低聚糖對植物乳桿菌AUH2103抑菌作用的影響

嚴浩東,張臣臣,2,徐晶晶,陳大衛(wèi),2,康文麗,潘麗娜,唐溶雪,李威,顧瑞霞,2*

1(揚州大學 食品科學與工程學院,江蘇 揚州,225000)

2(揚州大學,江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室,江蘇 揚州,225000)

3(澳優(yōu)乳業(yè)(中國)有限公司,湖南 長沙,410127)

4(人體微生態(tài)制品湖南省工程研究中心,湖南 長沙,410127)

人體是由真核細胞與體內(nèi)共生的微生物共同組成的“超級生物體”[1]。腸道菌群與宿主健康密切相關(guān),甚至被認為是“被忽略的人體器官”。腸道菌群通過調(diào)節(jié)免疫功能[2]、保護腸道[3]、調(diào)節(jié)各類營養(yǎng)素代謝[4]等對機體健康產(chǎn)生重要影響。大量疾病和身體不適與腸道微生物息息相關(guān)。

益生菌可以定植在腸道內(nèi),從而影響腸道菌群的組成,其對于外源病原微生物的抵抗作用得到越來越多的重視。益生菌抑菌的作用機理包括競爭性代謝相互作用、宿主的免疫反應和抑制腸道黏附[5];此外,也有研究發(fā)現(xiàn),有些益生菌存在信號分子干擾機制,通過釋放某些信號分子從而將病原微生物從腸道內(nèi)排除[6]。

益生元是一類可以供益生菌選擇性利用的基質(zhì),可以賦予某些健康益處[7],最為常見的益生元有低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)和低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS),它們發(fā)揮作用的主要方式是定向的增殖乳酸桿菌或雙歧桿菌。這些低聚糖很容易被乳酸菌中普遍存在的β-果糖苷酶、β-半乳糖苷酶降解[8],通過定向的被某些菌株利用,從而增加這部分菌株在腸道微生物群落中的占比。另外,來自母乳的低聚糖也被認為對新生兒腸道微生物群和免疫系統(tǒng)發(fā)育有著至關(guān)重要的作用[9-10],2′-巖藻糖基乳糖(2′-focusllactose,2′-FL)是常見的一類人乳低聚糖,2′-FL在腸胃道水平上具有增強腸道免疫和屏障的功能[11-12]。但是不同低聚糖對不同益生菌菌株抑菌能力的影響作用仍待探究。

植物乳桿菌AUH2103是一株分離自母乳的菌株,本研究擬探究2′-FL等低聚糖對植物乳桿菌AUH2103致病菌的抑制能力的影響作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS):純度>95%,量子高科(中國)生物股份有限公司;(2′-FL):純度>95%,德國BASF公司。

MRS培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20,蛋白胨 10,無水乙酸鈉 5,MgSO4·7H2O 0.2,MnSO4·7H20 0.05,K2HPO4·7H2O 2,檸檬酸二銨 2,酵母膏 5,牛肉膏 10,吐溫-80 1 mL。固體培養(yǎng)基添加2%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂粉。

低聚糖MRS培養(yǎng)基:以20 g/L的低聚糖代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖。

LB培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,酵母粉5,氯化鈉10。固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉。

DMEM完全培養(yǎng)液:80%(體積分數(shù))DMEM,20%(體積分數(shù))優(yōu)質(zhì)胎牛血清。

1.2 儀器與設(shè)備

BXP-16恒溫培養(yǎng)箱,上海力辰邦儀器科技有限公司;JF-SX-500型全自動滅菌鍋,日本TOMY公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司;HERACELL二氧化碳培養(yǎng)箱,美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株和細胞株的培養(yǎng)

植物乳桿菌AUH2103是由江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室分離自母乳(CGMCC 23527)。將該菌株以3%的接種量在37 ℃的MRS肉湯中培養(yǎng)18 h,在MRS固體平板中分離純化3次后,備用。

大腸桿菌ATCC 25922T,鼠傷寒沙門氏菌CMCC 50115T,蠟樣芽胞桿菌ATCC 11778T和金黃色葡萄球菌ATCC 6538T是由江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室保存的,將這些菌株在LB肉湯搖床培養(yǎng)12 h后,在LB固體平板中分離純化3次后,備用。

Caco-2(人結(jié)腸腺癌)細胞是由江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室保存。Caco-2細胞在補充有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后,使用無菌PBS清洗3次,從塑料培養(yǎng)瓶中去除未貼壁的細胞,然后用0.25%(體積分數(shù))的胰蛋白酶處理,傳代至15～20代。將細胞密度調(diào)整為5×106cells/mL,接種200 μL至24孔板中,在37 ℃ 5%(體積分數(shù))CO2的條件下允許細胞完全生長分化并形成完整的屏障。

1.3.2 植物乳桿菌AUH2103的培養(yǎng)抑菌能力

采用單層瓊脂平板擴散法[13],將30 mL滅菌的LB固體培養(yǎng)基傾注于培養(yǎng)皿中,待其充分凝固后用無菌三角涂布棒將預先稀釋至1×107CFU/mL的4種致病菌菌懸液100 μL均勻涂布。用打孔器均勻等距打孔,向各孔內(nèi)注入200 μL待測樣品,并做好標記。加樣結(jié)束后將培養(yǎng)皿正置于18 ℃培養(yǎng)箱,待其充分擴散過夜,再將平板移至37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后測量抑菌圈直徑。

1.3.3 植物乳桿菌AUH2103的黏附能力測定

參照文獻方法[14]并改進,補充有10%(體積分數(shù))FBS的DMEM用于培養(yǎng)細胞。將Caco-2細胞接種在24孔板中,并在37 ℃下孵育直至形成單層膜。在含有不同種類不同濃度的低聚糖的PBS中洗滌菌體2次,并以終濃度109CFU/mL進行重懸;將100 μL細菌懸浮液加入Caco-2培養(yǎng)板孔中,并在37 ℃下孵育2 h;用PBS洗滌Caco-2細胞3次以去除未黏附的細菌,然后加入50 μL 0.25%胰蛋白酶-EDTA以裂解細胞。最后,將每個孔的混合物接種在MRS瓊脂平板上以計數(shù)黏附的細菌。

1.3.4 低聚糖對黏附能力的影響

為了研究不同種類,不同質(zhì)量濃度的低聚糖對于植物乳桿菌AUH2103對Caco-2細胞的黏附能力的影響,將不同質(zhì)量濃度不同種類的低聚糖進行復配,觀察復配后低聚糖是否具有更好的促進Caco-2細胞黏附能力的作用。使用含有不同質(zhì)量濃度的低聚糖組合的PBS溶液洗滌菌體(表1),并以終濃度109CFU/mL進行重懸,按照1.3.3節(jié)的方法培養(yǎng)細胞并進行黏附試驗。

表1 復配低聚糖各組別中的低聚糖占比

1.3.5 致病菌黏附

按照以往的研究進行改進[15],植物乳桿菌AUH2103在37 ℃下培養(yǎng)18 h后,離心取菌體,使用PBS清洗2次后,使用對應的低聚糖溶液重懸菌體,備用。

大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌在搖床上培養(yǎng)以37 ℃,160 r/min的條件下培養(yǎng)12 h后,離心取菌體,使用PBS溶液清洗2次后,使用對應的低聚糖溶液重懸菌體,備用。

單獨黏附:用PBS(pH 7.2)清洗單層細胞2次,每孔加入200 μL的致病菌懸液(約為1.5×109CFU),懸浮溶液分別為PBS、含2′-FL PBS以及含低聚糖組合PBS,在37 ℃,5%CO2和95%相對濕度的條件下與細胞共同孵育2 h。用PBS(pH 7.2)洗滌3次單層膜,以除去未結(jié)合的細菌,加入150 μL 0.25%胰蛋白酶消化液,在37 ℃下消化 15 min后,向每個孔中加入350 μL補充有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。連續(xù)10倍梯度稀釋,采用平板菌落計數(shù)法檢驗活菌數(shù),所計活菌數(shù)即為黏附于細胞上的細菌數(shù)目。

競爭黏附:用PBS(pH 7.2)清洗單層細胞2次,每孔加入200 μL的致病菌和AUH2103混合菌懸液(指示菌約為1.5×109CFU),懸浮溶液分別為PBS、含2′-FL PBS(5 g/L)以及含低聚糖組合PBS,在37 ℃,5% CO2和95%相對濕度的條件下與細胞共同孵育2 h。用PBS(pH 7.2)洗滌3次單層膜,以除去未結(jié)合的細菌,加入150 μL 0.25%胰蛋白酶消化液,在37 ℃下消化15 min后,向每個孔中加入350 μL補充有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。連續(xù)10倍梯度稀釋,采用平板菌落計數(shù)法檢驗活菌數(shù),所計活菌數(shù)即為黏附于細胞上的細菌數(shù)目。

排斥黏附:用PBS(pH 7.2)清洗單層細胞2次,每孔先后加入200 μL的致病菌(經(jīng)測定含致病菌約為1.5×109CFU)和AUH2103混合菌,懸液懸浮溶液分別為PBS、含2′-FL PBS以及含低聚糖組合PBS,在37 ℃,5% CO2和95%相對濕度的條件下與細胞共同各孵育1 h。用PBS(pH 7.2)洗滌3次單層膜,以除去未結(jié)合的細菌,加入150 μL 0.25%胰蛋白酶消化液,在37 ℃下消化15 min后,向每個孔中加入350 μL補充有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。連續(xù)10倍梯度稀釋,采用平板菌落計數(shù)法檢驗活菌數(shù),所計活菌數(shù)即為黏附于細胞上的細菌數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌AUH2103發(fā)酵液的抑菌能力

為了評估不同低聚糖對于植物乳桿菌AUH2103發(fā)酵液抑制致病菌能力的影響,本實驗將MRS培養(yǎng)基中的碳源由葡萄糖替換為等比例的低聚糖進行發(fā)酵,最后使用單層瓊脂擴散法測試發(fā)酵液的抑菌能力。測試結(jié)果如表2所示,替換碳源對于發(fā)酵液抑菌效果的能力影響較小,對于蠟樣芽孢桿菌而言,將碳源替換GOS后的抑菌效果與MRS組無顯著性差異(P>0.05),對于金黃色葡萄球菌而言,將碳源替換為FOS或GOS后的抑菌效果均與MRS組無顯著性差異(P>0.05),對于大腸桿菌和沙門桿菌而言,結(jié)果與上述的情況類似,MRS組均具有較好的抑菌效果,碳源替換為GOS和FOS后的抑菌效果出現(xiàn)了變化,但這種變化較小,但是,對于所有4種指示菌而言,將碳源替換為2′-FL后,抑菌效果均不明顯。這與植物乳桿菌AUH2103對碳源的利用能力有關(guān),植物乳桿菌AUH2103在以2′-FL作為碳源的培養(yǎng)基中生長不良[16],發(fā)酵液的pH值無法降低,從而沒有抑菌效果。本實驗結(jié)果表明,植物乳桿菌AUH2103發(fā)酵液的主要抑菌原理為產(chǎn)酸抑制,對于培養(yǎng)基中碳源的利用能力是影響發(fā)酵液pH的主要因素。對GOS和FOS的利用可能并未產(chǎn)生額外的抑菌物質(zhì)。

表2 不同碳源對于植物乳桿菌AUH2103抑菌能力的影響

2.2 低聚糖對植物乳桿菌AUH2103細胞黏附的促進作用

2.2.1 單種低聚糖的作用

以往的研究表明,益生菌與致病菌在體內(nèi)的相互作用,除了直接產(chǎn)酸抑制致病菌生長外,還可以通過黏附腸道細胞形成腸道屏障后,阻止致病菌與腸道細胞的接觸,例如中性高分子質(zhì)量和低分子質(zhì)量的寡糖(主要是巖藻糖基化的)抑制了單核細胞增生李斯特菌對Caco-2的黏附力[17]。細菌對于上皮細胞的黏附被認為是益生菌菌株的選擇標準之一,而Caco-2細胞是目前應用較為廣泛的細胞系[18-20]。本試驗考察在不同濃度、不同種類的低聚糖存在的情況下,植物乳桿菌AUH2103對于Caco-2細胞黏附能力的影響,這可以模擬體內(nèi)益生菌形成保護腸道細胞的腸道黏膜的情況。表3結(jié)果顯示,在添加FOS的組別中,當FOS的濃度為5 g/L時,植物乳桿菌AUH2103的黏附能力最強,黏附后的活菌數(shù)達到了6.43×107CFU/mL;在添加GOS的組別中,當GOS濃度為5 g/L時,植物乳桿菌AUH2103的黏附能力最強,黏附后的活菌數(shù)達到了6.13×107CFU/mL;在添加2′-FL的組別中,當2′-FL濃度為5 g/L時,植物乳桿菌AUH2103的黏附能力最強,黏附后的活菌數(shù)達到了5.68×107CFU/mL。黏附機制則通常分為兩方面,一些菌株可以與細胞上的特定位點進行特異性的相互作用而結(jié)合,而另一些菌株則是由于非特異性作用所導致的[21]。部分研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌通常是通過表面相關(guān)蛋白或其他因素與宿主細胞進行黏附或直接作用從而引發(fā)下游反應[22]。因此,可能低聚糖通過觸發(fā)與細胞相互作用的表面黏附蛋白的基因表達,進而促進乳酸菌對Caco-2細胞的黏附能力[23]。

表3 植物乳桿菌AUH2103進行細胞黏附時添加低聚糖的影響

2.2.2 復配低聚糖對黏附的促進作用

低聚糖經(jīng)過復配后,可能存在協(xié)同作用,由表4可知,在所有組別中,組別B對于植物乳桿菌AUH2103的黏附能力提高效果最好,黏附的活菌數(shù)達到了1.45×108CFU/mL,顯著高于其他組別(P<0.05)。在植物乳桿菌AUH2103孵育時添加復配低聚糖可以顯著提高菌株細胞黏附能力,其中植物乳桿菌AUH2103在組別B的黏附的活菌數(shù)最高,即FOS含量為0.5 g/L、GOS含量為0.5 g/L和2′-FL 含量為2 g/L時,可以顯著提高植物乳桿菌AUH2103對于Caco-2細胞的體外黏附能力。這項結(jié)果顯示,在Caco-2細胞與植物乳桿菌AUH2103共同孵育時添加低聚糖,可以提高植物乳桿菌AUH2103的黏附能力。

表4 添加復配低聚糖對植物乳桿菌AUH2103對細胞黏附能力的影響

2.3 復配低聚糖和植物乳桿菌AUH2103對致病菌黏附的抑制

益生菌在腸道細胞中形成腸道屏障后,可以有效阻止侵襲型的腸道病原菌與腸道細胞接觸,從而降低病原菌侵襲腸道從而導致疾病的概率。此前通過Caco-2細胞黏附試驗已經(jīng)證明,在低聚糖存在的情況下,植物乳桿菌AUH2103對于Caco-2細胞的黏附能力有所提高。選擇此前試驗中已經(jīng)確認可以顯著提高黏附能力的低聚糖配方和目前研究較多的2′-FL作為低聚糖干預組,觀察其是否具有保護Caco-2細胞免受病原微生物黏附的能力。黏附試驗模擬2種常見的情況,第一種為競爭性黏附,即乳酸菌與病原微生物同時存在的情況下,觀察乳酸菌的存在是否會降低病原微生物的黏附效果。第二種為排斥性黏附,即乳酸菌先對Caco-2細胞進行黏附后,觀察致病菌的黏附是否有所降低。

2.3.1 低聚糖對于致病菌黏附的影響

結(jié)果圖1所示,對比不添加低聚糖的單獨黏附組,對于大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌而言,添加2′-FL干預可以促進其黏附能力;而添加復配低聚糖則可以促進沙門氏菌對于細胞的黏附;金黃色葡萄球菌的黏附則被2種添加的低聚糖抑制。結(jié)果顯示出了明顯的菌株特異性,這種情況在目前的研究中較為常見,例如FACINELLI等[24]的研究顯示,在存在6′-巖藻糖基乳糖和2′-唾液酸乳糖的情況下,大腸桿菌對于Caco-2細胞的黏附顯著降低。2種低聚糖對非傷寒沙門氏菌未觀察到積極影響。CILIEBORG等[25]的研究顯示,使用2′-FL可以抑制大腸桿菌F18對于腸上皮細胞的體外黏附。

圖1 低聚糖對致病菌黏附能力的影響

2.3.2 低聚糖對植物乳桿菌AUH2103與致病菌競爭黏附影響

競爭性黏附試驗如圖2所示,添加2′-FL后,致病菌的黏附數(shù)下降的最多,顯著低于其他組別(P<0.05)。沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的黏附結(jié)果顯示,低聚糖干預可以有效降低沙門氏菌的黏附量,但是兩種低聚糖干預后的結(jié)果并無顯著性差異(P>0.05)。蠟樣芽胞桿菌的結(jié)果則顯示,無論添加低聚糖與否,對于其黏附能力均無顯著影響。結(jié)果顯示出了明顯的菌株特異性。

圖2 低聚糖對植物乳桿菌AUH2103競爭黏附抑菌能力的影響

此外,JANKOWSKA等[26]的研究發(fā)現(xiàn),益生菌對于致病菌的競爭性抑制存在著時效性,當孵化時間不同時,競爭性抑制的效果會發(fā)生變化。競爭性抑制存在著較為明顯的菌株特異性,不同的益生菌對于不同的致病菌菌株的結(jié)果差異較大。

2.3.3 低聚糖對植物乳桿菌AUH2103與致病菌排斥黏附的影響

排斥黏附的結(jié)果如圖3所示,提前使用植物乳桿菌AUH2103進行黏附后,對于所有致病菌的黏附效果均有顯著的降低效果。這種降低效果也存在的很明顯的菌株特異性,對于大腸桿菌和沙門氏菌而言,添加低聚糖與直接使用菌株干預并無顯著性差異(P>0.05),蠟樣芽胞桿菌的黏附結(jié)果顯示,使用2′-FL干預后,其黏附數(shù)量與其他項組別相比顯著下降(P<0.05)。金黃色葡萄球菌的結(jié)果則顯示,低聚糖可以有效降低其黏附數(shù),但是量種低聚糖之間并無顯著性差異(P>0.05)。在JAYASHREE等[27]的研究中,發(fā)現(xiàn)一株發(fā)酵乳桿菌也具有排斥耐甲氧西林金黃色葡萄球菌黏附Caco-2細胞的現(xiàn)象,而COCONNIER等[28]的研究則發(fā)現(xiàn),一株嗜酸乳桿菌以濃度依賴性的方式抑制了鼠傷寒沙門氏菌和腸道致病性大腸桿菌(EPEC)對于Caco-2細胞的結(jié)合,這種抑制的機制可能是是由于乳酸菌阻止了致病菌與細胞上的受體相結(jié)合,而不是通過特異性的阻斷受體導致的。

3 結(jié)論與討論

植物乳桿菌AUH2103在以不同低聚糖為主要碳源時,對致病菌的抑制能力與低聚糖的利用能力有關(guān)。在低聚糖存在的情況下,植物乳桿菌AUH2103可以更好地黏附Caco-2細胞;競爭性黏附和排斥性黏附試驗表明,在低聚糖存在的情況下,植物乳桿菌AUH2103可以有效抑制致病菌對于Caco-2細胞的黏附效果。低聚糖,尤其是2′-FL通過協(xié)助黏附,與植物乳桿菌AUH2103發(fā)揮協(xié)同抑菌作用。本文提供了植物乳桿菌AUH2103在體外對致病菌黏附細胞具有抑制效果的作用,以此為基礎(chǔ)可以進一步進行動物實驗對植物乳桿菌AUH2103在體內(nèi)是否具有相關(guān)作用進行探索。