-KC含量（1.171 8 mg/g）次之，在胃蛋白酶的作用下，使得HE乳更容易消化。在胃消化階段，HE-SPI-XG和HE-WPXG沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。消化完成后，HE-WP-KC的多肽含量高達(dá)1.491 8 mg/g，證明腸道酶（主要是胰蛋白酶）在水解蛋白質(zhì)并生成肽和游離氨基酸方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。如圖4c所示，在口腔消化階段HE-WP-KC和HE-WP-CMC游離氨基酸含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。消化完成后，WP的游離氨基酸含量高于SPI，表明添加WP的HE乳更易于人體消化和吸收。其中，HE-SPI-XG樣品的游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為0.029 2%；HE-WPCMC最高，為0.034 1%，其次是HE-WP-KC、HE-SPIKC和HE-WP-XG。

圖4 HE乳的蛋白質(zhì)消化率Fig.4 Protein digestibility of HE incorporated milk

這些結(jié)果表明，雖然所有HE乳的初始蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)都高達(dá)10%，但蛋白質(zhì)消化率會(huì)受到樣品組成、結(jié)構(gòu)組織和理化性質(zhì)的影響，這是由于添加的蛋白質(zhì)及增稠劑與食物基質(zhì)的相互作用[41]。蛋白質(zhì)-增稠劑的相互作用取決于化合物的結(jié)構(gòu)、組成、pH值、離子強(qiáng)度、電離度、電荷密度等[42]，并可通過(guò)增加或減少消化酶的作用影響食物消化。據(jù)報(bào)道，陰離子多糖如KC、XG可以減少胃腸消化期間牛奶、雞蛋或大豆蛋白的分解，而海藻酸鹽減少了胃消化期間的蛋白質(zhì)水解[43]，但沒(méi)有減少小腸消化期間的蛋白質(zhì)水解[44]。

3 結(jié)論

富含蛋白質(zhì)濃稠HE乳表現(xiàn)出剪切變稀的流動(dòng)行為；HE-SPI-XG、HE-SPI-CMC、HE-WP-XG、HE-WP-CMC和HE-WP-KC具有高抗變形性和良好的彈性，更適合吞咽困難患者和老年人食用；在模擬體外消化實(shí)驗(yàn)中，HESPI-XG、HE-WP-XG和HE-WP-KC有較高的黏度和稠度，有利于老年人和吞咽困難的人食用；通過(guò)測(cè)定HE乳蛋白質(zhì)的消化率，可知WP蛋白質(zhì)含量高于SPI；HE-WPCMC和HE-WP-KC在消化完成后游離氨基酸的含量最高。本研究證實(shí)了添加蛋白質(zhì)和增稠劑與食物基質(zhì)之間的相互作用決定了樣品的流變學(xué)特性和消化特性。綜上所述，在設(shè)計(jì)適合吞咽困難或老年人的食品時(shí)，以WP為蛋白質(zhì)源和KC為增稠劑制備食品是一個(gè)很好的選擇。