金蕎麥總黃酮對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的影響

郝潔,林紅英,彭金菊,謝為天,陳志寶,2*

1(廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東 湛江,524088)

2(廣東海洋大學(xué) 深圳研究院,廣東 深圳,518108)

金蕎麥,屬蓼科蕎麥屬,又名天蕎麥、野蕎麥、蕎麥三七、金鎖銀開,常以根入藥,主要成分為金蕎麥黃酮,其具有良好的自由基清除能力,有助于減少免疫細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子,改善腸黏膜屏障的受損,刺激動(dòng)物免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育,提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能,降低機(jī)體血糖和血脂水平,有效緩解關(guān)節(jié)炎癥[1-4]。隨著人類生活水平的日益提高以及亞健康狀態(tài)的長(zhǎng)期維持,保健食品的重要性愈發(fā)突出,金蕎麥作為中國(guó)重要的傳統(tǒng)中草藥,其塊根中的活性提取物可作為綠色保健食品之一,其富含的多種營(yíng)養(yǎng)成分及功效在未來(lái)的市場(chǎng)中具有巨大的潛力。

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是由多種內(nèi)源性和外源性刺激引起肺部出現(xiàn)以炎癥反應(yīng)、肺水腫和肺泡毛細(xì)血管屏障損傷為病理特征,以呼吸衰竭綜合癥和進(jìn)行性低氧血癥為臨床特征的綜合病征[5-6]。大量研究表明,氧化應(yīng)激和過度炎癥是急性肺損傷發(fā)生發(fā)展的2個(gè)重要因素,是急性呼吸窘迫綜合征、肺炎、急性呼吸衰竭、膿毒癥等的輕度病理階段[7-8]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大多數(shù)食源性致病菌如大腸桿菌的主要毒性成分,廣泛用于誘導(dǎo)細(xì)菌感染引起的ALI[9]。當(dāng)肺部識(shí)別到病原體入侵時(shí),先天免疫系統(tǒng)啟動(dòng),RAW 264.7 細(xì)胞作為肺遠(yuǎn)端最豐富的先天免疫細(xì)胞被激活,細(xì)胞膜受體識(shí)別病原體引發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答,活性氧(reactive oxygen,ROS)產(chǎn)生,RAW 264.7 細(xì)胞向 M1 極化從而分泌促炎介質(zhì),調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)[10-11]。因此,本研究擬通過 LPS 建立 RAW 264.7 細(xì)胞損傷模型及小鼠急性肺損傷模型,探究天然金蕎麥總黃酮對(duì)食源性致病菌誘發(fā) RAW 264.7 細(xì)胞損傷和小鼠急性肺損傷的作用,為開發(fā)其作為有效抑制肺部炎癥的保健食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性昆明小鼠[(20±2) g]購(gòu)自珠海百試通生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(粵)2020-0051,倫理審查批準(zhǔn)文號(hào)為GDOU-LAE-2022-014;RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞株,上海信裕生物科技有限公司;金蕎麥藥材,產(chǎn)地貴州;DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,美國(guó)GIBCO公司;胎牛血清,Clark;青-鏈霉素,美國(guó)GIBCO公司;脂多糖,美國(guó)Sigma公司;CCK-8活細(xì)胞檢測(cè)試劑盒,Abmole公司;白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)和白細(xì)胞介素18(interleukin-18,IL-18)、白細(xì)胞介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素18(IL-18) ELISA 試劑盒,北京奇松生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(dehydrogenase,LDH)活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量檢測(cè)試劑盒、過氧化氫(H2O2)測(cè)定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;活性氧(reactive oxygen,ROS)、CuZn/Mn-SOD活性檢測(cè)試劑盒、總谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測(cè)試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)定試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程研究所;無(wú)水乙醇、NaNO2、AlNO3、NaOH,均為分析純,廣州科誠(chéng)生物有限公司;甲醇(LC-MS級(jí))、乙腈(LC-MS級(jí)),美國(guó)Honeywell公司;甲酸(LC-MS級(jí)),美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1800紫外分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵,上海亞榮生化儀器廠;DF-1集熱式攪拌器,金壇市虹盛儀器廠;多功能粉碎機(jī),萊芙LFP-800T;電子天平,上海越平科學(xué)儀器有限公司;二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo公司;超凈工作臺(tái),蘇州安泰科技有限公司;OLYMPUSBX40光學(xué)顯微鏡,日本OLYMPUS公司;高速臺(tái)式離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;恒溫水浴箱CU600,上海一恒公司;超低溫冰箱,青島海爾股份有限公司;酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio-Tek公司;超高效液相色譜儀,AB Sciex公司;高靈敏度質(zhì)譜,AB Sciex公司;純水儀,Merck Millipore;C18色譜柱,Waters公司。

1.3 研究方法

1.3.1 金蕎麥總黃酮的提取及鑒定

將塊狀的金蕎麥根莖粉碎,60 ℃熱風(fēng)干燥至恒重,取金蕎麥藥材20 g浸泡17 h后,用75%乙醇浸泡提取3次,真空抽濾,棄去殘?jiān)?合并3次提取液于同一燒瓶。將提取液分次加入到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮,濃縮溫度為70 ℃,濃縮至藥液不再沸騰倒出濃縮液。利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定金蕎麥總黃酮的成分。

1.3.2 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞損傷的影響

1.3.2.1 供試樣品的制備與處理

金蕎麥總黃酮溶液:稱量干燥的金蕎麥總黃酮,在無(wú)菌條件下,以DMSO為溶劑,制備成5 mg/mL母液,并過0.22 μm微孔濾膜過濾,分裝后置于4 ℃保存。

LPS溶液:在無(wú)菌條件下,精確稱取脂多糖粉末用PBS制備成1 mg/mL母液,并用0.22 μm濾膜過濾除菌,分裝后置于4 ℃保存。

1.3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇:37 ℃水浴融化凍存管,加入1 mL培養(yǎng)基離心,1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入5 mL完全培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到細(xì)胞瓶。

細(xì)胞培養(yǎng):RAW 264.7細(xì)胞(小鼠單核巨噬細(xì)胞)用含10%胎牛血清和100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基,在含有5% CO2的培養(yǎng)箱里37 ℃培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代:待細(xì)胞密度達(dá)到90%左右棄上清,加入PBS清洗培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞1～2次,加入1 mL胰酶,37 ℃消化1～2 min后加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化,5 mL離心管收集細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄掉上清液,加2 mL完全培養(yǎng)基,吹打均勻,各吸取1 mL到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)加4 mL完全培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存:待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到90%左右傳代,PBS洗2遍,然后加2 mL完全培養(yǎng)基輕輕吹打,轉(zhuǎn)移到離心管里,1 000 r/min離心5 min,棄掉上清液,加入1 mL的細(xì)胞凍存液吹打均勻,將其程序降溫后移入液氮。

1.3.2.3 細(xì)胞分組和模型建立

將細(xì)胞分為5組:正常組(細(xì)胞不經(jīng)處理)、LPS組(僅用20 μg/mL LPS刺激12 h)、金蕎麥總黃酮低濃度組(用10 μg/mL金蕎麥總黃酮處理細(xì)胞9 h后用20 μg/mL LPS刺激12 h)、金蕎麥總黃酮中濃度組(用20 μg/mL金蕎麥總黃酮處理細(xì)胞9 h后用20 μg/mL LPS刺激12 h)、金蕎麥總黃酮高濃度組(用30 μg/mL金蕎麥總黃酮處理細(xì)胞9 h后用20 μg/mL LPS刺激12 h)。

1.3.2.4 RAW 264.7細(xì)胞生存能力分析

將RAW 264.7細(xì)胞以1×105cell/mL接種于96孔板中,在含有5% CO2的培養(yǎng)箱里37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h后,依次加入不同濃度的藥物,采用CCK-8法檢測(cè)RAW 264.7的細(xì)胞活力。

LPS對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力檢測(cè):將0、5、10、20、30、40 μg/mL LPS溶液取100 μL加入96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)12 h,加入10 μL CCK-8溶液,在培養(yǎng)箱中孵育1 h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度。

金蕎麥總黃酮對(duì)RAW 264.7的細(xì)胞活力檢測(cè):將0、12.5、25、50、100、150 μg/mL金蕎麥總黃酮取100 μL加入96孔板中培養(yǎng)12 h,加入10 μL CCK-8溶液,在培養(yǎng)箱中孵育1 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度。

金蕎麥總黃酮對(duì)炎癥狀態(tài)下RAW 264.7的細(xì)胞活力檢測(cè):按照1.3.2.3節(jié)步驟進(jìn)行,最后加入10 μL CCK-8溶液,在培養(yǎng)箱中孵育1 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度。

細(xì)胞活力計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

注:A(加藥):含有細(xì)胞、CCK-8和不同濃度金蕎麥總黃酮溶液孔的吸光度;A(空白):含有培養(yǎng)基和CCK-8的細(xì)胞孔吸光度;A(0加藥):含有細(xì)胞、CCK-8溶液,不含藥物溶液孔的吸光度。

1.3.2.5 RAW 264.7細(xì)胞中LDH活力測(cè)定

RAW 264.7細(xì)胞按照1.3.2.3節(jié)步驟進(jìn)行處理,收集細(xì)胞,按比例加入提取液,超聲波破碎細(xì)胞后8 000×g離心10 min,取上清后,按LDH活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。

1.3.2.6 2,7-二氯熒光素二乙酸酯(2,7-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)熒光探針檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)ROS水平

RAW 264.7細(xì)胞按照1.3.2.3節(jié)步驟在6孔板中分組處理。在黑暗環(huán)境中,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,加入1 mL 用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋的DCFH-DA,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用PBS洗滌細(xì)胞3次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。在熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度,實(shí)驗(yàn)每組設(shè)定3個(gè)平行孔,用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度的平均值。

1.3.2.7 RAW 264.7細(xì)胞中MDA水平、GSH含量、SOD和CAT活性

收集各處理組的細(xì)胞于離心管中,加入相應(yīng)的提取液,采用MDA、SOD、GSH、CAT商業(yè)試劑盒檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞中MDA水平、GSH含量以及SOD和CAT活性。

1.3.2.8 ELISA法檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18含量

收集各細(xì)胞處理組的上清培養(yǎng)基于離心管中,1 000 r/min離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中備用,從4 ℃冰箱取出ELISA試劑盒平衡至室溫,按試劑盒中說(shuō)明書進(jìn)行操作,每孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或上清液,反應(yīng)終止后,在30 min之內(nèi),使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm最大吸收波長(zhǎng),并計(jì)算出TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β的含量。

1.3.2.9 Hoechst 33342/PI雙染色檢測(cè)RAW 264.7細(xì)胞凋亡水平

將RAW 264.7細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,分組處理,加入含有10 μL Hoechst 33342和5 μL PI染色液的新鮮培養(yǎng)基共計(jì)1 mL,混勻,37 ℃避光孵育30 min。染色后用PBS洗滌2～3次,使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡水平。

1.3.3 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的影響

1.3.3.1 小鼠急性肺損傷(acute lung injury,ALI)模型的建立及治療

選取5～6周齡的SPF級(jí)雄性昆明小鼠[(20±2) g],標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng),溫度為(22±2) ℃。實(shí)驗(yàn)小鼠安放在可自由進(jìn)食和飲水的鼠籠,適應(yīng)性生長(zhǎng)7 d。將小鼠隨機(jī)分為5組,每組6只,分別為對(duì)照組、LPS組、金蕎麥總黃酮低濃度組、金蕎麥總黃酮中濃度組、金蕎麥總黃酮高濃度組。金蕎麥總黃酮低中高濃度組分別按照25、50、100 mg/kg的劑量灌胃金蕎麥總黃酮,對(duì)照組和LPS組灌胃等體積的生理鹽水。飼養(yǎng)12 d后,ALI組、金蕎麥總黃酮低中高濃度組小鼠用乙醚麻醉,鼻內(nèi)給予1 mg/kg LPS處理12 h以建立急性肺損傷模型,對(duì)照組滴鼻同等體積的雙蒸水。

1.3.3.2 標(biāo)本采集及肺干濕比重(W/D)檢測(cè)

LPS給藥12 h后,以乙醚氣體麻醉小鼠后處死,分別收集外周血、肺組織等標(biāo)本。將收集的血液于常溫靜置1 h后,于4 ℃以3 500 r/min離心15 min,收集上層血清,保存在-80 ℃中備用。分離雙肺,左右肺剪開,取出左肺,用PBS沖洗,吸干表面水分并稱重,在80 ℃烘箱中烘烤36 h,稱其干重,計(jì)算W/D。

1.3.3.3 肺組織病理學(xué)變化

小鼠右肺組織置于4%的多聚甲醛中固定48 h后,進(jìn)行以下步驟:

修塊→洗滌→脫水→透明→透蠟→包埋→切片→展片→烘片→脫蠟→脫苯→水洗→蘇木素染色→水洗→分化→水洗→返藍(lán)→水洗→伊紅染色→水洗→脫色→透明→封片

在光學(xué)顯微鏡下觀察,以HE染色評(píng)價(jià)各組小鼠肺部病理學(xué)變化。

1.3.3.4 小鼠血清中H2O2、MDA和CAT測(cè)定

使用活性試劑盒測(cè)定血清中MDA、H2O2含量和CAT活性,并使用96孔板讀數(shù)器測(cè)量對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)處的吸光度變化。

1.3.3.5 ELISA測(cè)定炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β濃度測(cè)定

傳統(tǒng)CORDIC算法角度θ的收斂范圍是[-99.872。，99.872。]，而不是[-π，π]，這是傳統(tǒng) CORDIC 算法的一個(gè)缺點(diǎn)，針對(duì)該缺點(diǎn)，文中所設(shè)計(jì)的全流水線三角函數(shù)加速核利用三角函數(shù)變換的方法來(lái)處理，即進(jìn)行輸入值、輸出值調(diào)整來(lái)使CORDIC算法收斂域擴(kuò)展到4個(gè)象限[-π，π]。與傳統(tǒng)做法一樣，為了在硬件上實(shí)現(xiàn)方便，我們每次選擇性地取正切恰為2次冪的角度做旋轉(zhuǎn)如式（10）所示，這樣xi、yi迭代時(shí)所做的乘法就可以轉(zhuǎn)化為移位操作[11]。

根據(jù)小鼠IL-6、TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清中IL-6、TNF-α和IL-1β的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,使用One-way ANOVA對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);LPS組與實(shí)驗(yàn)組之間“#”表示差異顯著(P<0.05),“##”表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金蕎麥總黃酮的提取及鑒定

金蕎麥提取得到的總黃酮含量為51.646 3 mg/g,提取率高達(dá)5.16%。經(jīng)超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定得63種黃酮成分。超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜正離子模式共檢測(cè)出48種黃酮成分,分別是蘆丁、原花青素B2、表兒茶素、原兒茶醛、柚皮苷查爾酮、柚皮素、兒茶素、異甘草素、二氫槲皮素/紫杉葉素、草酚、木犀草素、異槲皮苷、葛根素、山奈酚、異鼠李素、川橙皮素、芒柄花苷、喬松素、桔皮素、芹菜素、甜橙黃酮、芹菜素-7-葡萄甙、紫云英苷、地奧司明、芫花素、異葒草素、染料木素、根皮素、野漆樹苷、黃豆黃素、羥基芫花素、穗花杉雙黃酮、葒草苷、大豆苷、淫羊藿苷、牡荊素、楊芽黃素、黃芩苷、白楊素、銀椴苷、異櫻花亭、夏佛塔苷、金松雙黃酮、射干苷元、表沒食子兒茶素、光甘草定、牡荊素鼠李糖苷、(+)-沒食子兒茶素。超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜負(fù)離子模式共檢測(cè)出15種黃酮成分,分別是表兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、槲皮苷、落新婦苷、斯皮諾素、甘草苷、蕓香柚皮苷、黃杞苷、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、新橙皮苷、圣草次苷、扁蓄苷、沒食子兒茶素沒食子酸酯、枸橘苷。

2.2 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞損傷的影響

2.2.1 RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型的建立

由于LPS暴露的RAW 264.7巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞活力下降是評(píng)估細(xì)胞氧化和炎癥損傷的常用模型[12]。為了篩選LPS建立RAW 264.7細(xì)胞炎癥及氧化應(yīng)激模型的最適作用濃度,選擇0、5、10、20、40 μg/mL的LPS處理RAW 264.7細(xì)胞12 h。如圖1結(jié)果表明,LPS濃度低于10 μg/mL時(shí),RAW 264.7的細(xì)胞活力與對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但在20、40 μg/mL LPS存在下,RAW 264.7的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)。因此,選擇20 μg/mL LPS為建立RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型的染毒濃度。

圖1 LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響

2.2.2 金蕎麥總黃酮對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響

將不同濃度0、25、50、100、200 μg/mL及不同時(shí)間9、12、24 h的金蕎麥總黃酮作用于RAW 264.7細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著各處理組藥物濃度的增加,不同處理時(shí)間下RAW 264.7細(xì)胞的存活率逐漸降低。金蕎麥總黃酮濃度為0、25、50 μg/mL作用細(xì)胞9、12、24 h后,細(xì)胞活力與對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。金蕎麥總黃酮處理RAW 264.7細(xì)胞9 h時(shí),細(xì)胞存活率較12、24 h明顯升高,不同濃度下的細(xì)胞活力分別為108.66%、104.82%、88.15%、67.87%(圖2-a、圖2-b、圖2-c)。這表明,金蕎麥總黃酮處理24 h內(nèi)的最大安全濃度為50 μg/mL,在此劑量?jī)?nèi)金蕎麥總黃酮的藥理活性不受細(xì)胞活力的影響(圖2-d)。

a-金蕎麥總黃酮處理9h對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響;b-金蕎麥總黃酮處理12 h對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響;c-金蕎麥總黃酮處理24 h對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響;d-金蕎麥總黃酮對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的劑量和時(shí)間依賴性影響

LPS干預(yù)使RAW 264.7的細(xì)胞存活率顯著降低,LDH含量明顯增加;而金蕎麥總黃酮有效逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的抑制以及LDH的釋放。這種趨勢(shì)在金蕎麥總黃酮濃度為0～30 μg/mL時(shí)呈現(xiàn)劑量依賴性升高,在40 μg/mL時(shí)顯著降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比,30 μg/mL金蕎麥總黃酮預(yù)保護(hù)后的細(xì)胞活力和LDH釋放量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,圖3-a和圖3-b)。綜合以上考慮,最終確定金蕎麥總黃酮預(yù)保護(hù)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞的時(shí)間為9 h,濃度梯度為10、20、30 μg/mL。

a-金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響;b-金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞LDH含量的影響

2.2.4 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

如圖4所示,LPS刺激可顯著增加巨噬細(xì)胞M1極化分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18(P<0.01),而金蕎麥總黃酮可有效降低LPS給藥的RAW 264.7細(xì)胞中促炎M1介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18的表達(dá),顯著逆轉(zhuǎn)了LPS刺激的作用(P<0.05)。以上結(jié)果表明,金蕎麥總黃酮可通過抑制巨噬細(xì)胞M1極化,從而降低細(xì)胞中炎性因子的含量減輕LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

a-IL-6含量;b-IL-18含量;c-IL-1β含量;d-TNF-α含量

2.2.5 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

如圖5所示,與對(duì)照組相比,LPS可導(dǎo)致RAW 264.7細(xì)胞總ROS產(chǎn)生以及MDA含量明顯升高(P<0.05),而GSH、SOD、CAT的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。經(jīng)過金蕎麥總黃酮干預(yù)后,巨噬細(xì)胞產(chǎn)生總ROS和MDA水平呈劑量依賴性降低,LPS誘導(dǎo)的GSH、SOD、CAT的表達(dá)逆轉(zhuǎn)(圖4-a、圖4-b、圖4-c、圖4-d和圖4-e)。以上結(jié)果表明,金蕎麥總黃酮能有效上調(diào)RAW 264.7細(xì)胞中GSH與SOD和CAT的表達(dá)(P<0.01),清除RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)過量的ROS(P<0.01),進(jìn)而減少由ROS積累誘發(fā)多不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)生的MDA。

a-ROS水平(×200);b-MDA含量;c-GSH水平;d-SOD活力;e-CAT活力

2.2.6 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞凋亡的影響

如圖6所示,LPS組的Hoechst 33342和PI陽(yáng)性率較對(duì)照組顯著升高,表明RAW 264.7細(xì)胞質(zhì)膜的完整性嚴(yán)重受損(圖6-b)。與LPS組相比,金蕎麥總黃酮可有效降低LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞Hoechst 33342和PI陽(yáng)性率,且隨著金蕎麥給藥劑量的升高,活細(xì)胞染色的陽(yáng)性率逐漸降低(圖6-c、圖6-d和圖6-e)。這表明,金蕎麥總黃酮可有效對(duì)抗LPS干預(yù)誘發(fā)的RAW 264.7細(xì)胞凋亡。

a-對(duì)照組;b-LPS組;c-10 μg/mL金蕎麥總黃酮組;d-20 μg/mL金蕎麥總黃酮組;e-30 μg/mL金蕎麥總黃酮組

2.3 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的影響

2.3.1 LPS構(gòu)建小鼠急性肺損傷模型

小鼠肺組織觀察大體表現(xiàn)為對(duì)照組小鼠肺組織外觀正常,肺葉輪廓清晰,質(zhì)軟且富有彈性,表面未見明顯出血點(diǎn);LPS組小鼠肺組織塌陷,表面可見條狀性出血及彌漫性出血;金蕎麥總黃酮處理組可明顯減輕LPS滴鼻造成的肺組織肺充血及結(jié)構(gòu)損傷程度,且呈現(xiàn)劑量依賴性(圖7-a)。HE染色結(jié)果表明(圖7-b),對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡壁薄,肺泡腔內(nèi)少見紅細(xì)胞和炎性浸潤(rùn);LPS滴鼻引起小鼠肺泡塌陷結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡間隔增厚,肺泡間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)可見大量紅細(xì)胞及明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而金蕎麥總黃酮可明顯減輕肺組織充血及炎性滲出,且呈劑量依賴性。根據(jù)美國(guó)胸科協(xié)會(huì)2010年推出的實(shí)驗(yàn)性ALI的標(biāo)準(zhǔn)判斷,LPS構(gòu)建小鼠急性肺損傷模型成功。

a-肺組織大體觀察;b-肺組織HE染色(×400)

圖8 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠血清中炎性因子的影響

2.3.2 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織濕干重比(W/D)的影響

肺濕干重比(W/D)用于評(píng)估肺水腫的程度。如表1所示,與對(duì)照組相比,LPS組的肺干濕重量比顯著升高(P<0.05),用金蕎麥總黃酮(25、50和100 mg/kg) 可有效緩解小鼠肺組織的水腫程度,且W/D以劑量依賴性方式顯著降低。這表明,金蕎麥總黃酮可有效緩解LPS干預(yù)誘發(fā)的小鼠肺組織水腫。

表1 金蕎麥總黃酮對(duì)小鼠肺組織濕干重比(W/D)的影響

2.3.3 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠血清中炎性因子的影響

如圖7所示,LPS滴鼻給藥可顯著增加小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量(P<0.01),而金蕎麥總黃酮可有效降低LPS刺激引起的小鼠血清中促炎介質(zhì)TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌(P<0.01),顯著逆轉(zhuǎn)了LPS干預(yù)的作用。結(jié)果表明,金蕎麥總黃酮可通過減少小鼠血中炎性因子的分泌減輕LPS誘導(dǎo)小鼠肺組織炎癥反應(yīng)。

2.3.4 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠血清中氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響

如表2所示,與對(duì)照組相比,LPS可導(dǎo)致小鼠血清中H2O2和MDA含量明顯升高,而CAT的活性顯著降低(P<0.01)。經(jīng)過金蕎麥總黃酮干預(yù)后,小鼠血清中產(chǎn)生H2O2和MDA水平呈劑量依賴性降低CAT活力水平呈現(xiàn)逆轉(zhuǎn)(P<0.01)。以上結(jié)果表明,金蕎麥總黃酮能有效上調(diào)小鼠血清中抗氧化酶CAT的表達(dá),減少由活性氧積累產(chǎn)生的MDA和H2O2,從而減輕LPS干預(yù)誘發(fā)的小鼠肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。

表2 金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠血清中氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響

2.4 討論

急性肺損傷是臨床上常見的危重癥之一,主要發(fā)病機(jī)制為肺部或全身不可控的炎癥,可發(fā)生于動(dòng)物生長(zhǎng)的各個(gè)階段,患病率和死亡率居高不下[13]。巨噬細(xì)胞是急性肺損傷發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵協(xié)調(diào)者,是抵御空氣傳播顆粒和微生物的第一道防線,其功能傳統(tǒng)上被認(rèn)定為“M1經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(CAM)”與“M2替代活化巨噬細(xì)胞(AAM)”,M1巨噬細(xì)胞的特征是分泌促炎因子,如IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α等促進(jìn)自身免疫性疾病[14-15]。異常的巨噬細(xì)胞極化是氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)之間的中心聯(lián)系,能引起微環(huán)境中的ROS與DNA、脂質(zhì)(包括磷脂)以及抗氧化系統(tǒng)的分子相互作用,破壞氧化還原平衡,導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)功能程序、分泌產(chǎn)物和周圍組織微環(huán)境的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)[16]。研究表明,多形核中性粒細(xì)胞的外泌體miR-30 d-5p靜脈注射可顯著降低盲腸結(jié)扎和穿刺(CLP)誘導(dǎo)的ALI小鼠肺中M1巨噬細(xì)胞活化和巨噬細(xì)胞死亡[17];宣肺白湯通過下調(diào)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠中促炎細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α和IL-1β的表達(dá)以及巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)來(lái)改善肺損傷[18]。因此,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的異常極化可能是改善急性肺損傷的重要途徑。

由多種致病性病原菌經(jīng)攝食進(jìn)入人體內(nèi)引起以炎癥為主的急性肺損傷,已成為危害人類健康安全的世界性難題。大量研究表明,革蘭氏陰性菌外膜的脂多糖滴鼻或氣管滴注可有效增加ROS的產(chǎn)生以及炎癥因子的釋放,可有效模擬急性肺損傷的發(fā)病過程[19-20]。因此,本研究利用LPS建立RAW 264.7細(xì)胞損傷模型和小鼠急性肺損傷模型,結(jié)果表明,20 μg/mL LPS處理RAW 264.7細(xì)胞,可誘導(dǎo)RAW 264.7向M1狀態(tài)極化分泌IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α等促炎細(xì)胞因子,產(chǎn)生ROS,誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),炎性因子的大量釋放進(jìn)一步加劇了活性氧的累積,細(xì)胞質(zhì)膜完整性受損,將LDH迅速釋放至細(xì)胞外,導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡;昆明小鼠以1 mg/kg LPS滴鼻給藥,可誘導(dǎo)小鼠肺組織濕干重比升高呈現(xiàn)肺水腫,大量釋放促炎細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激產(chǎn)物,降低抗氧化酶的活性。這提示,LPS成功建立小鼠體內(nèi)外急性肺損傷模型。

金蕎麥?zhǔn)俏覈?guó)首先發(fā)掘的一種新型抗感染藥物,能安全及有效地提升呼吸系統(tǒng)健康,具有多種有益機(jī)體健康的藥理活性,其中黃酮類成分具有極高的抗炎與抗氧化能力[21-27]。據(jù)報(bào)道,黃酮類成分可通過降低M1巨噬細(xì)胞比例和增加M2巨噬細(xì)胞比例來(lái)發(fā)揮抗炎作用[28-29]。研究表明,表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2狀態(tài)極化,降低LPS給藥的肺微環(huán)境中促炎M1介質(zhì)iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá),減輕了8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、硝基酪氨酸的表達(dá),表明其抗炎和抑制氧化損傷的能力[30];鳶尾黃酮可抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和M1極化,減少腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和M1極化來(lái)抑制腎臟炎癥[31]。以上研究表明,抑制巨噬細(xì)胞的M1極化可有效調(diào)節(jié)炎癥損傷。因此,我們推測(cè)金蕎麥黃酮可作為一種綠色保健食品預(yù)防人類和動(dòng)物急性肺損傷的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),金蕎麥總黃酮能通過上調(diào)RAW 264.7細(xì)胞和小鼠血清中抗氧化酶的活力,提高抗氧化基因的表達(dá),進(jìn)而清除LPS積累的ROS和H2O2,減少ROS氧化多不飽和脂肪酸產(chǎn)生的MDA,繼而減輕小鼠肺組織和RAW 264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。金蕎麥總黃酮還可有效抑制RAW 264.7細(xì)胞M1極化,從而減少小鼠血清和細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α等的過度分泌;通過抵御LPS對(duì)RAW 264.7細(xì)胞質(zhì)膜完整性的破壞,減少LDH以及促炎因子釋放至胞外。這表明,金蕎麥總黃酮發(fā)揮其抗炎、抗氧化及抗凋亡的作用向巨噬細(xì)胞M1狀態(tài)極化、保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膜的完整性從而緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。

3 結(jié)論

本研究采用LPS構(gòu)建小鼠急性肺損傷及RAW 264.7細(xì)胞損傷模型,通過觀察氧化生物標(biāo)志物、炎性因子指標(biāo)的變化及細(xì)胞凋亡率,探討金蕎麥總黃酮對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的影響。研究發(fā)現(xiàn),金蕎麥總黃酮能有效升高LPS誘導(dǎo)的抗氧化酶SOD和CAT的活力,提高抗氧化基因GSH的表達(dá),進(jìn)而清除積累的ROS、MDA和H2O2抵御氧化損傷;金蕎麥總黃酮能明顯抑制巨噬細(xì)胞向M1極化,減少促炎介質(zhì)的分泌,從而減輕炎癥損傷;金蕎麥總黃酮通過保障細(xì)胞活力、減少LDH的釋放并保護(hù)細(xì)胞膜的完整性,從而抑制細(xì)胞凋亡;金蕎麥總黃酮通過降低小鼠肺干濕比重從而緩解肺組織水腫。綜上表明,金蕎麥總黃酮具有抗炎、抗氧化及抗凋亡作用,能緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷,為金蕎麥總黃酮作為功能性食品、綠色保健品的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。