實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速分型致瀉大腸埃希氏菌方法的建立

李芮,黃艷梅,童曉鈺,山珊,,劉成偉,譚俁宬,陳芳,劉道峰*

1(南昌大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室,江西 南昌,330019)

2(江西省疾病預(yù)防控制中心,江西省食源性疾病診斷溯源重點實驗室,青年科研創(chuàng)新攻關(guān)團隊,江西 南昌,330029)

3(江西業(yè)力醫(yī)療器械有限公司,江西 南昌,330008)

4(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心,江西 南昌,330022)

致瀉大腸埃希氏菌(diarrheagenicEscherichiacoli,DEC)是全球范圍內(nèi)引起腹瀉的重要食源性致病菌,對食品安全、人類健康和社會經(jīng)濟造成了嚴重的影響[1]。常見的引起人類發(fā)病的DEC有5種,包括腸道致病性大腸埃希氏菌(enteropathogenicEscherichiacoli,EPEC)、腸道侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinvasiveEscherichiacoli,EIEC)、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(shiga toxin-producingEscherichiacoli,STEC)或稱為腸道出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)與腸道聚集性大腸埃希氏菌(enteroaggregativeEscherichiacoli,EAEC)[2]。DEC感染后,不僅會導(dǎo)致人腹瀉,還會引起惡心、發(fā)熱及溶血性尿毒綜合征等癥狀,甚至導(dǎo)致死亡[3-6]。DEC在自然界分布廣泛,極易污染食品,GB 29921—2021《食品安全國家標準 預(yù)包裝食品中致病菌限量》規(guī)定在牛肉制品、即食生肉制品、發(fā)酵肉制品及去皮或預(yù)切的水果與蔬菜食品中5份25 g樣本中均不可檢出。但DEC型別多樣,檢測上易與無害的普通大腸埃希氏菌混淆[7]。因此,建立適用現(xiàn)場、快速且同時能實現(xiàn)DEC檢測與分型的方法對快速確定DEC污染來源、保障食品安全具有重要意義。

近年來,隨著對DEC致病機制的深入研究和分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展,DEC的檢測已經(jīng)由分子分型檢測法代替了傳統(tǒng)免疫分型檢測法[8]。目前常用的分型DEC方法,如國標法GB 4789.6—2016《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》采用PCR擴增待檢菌攜帶的不同目標基因,結(jié)合瓊脂糖電泳方法來鑒定其具體型別,但此方法操作繁瑣,工作量巨大。多重核酸擴增通過向同一反應(yīng)體系中加入多對引物可實現(xiàn)同時對多個目標基因的檢測,如胡安妥等[9]和袁慕云等[10]構(gòu)建的多重熒光PCR方法,可以節(jié)約時間并有效判定樣本中大腸埃希氏菌的致病型,但也需依賴專業(yè)的場所及昂貴的儀器設(shè)備。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)在2000年被日本學(xué)者NOTOMI等[11]首次提出,是一種不依賴專業(yè)設(shè)備、適用于現(xiàn)場和基層的核酸擴增方法。該方法利用具有高鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和4～6條特異性引物識別目標DNA上6個區(qū)域來進行擴增,在短時間(15～60 min)、恒溫條件下可將有限的初始DNA拷貝數(shù)實現(xiàn)109～1010倍的擴增。LAMP目前已在食品安全[12-13]、臨床診斷[14]與法醫(yī)鑒定[15]等方面得到了廣泛應(yīng)用。

本研究針對DEC的8段特征毒力基因pic、aggR、lt、st、stx1、stx2、escV、invE及大腸埃希氏菌屬特異性基因uidA設(shè)計LAMP引物,構(gòu)建實時熒光LAMP方法,實現(xiàn)對DEC的快速檢測及分型。該方法簡化了操作步驟,降低了設(shè)備門檻,提高了分型速度,為DEC的檢測及防控提供了重要技術(shù)支持,有利于保障食品安全,促進公眾健康。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株信息

菌株及編號見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036329),由江西省疾病預(yù)防控制中心提供。

表1 實時熒光LAMP方法與國標法各特征基因檢出限

1.1.2 試劑

營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar,NA)、營養(yǎng)肉湯(nutrient broth,NB),青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;10×LAMP緩沖溶液、Bst DNA聚合酶(Bst Ⅱ DNA Polymerase),翌圣生物科技(上海)股份有限公司;dNTP Mix,南京諾唯贊生物科技有限公司;SYBR Green Ⅰ,北京金博益生物科技有限公司;引物(HPLC級),上海生工生物有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

QT-1旋渦混合器,中國上海琪特分析儀器有限公司;QuantStudio 12K熒光擴增平臺,美國ABI公司;Synergy超純水系統(tǒng),德國Merck Millipore公司;ZWYR-4912恒溫振蕩培養(yǎng)箱,中國上海智城分析儀器制造有限公司;1-16K冷凍離心機,德國Sigma Laborzentrifugen公司;LTI-1200 W生化培養(yǎng)箱,日本東京理化公司;AC2-6S1生物安全柜,新加坡ESCO公司;QIAxcel Advanced全自動實時毛細管電泳儀,德國QIAGEN公司;K5500Plus超微量分光光度計,中國北京凱奧科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測目標基因的選擇及引物設(shè)計

DEC根據(jù)其致病機制、血清學(xué)及毒力因子等特征主要被分為5種類型,分別為EAEC、ETEC、EPEC、STEC和EIEC。其中,escV為EPEC特征性毒力基因;stx1與stx2為STEC特征性毒力基因;invE為EIEC特征性毒力基因,aggR與pic為EAEC特征性毒力基因。熱穩(wěn)定性腸毒素基因(st)[16]和lt為ETEC特征性毒力基因。此外,uidA為大腸埃希氏菌屬特異性基因,所以研究根據(jù)上述9段基因序列設(shè)計LAMP引物。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的pic(登錄號:AF097644.1)、aggR(登錄號:Z18751)、lt(登錄號:EU113250)、st(登錄號:AJ868113.1)、stx1(登錄號:AE005174.2)、stx2(登錄號:AE005174.2)、escV(登錄號:FM180568.1)、invE(登錄號:AF283289.1)及uidA(登錄號:S69414.1)的基因序列,利用Primer Explorer V5軟件進行引物設(shè)計,引物序列見附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.036329)。

表2 實時熒光LAMP的特異性評價

1.2.2 細菌培養(yǎng)和DNA提取

菌株接種于10 mL NB培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩(160 r/min)活化培養(yǎng)12 h后,菌液劃線于NA培養(yǎng)基平板,置于37 ℃培養(yǎng)12 h,再挑取單菌落接種于10 mL NB培養(yǎng)基,37 ℃振蕩(160 r/min)培養(yǎng)12 h。采用煮沸法提取菌株DNA,步驟如下:取1 mL液體培養(yǎng)基,置于冷凍離心機中離心5 min(4 ℃,9 000 r/min),棄上清液。然后用1 mL超純水清洗菌體沉淀,在4 ℃條件下離心5 min(9 000 r/min),棄上清液。再向離心管中加入200 μL超純水復(fù)溶,在100 ℃的恒溫金屬浴鍋中煮沸裂解10 min后,迅速冰浴5 min,離心5 min(4 ℃,9 000 r/min),保留上清液,作為DNA粗提物,用超微量分光光度計檢測DNA濃度。

1.2.3 LAMP引物的驗證及反應(yīng)體系的優(yōu)化

LAMP基礎(chǔ)反應(yīng)體系為:10×LAMP緩沖溶液(含80 mmol/L MgSO4)2.5 μL;dNTP Mix(10 mmol/L)3.5 μL;內(nèi)引物(FIP/BIP,40 μmol/L)1 μL;外引物(F3/B3,5 μmol/L)1 μL;環(huán)引物(LF/LB,10 μmol/L)1 μL;Bst DNA聚合酶(8 U/μL)1 μL;SYBR Green I(10×)1 μL及DNA模板(10 ng/μL)1 μL,按順序依次添加,最后超純水補齊至25 μL。將配制后的LAMP體系置于65 ℃加熱1 h,利用毛細管電泳儀分析擴增產(chǎn)物,對引物的擴增能力進行驗證。

在基礎(chǔ)反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上對部分條件進行優(yōu)化:SYBR Green I(10×)添加量為0.5、1、1.5、2.5 μL;環(huán)引物(LF/LB,10 μmol/L)添加量為0、0.5、1、2 μL;Bst DNA聚合酶(2、4、6、8 U/μL)1 μL;根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果確定各特征基因的最優(yōu)反應(yīng)體系。

1.2.4 實時熒光LAMP分型DEC方法的建立

以1 μL 10 ng/μL的EAEC、ETEC、EPEC、STEC、EIEC及普通大腸埃希氏菌標準菌株的DNA為陽性模板,分別加入對應(yīng)的優(yōu)化好的LAMP反應(yīng)體系,通過熒光擴增曲線判斷該方法是否能實現(xiàn)對5種DEC及普通大腸埃希氏菌的快速分型。

1.2.5 實時熒光LAMP方法檢出限的評價及與國標方法的對比

將標準菌株粗提取得到的DNA模板質(zhì)量濃度調(diào)整為:100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL與10 pg/μL,用上述DNA對本方法的檢出限進行評價,通過熒光擴增曲線判斷各特征基因的檢出限。同時,用國標法GB 4789.6—2016中的PCR擴增結(jié)合電泳法進行對比,以比較2種方法在檢出限上的差異。

1.2.6 實時熒光LAMP方法的特異性評價

采用12株非大腸埃希氏菌標準菌株,評價該方法特異性(排他性)。包括金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、奇異變形桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、創(chuàng)傷弧菌、表皮葡萄球菌及小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。

1.2.7 實際菌株的驗證

采用從食源性疾病患者糞便樣本中分離出的23株臨床株對本研究構(gòu)建的實時熒光LAMP方法進行驗證。分離株包括:5株EAEC、5株ETEC、5株EPEC、5株STEC、1株EIEC及2株普通大腸埃希氏菌。與實際結(jié)果對比,評價本方法對DEC的檢出靈敏度(包容性)及分型DEC的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP引物擴增能力的驗證

利用設(shè)計好的LAMP引物,構(gòu)建LAMP反應(yīng)體系。分別以EAEC、ETEC、STEC、EPEC和EIEC為陽性模板,超純水作為陰性對照,對pic、aggR、lt、st、stx1、stx2、escV、invE以及uidA的LAMP引物擴增能力進行驗證。利用毛細管電泳儀對每組基因的LAMP擴增產(chǎn)物進行檢測。結(jié)果如圖1所示,添加了對應(yīng)目標菌DNA的陽性組(+)其擴增產(chǎn)物都顯示出了彌散性的梯狀條帶,每種基因的陰性組(-)均未見條帶產(chǎn)生,結(jié)果表明,本文設(shè)計的LAMP引物具有良好的擴增能力,且特異性強。

圖1 不同基因LAMP擴增產(chǎn)物毛細管電泳圖

2.2 SYBR Green Ⅰ添加量的優(yōu)化及反應(yīng)時間的確定

以大腸埃希氏菌屬特異性基因uidA為待檢基因,在LAMP反應(yīng)體系中調(diào)整SYBR Green Ⅰ的添加量,陽性(+)以10 ng/μL EAEC為模板,以超純水為陰性(-)對照,利用熒光擴增平臺采集熒光信號。如圖2所示,SYBR Green Ⅰ的添加量越多陽性與陰性峰值差值越大。但是SYBR Green Ⅰ添加量過多會導(dǎo)致擴增速度慢,起峰時間晚。綜上所述,選取SYBR Green Ⅰ(10×)的最優(yōu)添加量為1.5 μL。反應(yīng)40 min以后,擴增曲線的熒光值平穩(wěn),所以實時熒光LAMP分型DEC的檢出時間設(shè)為40 min。

圖2 SYBR Green Ⅰ添加量對實時熒光LAMP的影響

2.3 Bst DNA聚合酶添加量對實時熒光LAMP擴增效率的影響

Bst DNA聚合酶的添加量是影響LAMP擴增效率的關(guān)鍵。實驗結(jié)果表明(圖3),Bst DNA聚合酶添加量越多擴增速度越快。但是相關(guān)研究結(jié)果顯示,過量的Bst DNA聚合酶不僅會增加反應(yīng)成本,還會使引物形成二聚體,降低擴增效率[17]。綜上,確定每段基因?qū)崟r熒光LAMP體系中Bst DNA聚合酶的最優(yōu)添加量分別是:pic與escV添加量為2 U,aggR、lt、stx1與stx2添加量為4 U,st與uidA添加量為6 U,invE添加量為8 U。

A-pic;B-aggR;C-lt;D-st;E-stx1;F-stx2;G-escV;H-invE;I-uidA

2.4 環(huán)引物添加量對實時熒光LAMP擴增效率的影響

圖4表明在LAMP體系中,環(huán)引物的添加能大大加快目標基因的擴增速度。不加環(huán)引物,pic、lt、escV及uidA基因在40 min內(nèi)都不能發(fā)生擴增。但是,環(huán)引物添加量過多可能會造成引物之間的錯配,影響擴增效率,如stx2、invE的陰性組會起峰。綜上,確定每段基因?qū)崟r熒光LAMP體系中最優(yōu)的環(huán)引物(10 μmol/L)添加量,除uidA添加量為1 μL,其余的pic、aggR、lt、st、stx1、stx2、escV與invE添加量均為0.5 μL。

A-pic;B-aggR;C-lt;D-st;E-stx1;F-stx2;G-escV;H-invE;I-uidA

2.5 實時熒光LAMP分型DEC結(jié)果

利用所建立實時熒光LAMP方法對EAEC、ETEC、STEC、EPEC、EIEC和普通大腸埃希氏菌標準菌株進行檢測,結(jié)果如圖5所示,該方法可檢出6株大腸埃希氏菌的菌屬特異性基因uidA。DEC的標準菌株對應(yīng)的各特征基因均呈現(xiàn)明顯地擴增,標準菌株的基因組也并未造成其余基因擴增管的交叉反應(yīng)。

A-EAEC;B-ETEC;C-STEC;D-EPEC;E-EIEC;F-普通大腸埃希氏菌

2.6 實時熒光LAMP方法檢出限的確定及與國標方法的比對

以粗提取得到的不同濃度的目標菌DNA評價方法的檢出限。結(jié)果如圖6所示,pic和escV的檢出限是1 ng/μL,aggR、stx1、invE和uidA的檢出限是100 pg/μL,lt、st和stx2的檢出限是10 pg/μL。同時,用國標法對相同濃度的DNA模板進行檢測作為對比,結(jié)果如表1所示,本研究構(gòu)建的實時熒光LAMP方法對各特征基因的檢出限均低于國標法。

A-pic;B-aggR;C-lt;D-st;E-stx1;F-stx2;G-escV;H-invE;I-uidA

2.7 實時熒光LAMP方法的特異性評價

利用本文構(gòu)建的方法對12株已知菌型的非大腸埃希氏菌進行檢測,結(jié)果如表2所示,9段基因均未被檢出,表明本文所建立的方法對DEC進行檢測和分型時特異性好,不受其他致病菌的干擾,方法特異度為100%(12/12)。

2.8 臨床菌株的驗證結(jié)果

利用本文構(gòu)建的方法對腹瀉患者糞便樣本中分離的23株臨床株進行檢測,結(jié)果見表3,所有菌株均可檢出大腸埃希氏菌屬特異性基因uidA,并可準確檢測出21株DEC的毒力基因進行分型,與實際結(jié)果一致,且型間無相互交叉反應(yīng),該方法檢出DEC靈敏度為100%(21/21)。

3 結(jié)論

研究構(gòu)建了實時熒光LAMP方法,實現(xiàn)了等溫條件下5種DEC的快速準確分型。不同基因的擴增速率差異是多基因的擴增檢測方法構(gòu)建過程的難點問題。研究為了實現(xiàn)特定結(jié)果判讀時間點(本文為40 min)所有靶基因檢測結(jié)果的統(tǒng)一、準確判讀,需保證所有靶基因擴增速率相對一致且均不發(fā)生非特異性擴增。研究發(fā)現(xiàn)Bst DNA聚合酶和環(huán)引物的添加量是影響LAMP擴增效率的關(guān)鍵因素,通過合理調(diào)整Bst DNA聚合酶的添加量,可保證LAMP擴增效率的同時提高方法的經(jīng)濟性。環(huán)引物的添加對LAMP擴增有明顯的“促進效應(yīng)”,本研究發(fā)現(xiàn),若不加環(huán)引物,pic、lt、escV及uidA在40 min內(nèi)不能開始擴增。然而,相比“添加與否”,環(huán)引物的“添加量”對LAMP擴增速度影響不大,添加量過多還會導(dǎo)致LAMP的非特異性擴增,降低擴增準確度,這些發(fā)現(xiàn)與其他研究者研究結(jié)果[18-20]一致。此外,研究還發(fā)現(xiàn)SYBR Green Ⅰ添加量對LAMP擴增有顯著的影響,SYBR Green Ⅰ添加量過少會導(dǎo)致陰陽性峰值相差較小,過多則會對擴增有抑制作用,導(dǎo)致擴增速度變慢。

綜上,研究根據(jù)DEC的pic、aggR、lt、st、escV、stx1、stx2、invE基因及大腸埃希氏菌屬特異性基因uidA構(gòu)建了實時熒光LAMP方法,實現(xiàn)了等溫條件下對DEC快速檢測與分型。方法對pic和escV的檢出限是1 ng/μL,對aggR、stx1、invE和uidA的檢出限是100 pg/μL,對lt、st和stx2的檢出限是10 pg/μL,非DEC的標準菌株評價結(jié)果表明,方法特異度為100%(12/12),臨床菌株驗證結(jié)果顯示,方法對臨床DEC檢出靈敏度為100%(21/21),分型結(jié)果也與實際結(jié)果完全符合。本方法簡便、經(jīng)濟、高效,對設(shè)備要求低,能將檢測時間縮短至40 min內(nèi),適合基層機構(gòu)使用,有利于食源性疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、及時對癥治療,對保障食品安全和維護公眾健康有積極意義。