響應(yīng)面優(yōu)化提取海蒿子多酚及其抗氧化和抗糖尿病活性分析

謝星,王樂(lè)懷,林文靜,劉曉歡,張露,涂宗財(cái),2*

1(江西師范大學(xué) 健康學(xué)院,江西 南昌,330022)

2(南昌大學(xué),食品科學(xué)與資源挖掘?qū)嶒?yàn)室,江西 南昌,330047)

海蒿子是一種可食用的高品質(zhì)海洋資源,其廣泛種植于我國(guó)遼寧和山東等地區(qū)。據(jù)《中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)詞典》記載,海蒿子可用于治療痰濁、內(nèi)熱、高血壓等疾病[1]。多酚是海蒿子中重要的功能活性成分,其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力等活性[2]。目前關(guān)于海蒿子多酚提取的研究較少,課題組前期采用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、70%乙醇和70%丙酮水溶液對(duì)海蒿子多酚進(jìn)行了常溫浸提,其多酚含量為2.12～6.25 mg GAE/g E[3][沒(méi)食子酸(gallic acid,GAE),E表示提取物]。YE等[4]用乙醇對(duì)海蒿子多酚進(jìn)行浸提,其多酚含量為5.34 mg CHA/g E[綠原酸(chlorogenic acid,CHA)]。YU等[5]以甲醇-氯仿(體積比2∶1)為溶劑對(duì)海蒿子多酚進(jìn)行了浸提,獲得的多酚含量為6.54 mg GAE/g E。綜上所述,現(xiàn)有提取海蒿子多酚的方法均為常溫浸提,且得率較低,限制了海蒿子多酚的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用,亟需開(kāi)發(fā)一種高效提取海蒿子多酚的方法。常溫浸提等傳統(tǒng)多酚提取方法的缺點(diǎn)在于時(shí)間長(zhǎng)、有機(jī)溶劑的使用量大和能耗高,而超聲提取作為一種綠色高效的提取方法,具有使用溶劑少、溶劑兼容性強(qiáng)和多酚得率高等優(yōu)點(diǎn)[6]。林樅雨等[7]研究了浸提法、超聲和微波輔助提取對(duì)玉米芯多酚得率的影響,結(jié)果表明超聲輔助提取法效果最好。另外,與丙酮、氯仿和甲醇等有機(jī)溶劑相比,乙醇具有毒性低、對(duì)環(huán)境影響小和價(jià)格便宜等優(yōu)勢(shì),是植物中提取多酚最常用的溶劑[8]。因此,以乙醇作為溶劑超聲優(yōu)化提取海蒿子多酚對(duì)其開(kāi)發(fā)具有重要的意義。

糖尿病是全球四大慢性疾病之一,會(huì)造成機(jī)體代謝紊亂并引發(fā)糖尿病并發(fā)癥[9]。截止2021年,全球糖尿病患者已達(dá)5.37億,中國(guó)的糖尿病患者居世界首位。α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitors,AGIs)是臨床上預(yù)防和治療Ⅱ型糖尿病的一線藥物。二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4,DPP-Ⅳ)抑制劑可提高腸胰高血糖素樣肽-1和葡萄糖依賴(lài)性促胰島素分泌多肽的能力,增加胰島素的釋放,起到抗糖尿病的作用[10]。氧化應(yīng)激會(huì)造成機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的自由基,引起胰島素的敏感性降低,加重胰島素抵抗的程度[11]。強(qiáng)抗氧化活性的抗糖尿病活性成分更有助于糖尿病的防治。然而,常用的合成類(lèi)抗糖尿病藥物如阿卡波糖和沙格列汀等具有嚴(yán)重的副作用,如腸胃道脹氣、腹部不適和惡心等[12]。多酚,作為可食用植物中的主要活性成分,是抗糖尿病劑和抗氧化劑的潛在來(lái)源,具有高效、安全和副作用小的特點(diǎn),也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。因此,評(píng)價(jià)海蒿子多酚的抗氧化、α-葡萄糖苷酶和DPP-Ⅳ酶抑制活性對(duì)其作為多靶點(diǎn)抗糖尿病藥物或者膳食添加劑進(jìn)行應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)作用。

本論文首先采用響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取海蒿子多酚,獲得最佳提取工藝;然后分別運(yùn)用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇對(duì)最佳工藝提取的多酚進(jìn)行富集,得到不同的萃取組分并測(cè)定其總酚含量;通過(guò)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)海蒿子多酚及其萃取組分的抗氧化活性;采用α-葡萄糖苷酶和DPP-Ⅳ酶抑制活性評(píng)估其抗糖尿病活性,旨在促進(jìn)海蒿子多酚的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蒿子,山東省青島市;無(wú)水乙醇、福林酚、乙酸乙酯、正丁醇等,天津市大茂化學(xué)試劑廠;槲皮素、DPPH、ABTS、阿卡波糖、4-硝基苯基-β-D-葡萄糖酸、α-葡萄糖苷酶、DPP-Ⅳ酶、Gly-Pro-PNA等,美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海榮生有限公司;Varioskam Flash型酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司;KQ-300DE超聲儀,昆山市超聲儀器公司;KA-1000型高速離心機(jī),上海安亭儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 海蒿子多酚的超聲提取工藝

稱(chēng)取5 g海蒿子粉末于250 mL的錐形瓶中,以料液比1∶30(g∶mL)加入乙醇溶液,混勻后按照設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行超聲提取,所得提取液于5 000 r/min下離心5 min,收集上清液,在50 ℃下減壓濃縮,用50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液定容到50 mL,得到海蒿子提取物,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 單因素試驗(yàn)

稱(chēng)取5 g海蒿子粉末,按照1.3.1節(jié)的方法進(jìn)行超聲提取,分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度和超聲功率對(duì)海蒿子中多酚提取得率的影響。乙醇體積分?jǐn)?shù):0%、10%、20%、30%、50%、70%、90%;提取時(shí)間:30、50、70、90、110 min;提取溫度:20、30、40、50、60 ℃;超聲功率為:280、420、490、560、700 W。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)海蒿子超聲提取工藝進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化(表1)。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平

1.3.4 不同溶劑萃取物的制備

稱(chēng)取20 g海蒿子粉末于錐形瓶中,用響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行提取,離心后收集提取液,減壓濃縮至干,獲得海蒿子多酚提取物。用盡量少的水溶解海蒿子多酚提取物,依次用2倍體積的二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次,收集萃取液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮,凍干,獲得不同溶劑萃取物。以50%乙醇作為溶劑配制不同溶劑萃取液,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 海蒿子總酚含量的測(cè)定

參考謝星等[13]測(cè)定海蒿子樣品的總酚含量(total phenolics content,TPC)。以蒸餾水代替體系中的福林酚試劑為樣品空白,用沒(méi)食子酸(10～70 μg/mL)做為標(biāo)準(zhǔn)品制作曲線,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為毫克沒(méi)食子酸當(dāng)量每克褐藻提取物(mg GAE/g E)。

1.3.6 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考彭春彥等[14]的方法測(cè)定海蒿子樣品的DPPH自由基清除能力。取100 μL不同濃度的海蒿子樣品于96孔酶標(biāo)板上,加入100 μL 0.15 mmol/L DPPH溶液,混勻后在常溫避光的條件下反應(yīng)30 min,于510 nm下測(cè)量混合物吸光值。以50%乙醇溶液代替體系中的DPPH溶液為空白對(duì)照組,不加海蒿子樣品為控制組。以水溶性維生素E(Trolox)為標(biāo)準(zhǔn)品制作曲線,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為微摩爾Trolox每克提取物(μmol TE/g E)。

1.3.7 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力測(cè)定

參考彭春彥等[14]的方法測(cè)定海蒿子樣品的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。ABTS工作液用7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液進(jìn)行配制,配制完成后在常溫下避光反應(yīng)12～16 h,將其稀釋至在765 nm下的吸光值為0.7±0.2后備用。將50 μL不同濃度的海蒿子樣品加入到96孔酶標(biāo)板上,再加入150 μL ABTS工作液進(jìn)行混勻,在常溫下反應(yīng)6 min后于765 nm下檢測(cè)吸光值。以蒸餾水代替體系中的ABTS工作液作為海蒿子樣品空白,不添加海蒿子樣品為控制組。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的計(jì)算如公式(1)所示:

ABTS陽(yáng)離子自由基清除率/%=[1-(AS-AB)/AC]×100

(1)

式中:AC、AS和AB分別表示反應(yīng)體系中控制組、海蒿子樣品組和空白組的吸光值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用IC50表示。

1.3.8 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

參考ZHANG等[15]的方法測(cè)定海蒿子樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性。將50 μL不同濃度的海蒿子樣品和50 μL α-葡萄糖苷酶溶液于96孔酶標(biāo)板上混勻,常溫下反應(yīng)10 min,再加入50 μL 5.0 mmol/L的對(duì)硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷溶液,反應(yīng)10 min后添加100 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng),于405 nm下測(cè)定樣品的吸光值。以蒸餾水代替α-葡萄糖苷酶溶液為空白對(duì)照組,不加海蒿子樣品為控制組。α-葡萄糖苷酶抑制率的計(jì)算如公式(2)所示:

α-葡萄糖苷酶抑制率/%=[1-(Asa-Abl)/Aco]×100

(2)

式中:Aco、Asa和Abl分別為反應(yīng)體系中控制組、海蒿子樣品組和空白組的吸光值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用IC50表示。

1.3.9 DPP-Ⅳ酶抑制活性測(cè)定

參考LI等[16]的方法測(cè)定海蒿子樣品的DPP-Ⅳ酶抑制能力。將50 μL海蒿子樣品或者陽(yáng)性對(duì)照品加入到96孔酶標(biāo)板中,再添加40 μL DPP-Ⅳ酶(2.5 mg/mL,0.1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl buffer配制),混勻后于37 ℃下孵育10 min,添加20 μL 5 mmol/L Gly-Pro-PNA(0.1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl buffer配制)溶液,反應(yīng)30 min,再加入100 μL 0.1 mol/L NaHCO3溶液終止反應(yīng),在405 nm下測(cè)定樣品的吸光值。以0.1 mol/L pH 8.0 Tris-HCl buffer代替DPP-Ⅳ酶為樣品空白,Sitagliptin為陽(yáng)性對(duì)照品。DPP-Ⅳ酶抑制率的計(jì)算公式同公式(2),實(shí)驗(yàn)結(jié)果用IC50表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。通過(guò)方差分析和Scheffe Test檢驗(yàn)(P<0.05)確定海蒿子樣品總酚含量和生物活性之間的差異性。運(yùn)用Origin軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖,采用Pearson相關(guān)性系數(shù)分析海蒿子樣品中多酚與抗氧化和抗糖尿病活性的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素條件對(duì)海蒿子多酚含量的影響

2.1.1 超聲時(shí)間

如圖1-A所示,海蒿子的多酚含量在50 min的時(shí)候達(dá)到峰值。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),海蒿子的多酚含量有所降低,但是在90 min后趨于穩(wěn)定。這主要是由于長(zhǎng)時(shí)間超聲會(huì)產(chǎn)生大量的熱量,從而造成部分多酚的降解。因此,海蒿子多酚超聲提取時(shí)間選擇30～70 min比較適宜。

A-超聲時(shí)間;B-乙醇體積分?jǐn)?shù);C-提取溫度;D-超聲功率

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)

如圖1-B所示,海蒿子多酚含量在乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)達(dá)到最高值,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而不斷下降。這表明低體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液更容易提取海蒿子中的多酚。因此,超聲提取海蒿子多酚的乙醇體積分?jǐn)?shù)控制在0%～20%比較合適。

2.1.3 提取溫度

如圖1-C所示,海蒿子多酚含量隨提取溫度的升高而顯著增加,在40 ℃的時(shí)候達(dá)到最高值,而后隨著溫度升高有所下降。高溫會(huì)促進(jìn)多酚類(lèi)化合物的降解,使其分解成其他化合物[17]。因此,海蒿子提取溫度控制在30～50 ℃較為適宜。

2.1.4 超聲功率

如圖1-D所示,海蒿子多酚含量隨著超聲功率的增加出現(xiàn)先增加再減少后增加的趨勢(shì)。這主要是由于在超聲功率低于1 000 W時(shí),超聲波空穴效應(yīng)和熱效應(yīng)會(huì)促進(jìn)植物細(xì)胞壁中多酚的溶出,而過(guò)大的功率會(huì)破壞多酚的分子結(jié)構(gòu)[18]。因此,超聲提取海蒿子多酚的功率控制在420～560 W比較合適。

2.2 超聲輔助提取海蒿子多酚的響應(yīng)面優(yōu)化工藝

2.2.1 模型擬合與數(shù)據(jù)分析

為進(jìn)一步優(yōu)化4個(gè)單因素的海蒿子多酚提取工藝,選用響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行了29組實(shí)驗(yàn),其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。采用Design experts version軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行了響應(yīng)面回歸擬合分析,得到的回歸方程如下:

表2 BBD 設(shè)計(jì)和總酚含量的實(shí)驗(yàn)及預(yù)測(cè)結(jié)果

表3 方差分析表

Y=1.73-0.12X1+0.09X2+0.10X3+0.005 8X4-0.10X1X2+0.077X1X3-0.05X1X4+ 0.075X2X3+0.04X2X4+0.022X3X4-0.36X12-0.22X22-0.24X32-0.27X42

由表3可知,F值為42.16,且P<0.000 1,表明模型合理;海蒿子多酚含量的失擬項(xiàng)P=0.097>0.05,表明失擬不顯著。回歸模型決定系數(shù)R2=0.976 8,表明該回歸模型與實(shí)際情況擬合程度較好;R2adj=0.953 7,表明該回歸模型能反映95.37%響應(yīng)值的變化;C.V.=4.32%,說(shuō)明該回歸模型可靠,可用于預(yù)測(cè)海蒿子多酚含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外,該回歸模型中的一次項(xiàng)X1、X2和X3對(duì)海蒿子多酚含量極顯著,交互項(xiàng)X1×X3和X2×X3對(duì)海蒿子多酚含量顯著,X12、X22、X32和X42對(duì)海蒿子多酚含量極顯著。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

等高線圖和曲面圖能反應(yīng)因素之間的交互作用,圖形越陡峭表明兩者之間的交互作用越顯著[19]。由圖2可以看出,乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間和超聲功率的交互作用均不顯著(P>0.05);超聲功率與提取溫度和提取時(shí)間的交互作用也均不顯著(P>0.05)。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的升高,海蒿子多酚含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),且圖形陡峭程度明顯。此外,海蒿子多酚含量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)和提取溫度的提高也出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。因此,以上結(jié)果表明提取溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的交互作用顯著(P<0.05)。

圖2 因素間相互作用對(duì)海蒿子總酚含量影響的響應(yīng)面曲面圖

2.2.3 模型驗(yàn)證

經(jīng)過(guò)Design experts version軟件計(jì)算得到響應(yīng)面超聲優(yōu)化提取海蒿子中多酚類(lèi)化合物的最佳工藝:乙醇體積分?jǐn)?shù)8.5%;提取時(shí)間55 min;提取溫度42 ℃;超聲功率494 W。在此優(yōu)化條件下得到的海蒿子多酚含量為1.81 mg GAE/g DM,與理論預(yù)測(cè)值很接近,因此該響應(yīng)面優(yōu)化模型得到的海蒿子多酚最佳提取條件準(zhǔn)確且有效。

2.3 粗提物和不同萃取組分總酚含量分析

海蒿子多酚粗提物及其萃取組分的總酚含量如圖3所示,正丁醇相的總酚含量最高,為24.45 mg GAE/g E;乙酸乙酯相的總酚含量最低,為6.05 mg GAE/g E。相比于粗提物,二氯甲烷相、正丁醇和水相的總酚含量分別提高了0.27、0.47和0.37倍,且它們之間無(wú)顯著性差異。以上結(jié)果表明,正丁醇對(duì)海蒿子中多酚的富集效果最佳。根據(jù)超聲提取優(yōu)化結(jié)果可知,海蒿子中水溶性多酚含量較高,這可能是造成正丁醇和水相中總酚含量較高的主要原因。TANNA等[20]測(cè)定了4種褐藻的總酚含量,其值為9～15 mg GAE/g,顯著低于本研究結(jié)果。

圖3 海蒿子多酚粗提物及其萃取組分的總酚含量

2.4 粗提物和不同萃取組分的抗氧化活性分析

DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力是評(píng)價(jià)多酚提取物抗氧化活性最常用的指標(biāo)。如圖4-A所示,海蒿子多酚粗提取及其萃取組分的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的升高不斷增強(qiáng),呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。二氯甲烷相(249.22 μg/mL)表現(xiàn)出最強(qiáng)的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力,其次為正丁醇相(374.15 μg/mL)和水相(422.47 μg/mL),乙酸乙酯相(1 303.68 μg/mL)的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力最低。其中,二氯甲烷相的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力分別是乙酸乙酯相和粗提物的5.23和2.72倍。另外,陽(yáng)性對(duì)照組抗壞血酸的IC50為11.76 μg/mL,其值顯著低于海蒿子多酚提取物及其萃取組分,表現(xiàn)出更強(qiáng)的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。如圖4-B所示,以標(biāo)準(zhǔn)品Trolox的當(dāng)量評(píng)價(jià)海蒿子粗提物及其萃取組分的DPPH自由基清除能力,其DPPH值為18.79～49.34 μmol TE/g,其活性的強(qiáng)弱順序?yàn)?二氯甲烷相>正丁醇相>粗提物>水相=乙酸乙酯相。同ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的結(jié)果一致,二氯甲烷相有最強(qiáng)DPPH自由基清除能力,其值是粗提物的1.53倍。以上結(jié)果表明二氯甲烷對(duì)海蒿子中抗氧化活性成分具有最好的富集效果。

A-海蒿子多酚粗提物及其萃取組分的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力;B-海蒿子多酚粗提物及其萃取組分的DPPH自由基清除能力

皮爾森相關(guān)性分析表明,海蒿子多酚粗提取及其萃取組分的總酚含量與DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的相關(guān)性系數(shù)分別為0.526和-0.963,說(shuō)明多酚是海蒿子中主要的抗氧化成分。這與2.3節(jié)的分析結(jié)果是一致的,二氯甲烷和正丁醇相均有較高的總酚含量。研究已表明海蒿子中的多酚如槲皮素糖苷、咖啡酸衍生物具有較高的響應(yīng)值,且研究發(fā)現(xiàn)這些化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性,這可能是海蒿子多酚萃取組分活性較好的原因[3,21]。

2.5 粗提物和不同萃取組分的α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

α-葡萄糖苷酶能催化二糖(麥芽糖和蔗糖)水解為單糖(葡萄糖和果糖),抑制其活性可顯著降低餐后和空腹血糖,達(dá)到預(yù)防和治療糖尿病的目的[22]。本論文采用了α-葡萄糖苷酶抑制活性評(píng)估海蒿子多酚提取物及其萃取組分的抗糖尿病活性,其結(jié)果見(jiàn)圖5。隨著海蒿子多酚粗提物及其萃取組分濃度的增加,其α-葡萄糖苷酶抑制活性不斷增強(qiáng),且活性均強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組阿卡波糖。二氯甲烷和乙酸乙酯相的IC50最低,為84.83、91.21 μg/mL;正丁醇相的IC50最高,為617.07 μg/mL。粗提物和水相的α-葡萄糖苷酶抑制活性無(wú)顯著性差異,其IC50分別為106.87、127.68 μg/mL。海蒿子多酚粗提物及其萃取組分的活性約為阿卡波糖的1.42～10.33倍,二氯甲烷和乙酸乙酯對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制劑的富集效果最佳。以上結(jié)果表明海蒿子粗提物和萃取組分均是優(yōu)質(zhì)的α-葡萄糖苷酶抑制劑,可作為抗糖尿病藥物的替代品進(jìn)行開(kāi)發(fā)。相關(guān)性分析表明,α-葡萄糖苷酶抑制活性和總酚含量呈中度相關(guān)(r=0.489)。前期研究發(fā)現(xiàn)槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸是海蒿子中主要成分,且有很強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制能力,其可能對(duì)海蒿子多酚提取物及其萃取組分的活性起到重要的作用[23]。

圖5 海蒿子多酚粗提物及其萃取組分的α-葡萄糖苷酶抑制活性

2.6 粗提物和不同萃取組分的DPP-Ⅳ酶抑制活性分析

DPP-Ⅳ是人體組織中的一種代謝酶,抑制其活性可延長(zhǎng)胰高血糖素樣肽-1和促胰島素多肽的作用并穩(wěn)定血糖水平,達(dá)到抗糖尿病的效果[24]。由圖6可知,海蒿子多酚粗提物3個(gè)萃取相抑制DPP-Ⅳ酶活性呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性,但其活性低于陽(yáng)性對(duì)照西他列汀。乙酸乙酯相的DPP-Ⅳ酶抑制活性最強(qiáng),其IC50為25.83 μg/mL;二氯甲烷相和正丁醇相次之,其IC50分別為210.67、667.61 μg/mL;其中乙酸乙酯相的活性為正丁醇相的25.85倍。海蒿子粗提物和水相的DPP-Ⅳ酶抑制活性均較弱,其IC50均高于5 mg/mL。以上結(jié)果表明,乙酸乙酯對(duì)海蒿子多酚提取物中的DPP-Ⅳ酶抑制劑富集效果最好。與α-葡萄糖苷酶的結(jié)果一致,乙酸乙酯相是海蒿子多酚提取物萃取組分中抗糖尿病活性成分的最佳來(lái)源。相關(guān)性分析也表明,海蒿子樣品的α-葡萄糖苷酶和DPP-Ⅳ酶抑制活性呈高度相關(guān)(r=0.956)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,圍式馬尾藻和匍枝馬尾藻均是馬尾藻屬的褐藻,和海蒿子為同一個(gè)種屬,其甲醇提取物抑制DPP-Ⅳ酶活性的IC50為38.27、36.94 μg/mL,顯著高于海蒿子多酚提取物乙酸乙酯相[25]。研究表明黃酮和酚酸等多酚均是優(yōu)質(zhì)DPP-Ⅳ酶抑制劑的良好來(lái)源,海蒿子多酚可能對(duì)DPP-Ⅳ酶抑制活性具有很大的貢獻(xiàn)[26]。

圖6 海蒿子多酚粗提物及其萃取組分的DPP-Ⅳ酶抑制活性

3 結(jié)論

本研究得到了響應(yīng)面超聲輔助提取海蒿子多酚的最佳工藝,并分析了海蒿子多酚粗提物及其萃取組分的抗氧化和抗糖尿病活性。本研究獲得的海蒿子多酚的最佳提取工藝如下:乙醇體積分?jǐn)?shù)為8.5%,提取時(shí)間為55 min,提取溫度為42 ℃,超聲功率為494 W,得到的海蒿子多酚含量為1.81 mg GAE/g DM,與理論預(yù)測(cè)值很接近,表明該模型可用于預(yù)測(cè)海蒿子多酚得率。海蒿子粗提物正丁醇相有最高的總酚含量(24.45 mg GAE/g E)。抗氧化分析結(jié)果表明,二氯甲烷相的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力最強(qiáng),分別是粗提物的1.53和2.72倍?？寡趸钚院涂偡雍砍尸F(xiàn)出高度的相關(guān)性,表明多酚是海蒿子中主要的抗氧化成分。海蒿子粗提物和萃取組分的α-葡萄糖苷酶抑制活性均強(qiáng)于阿卡波糖,二氯甲烷和乙酸乙酯相的活性最好。乙酸乙酯相的DPP-Ⅳ酶抑制活性最強(qiáng),該溶劑萃取海蒿子中抗糖尿病活性成分的效果最佳。綜上所述,海蒿子多酚是抗氧化劑和抗糖尿劑的潛在來(lái)源,超聲輔助提取能顯著提高海蒿子多酚的得率,本研究可為其作為預(yù)防和治療糖尿病的藥物或健康食品開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。