磁性多壁碳納米管—微生物聯(lián)合修復(fù)石油污染土壤

李志文，許湘湘，劉帥，楊妮楠，曹迪

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

石油是全球主要能源，在民生和國防科技等方面都起著重要的支撐作用。由于石油開采、運(yùn)輸過程中存在技術(shù)不成熟、操作不當(dāng)?shù)葐栴}，因此造成石油資源浪費(fèi)的現(xiàn)象，同時(shí)還導(dǎo)致嚴(yán)重的石油污染問題[1-2]。石油烴成分復(fù)雜，有揮發(fā)性，含碳量高，不易降解，能夠在環(huán)境中持續(xù)穩(wěn)定存在，一旦石油流入土壤中，對農(nóng)作物、植物、人類乃至整個(gè)土壤生態(tài)系統(tǒng)都會產(chǎn)生惡劣的影響[3]。當(dāng)石油烴物質(zhì)流入到土壤后，會改變土壤的理化性質(zhì)和持水性[4]、對土壤中的微生物代謝活動產(chǎn)生影響并破壞土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)[5]。除此之外，石油烴的滲入會使土壤的滲透性降低，進(jìn)而抑制粘附在植物根系的根系呼吸與吸收，最后導(dǎo)致植物根系腐爛[6]。隨著工業(yè)化技術(shù)的不斷發(fā)展，人類對石油的需求日益增加，石油污染問題也隨之愈演愈烈，特別是針對于土壤的污染問題，因此急需探究更為有效的方法解決石油土壤污染問題。

目前，石油污染土壤的修復(fù)技術(shù)主要有物理、化學(xué)和微生物修復(fù)技術(shù)，其中微生物修復(fù)技術(shù)由于不會造成二次污染而被廣泛研究[7]。但是當(dāng)一些功能性石油降解微生物投放到石油污染土壤中可能會受到土壤環(huán)境與土著微生物的影響致使降解率降低，物理吸附法中的一種載體即多壁碳納米管的應(yīng)用則可以輔助石油降解微生物更好修復(fù)石油污染土壤。多壁碳納米管吸附性強(qiáng)，化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對重金屬離子和有機(jī)污染物方面都呈現(xiàn)出優(yōu)良的吸附效果。多壁碳納米管的吸附性能主要受到吸附位點(diǎn)、比表面積、表面功能團(tuán)、純度、孔隙度等結(jié)構(gòu)特征的影響。且多壁碳納米管的表面結(jié)構(gòu)具有化學(xué)惰性的特點(diǎn)，這一特點(diǎn)恰好使其具備了明確的吸附位點(diǎn)，具有更強(qiáng)的吸附能力和更廣泛的吸附范圍[8-9]。磁處理與吸附劑相結(jié)合是近幾年的熱點(diǎn)。魏棲梧等[10]制備出的磁性多壁碳納米管有效引入了含氧官能團(tuán)（-COOH）及磁性Fe-O 基團(tuán)，對水溶液中Cu（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）及Pb（Ⅱ）呈現(xiàn)出良好的吸附分離效果。趙偉高[11]通過液相化學(xué)沉積法制備的磁性多壁碳納米管具有超順磁性和良好的磁分離特性，在四環(huán)素（TC）和銅離子的吸附研究中保持了良好的吸附性能。磁性多壁碳納米管在對染料的吸附研究中也表現(xiàn)出來明顯的吸附性能[12-13]。

基于以上研究，選用兩種不同的磁性氧化晶體Fe3O4和MnFe2O4對多壁碳納米管進(jìn)行磁化處理并與已篩選得到的高效石油降解菌聯(lián)合修復(fù)石油污染土壤。對制備的磁性多壁碳納米管進(jìn)行關(guān)于SEM、FTIR、Zeta、XPS 的表面特征分析，測定不同的磁性多壁碳納米管和高效石油降解菌的組合下對石油污染土壤的降解率，同時(shí)測定了土壤的含水量、銨態(tài)氮和有效磷的變化。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株：石油降解菌LD23（假單胞菌Pseudomonas）（降解率為47.72%）、NYJ3.6（偽產(chǎn)堿假單胞菌 Pseudomonas pseudoalcaligenes）（降解率為43.46%）均為已保藏菌株，目前保藏于中科院微生物菌種保藏所，保藏號分別為CGMCC No.1679、CGMCC No.17570。

無機(jī)鹽原油培養(yǎng)基：KH2PO43.0 g，Na2HPO4·2H2O 8.5 g，NH4Cl 1.0 g，Mg2SO4·7H2O 0.49 g，CaCl20.011 g，NaCl 10 g，液體石蠟2%（V/W），pH 自然，蒸餾水定容至1 L。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂20.0 g，酵母浸粉5.0 g，pH 調(diào)節(jié)至7，蒸餾水定容至1 L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 兩種磁性碳納米管的制備

兩種磁性碳納米管的制備方法對比：Fe3O4/碳納米管（CF）和MnFe2O4/碳納米管（CM）制備方法主要是賦磁材料不同，CF 為FeCl3·6H2O 和FeCl2·H2O，CM 賦磁材料為MnCl2·4H2O 和FeCl3·6H2O，兩種方法的賦磁材料摩爾質(zhì)量比均為2∶1，將賦磁材料和多壁碳納米管（CMT）于去離子水中混合均勻后放入超聲振蕩清洗機(jī)超聲振蕩30 min。在85 ℃恒溫水浴鍋中加入一定量5 mol·L-1的NaOH 溶液攪拌混勻后，將燒杯放入磁力攪拌器于50 ℃條件下攪拌半小時(shí)。攪拌后靜置、除上清并烘干沉淀。用去離子水沖洗至上清液pH 到7，可去除Cl-、Na+等離子。將清洗后的沉淀放入烘箱并放入自封袋保存。

1.2.2 兩種磁性碳納米管的表征分析

對制備好的Fe3O4/碳納米管和MnFe2O4/碳納米管進(jìn)行表面特征分析。利用掃描電子顯微鏡FEG-250 分析表面形態(tài)，Zeta 電位ASP 型電位分析儀測定表面電荷、紅外光譜儀（FTIR）分析測定表面官能團(tuán)、X 射線光電子能普（XPS）進(jìn)行表面元素分析。

1.2.3 不同處理方式對土壤理化指標(biāo)的影響

菌液的制備：所用的菌株材料準(zhǔn)備將已純化的菌株在其處于對數(shù)生長期時(shí)以10%的菌量制作菌懸液并接種于100 mL 的石油發(fā)酵培養(yǎng)基中（每株菌接6 瓶平行實(shí)驗(yàn)，3 瓶用于紫外分光光度法，3 瓶用于稱重法），以空白石油發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，在搖床中150 rpm 培養(yǎng)7 d。

每個(gè)花盆均添加392 g 的土壤和8 g 的石油（配制成2%的石油濃度），再加入一定量的蒸餾水充分混合均勻后，分別添加1 g 不同的磁性碳納米管和8mL 不同的菌液，靜置7 d。四種不同處理組方法包括：LD23 菌液和Fe3O4/碳納米管（CF）、NYJ3.6 菌液和Fe3O4/碳納米管（CF）、LD23 菌液和MnFe2O4/碳納米管（CM）、NYJ3.6 菌液和MnFe2O4/碳納米管（CM），以未加石油的土壤和未做處理的石油污染土壤為對照。

對不同處理方式前后的土壤進(jìn)行土壤含水量，土壤有機(jī)質(zhì)測定。其中土壤含水量測定為常規(guī)測定方法，土壤有機(jī)質(zhì)的測定（銨態(tài)氮和有效磷）采用河南云飛科技發(fā)展有限公司的YF300 土壤養(yǎng)分檢測儀測定。

1.2.4 不同處理方式下石油降解率的測定

利用三點(diǎn)取樣法稱取5 g 帶原油的土壤，使用10 mL 石油醚與土壤剩余的原油一并倒入分液漏斗中，加蓋充分振搖2 min 并注意放氣，靜置分層2 min；用石油醚層將培養(yǎng)液反復(fù)萃取3 次，將萃取液放在塞有少許脫脂棉且上面放有無水硫酸鈉的漏斗過濾，過濾液放置至50 mL 定容瓶中，并用石油醚進(jìn)行定容。定容液用紫外分光光度計(jì)在600 nm 條件下測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 多壁碳納米管磁處理前后的表征

2.1.1 SEM 結(jié)果

采用場發(fā)射掃描電鏡（SEM）對多壁碳納米管（CMT）、MnFe2O4/碳納米管（CM）與Fe3O4/碳納米管（CF）表面形貌進(jìn)行觀察，結(jié)果如下圖所示。圖1 顯示三種多壁碳納米管均呈無規(guī)則聚集，且之間存在許多網(wǎng)狀空隙。圖1-a 顯示多壁碳納米管表面光滑，幾乎沒有黑色粒狀的雜質(zhì)。圖1-c 顯示MnFe2O4/碳納米管（CM）附著了少量的黑色顆粒狀物質(zhì)，而圖1-b顯示Fe3O4/碳納米管（CF）則附著大量黑色顆粒狀物質(zhì)，導(dǎo)致Fe3O4/碳納米管（CF）表面相較于多壁碳納米管（CMT）更加粗糙。

圖1 不同多壁碳納米管的SEM 圖Fig.1 SEM images of different multi-walled carbon nanotubes

2.1.2 FTIR 結(jié)果

通過傅里葉紅外光譜（FTIR）對多壁碳納米管（CMT）、Fe3O4/多壁碳納米管（CF）與MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）進(jìn)行表征。根據(jù)圖2 可知，多壁碳納米管（CMT）在1 630 cm-1處出現(xiàn)了強(qiáng)烈的C=O 振動收縮峰，由此說明多壁碳納米管的表面含有-COOH 和-OH 的表面官能團(tuán)。與多壁碳納米管（CMT）的FTIR圖相比顯示，F(xiàn)e3O4/多壁碳納米管（CF）與MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）均在560 cm-1出現(xiàn)Fe-O 的振動收縮峰，由此可證明，有磁性物質(zhì)成功附著在碳納米管的表面。除此之外，F(xiàn)e3O4/多壁碳納米管（CF）與MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）中2 850 cm-1處的振動吸收峰O-H 的消失可能是因?yàn)槎啾谔技{米管（CMT）的部分結(jié)構(gòu)被改變[14]。

圖2 不同多壁碳納米管的FTIR 譜圖Fig.2 FTIR images of different multi-walled carbon nanotubes

2.1.3 Zeta 結(jié)果

Zeta 電位能夠測定吸附劑表面電荷性，當(dāng)吸附劑表面的陽離子數(shù)量多于陰離子數(shù)量時(shí)，表面帶正電荷，當(dāng)陰離子數(shù)量多于陽離子數(shù)量時(shí)，則表面帶負(fù)電荷[15]。從圖3 中可以發(fā)現(xiàn)將磁性介質(zhì)加入到多壁碳納米管（CMT）后，Zeta 電位明顯向負(fù)電位偏移，說明Fe3O4/多壁碳納米管（CF）與MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）表面電荷均為負(fù)電荷，且MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）的Zeta 電位低于Fe3O4/多壁碳納米管（CF）的Zeta 電位，由此可說明，磁性介質(zhì)會影響多壁碳納米管的聚集強(qiáng)度，且MnFe2O4/多壁碳納米管相比于Fe3O4/多壁碳納米管在更大程度上改變了多壁碳納米管的膠體分散系的穩(wěn)定性，即MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）穩(wěn)定性更好。

圖3 不同多壁碳納米管的Zeta 電位圖Fig.3 Zeta images of different multi-walled carbon nanotubes

2.1.4 XPS 結(jié)果

X 射線光電子能譜（XPS）能夠?qū)Σ煌啾谔技{米管表面的元素進(jìn)行鑒定分析[16-17]。根據(jù)圖4 可知，多壁碳納米管（CMT）、Fe3O4/多壁碳納米管（CF）與MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）的XPS 圖譜均出現(xiàn)了C1s 和O1s 的伸縮振動峰，由此說明，賦磁前后的多壁碳納米管表面的主要元素都為碳和氧。其次，F(xiàn)e3O4/多壁碳納米管（CF）與MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）的XPS 圖譜都觀察到Fe2p 的伸縮振動峰，表明磁性介質(zhì)已與多壁碳納米管（CMT）相結(jié)合[18]。

圖4 不同多壁碳納米管的XPS 圖Fig.4 XPS images of different multi-walled carbon nanotubes

2.2 不同處理?xiàng)l件對土壤理化性質(zhì)的影響

2.2.1 不同處理?xiàng)l件對土壤含水量的影響

土壤含水量的變化可以代表石油污染土壤環(huán)境的改善程度。被石油污染以及投放石油降解菌和磁性碳納米管的土壤含水量如表1 所示。從表1 中可以觀察到空白組（未被石油污染）土壤含水量為46.02%，當(dāng)土壤與石油混合后，含水量顯著下降，這是由于石油污染物具有疏水性強(qiáng)，密度小，黏性強(qiáng)等特點(diǎn)，致使石油與土壤顆粒粘連在一起，堵塞土壤孔道，從而導(dǎo)致土壤蓄水能力不足[19]。除空白組外，其余均是被石油污染7 天后所測得土壤含水量。表1 結(jié)果顯示，添加Fe3O4/多壁碳納米管（CF）的實(shí)驗(yàn)組中土壤含水量高于17%，添加MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）的實(shí)驗(yàn)組中土壤含水量則低于25%，即MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）所修復(fù)土壤的含水量普遍低于Fe3O4/多壁碳納米管（CF）所修復(fù)土壤的含水量。這說明Fe3O4/多壁碳納米管（CF）對石油的吸附效果相比于MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）更加明顯。除此之外，還可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)LD23 與兩種不同磁性碳納米管晶體聯(lián)合修復(fù)時(shí)，土壤含水量均能夠保持最高。并且在SEM 表征結(jié)果分析中，CF 的表面要比CM 更加粗糙，即CF 的表面存在更多的磁性介質(zhì)，大量的磁性介質(zhì)顆粒有助于促進(jìn)CF 吸附石油的效果。

表1 不同處理對土壤理化性質(zhì)的影響Table 1 Effects of different treatments on soil water content

2.2.2 不同處理?xiàng)l件對土壤有機(jī)質(zhì)的影響

表2 顯示土壤中銨態(tài)氮和有效磷的含量在被石油污染后明顯下降。7 d 后對比實(shí)驗(yàn)組與空白組發(fā)現(xiàn)添加LD23 的土壤相比于添加NYJ3.6 的土壤來說，其銨態(tài)氮和有效磷的含量較高一些，這可能是因?yàn)長D23 降解活性高于NYJ3.6，導(dǎo)致在此處理?xiàng)l件下，在石油污染土壤中LD23 活性更高。還可以觀察到Fe3O4/多壁碳納米管（CF）修復(fù)的土壤的銨態(tài)氮和有效磷含量比MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）所修復(fù)土壤的含量要高得多，這可能因?yàn)镕e2O4/多壁碳納米管（CF）的附磁晶體嵌入碳納米管的效果要比MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）好，這與SEM 和FTIR 表征分析結(jié)果相一致。結(jié)果表明，同時(shí)添加LD23 與Fe3O4/多壁碳納米管（CF）石油污染土壤時(shí)，這將更利于石油污染土壤生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)。

表2 處理后的土壤有機(jī)質(zhì)各項(xiàng)指標(biāo)變化Table 2 Changes of indexes of soil organic matter after treatment

2.3 不同處理對石油降解率的影響

2.3.1 石油降解菌生長曲線的測定

由圖5 可以看到，搖床培養(yǎng)14 h 后，石油降解菌NYJ3.6 和LD23 開始進(jìn)入穩(wěn)定期，將此時(shí)定義為向石油污染的土壤中投放菌株的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

圖5 石油降解菌NYJ3.6 和LD23 的生長曲線Fig.5 Growth curves of petroleum degrading bacteria NYJ3.6 and LD23

2.3.2 土壤中石油降解率的測定

根據(jù)表3 可以發(fā)現(xiàn)，同時(shí)添加NYJ3.6 和MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）至石油污染的土壤時(shí)，其石油降解率偏低；同時(shí)添加LD23 和Fe3O4/多壁碳納米管（CF）后，其石油降解效果最為明顯。結(jié)果表明不同石油降解菌與多壁磁性碳納米管聯(lián)合修復(fù)效果比單加石油降解菌的修復(fù)效果顯著增強(qiáng)，達(dá)到了預(yù)計(jì)的聯(lián)合修復(fù)效果。這也可以說明添加MnFe2O4/多壁碳納米管（CM）或者Fe3O4/多壁碳納米管（CF）后，能夠?yàn)榻到饩峁┠承I養(yǎng)，有效促進(jìn)兩種石油降解菌的降解效果。

表3 土壤石油降解率測定結(jié)果Table 3 Determination results of soil oil degradation rate

3 討論

許多研究表明，多壁碳納米管由多層石墨烯構(gòu)成且層與層之間有缺陷，相對于單層多壁碳納米管來說更容易使得磁性氧化鐵嵌入其中[20-21]。通過液相沉淀法制備磁性多壁碳納米管后，再利用SEM、FTIR、Zeta、XPS 對改性前后的多壁碳納米管進(jìn)行表征分析，表征結(jié)果均可證明通過附加磁性氧化鐵可以改變碳納米管在水中的聚集程度，而且氧化基團(tuán)的增加對于碳納米管的穩(wěn)定性具有很大的幫助。但由于制備工藝的限制導(dǎo)致MnFe2O4的結(jié)晶程度沒有那么理想。Fe3O4/多壁碳納米管的Zeta 電位與其相比較小可能是由于MnFe2O4晶體的合成溫度比較高[22]。當(dāng)石油泄漏滲透至土壤里，會導(dǎo)致土壤含水量降低，影響土壤本身的理化性質(zhì)，致使土壤中所含有的一些土著菌無法進(jìn)行正常的代謝活動，從而降低土著菌的石油降解率。研究中，多壁磁性碳納米管的超順磁性能夠增大對土壤中的石油吸附效果，石油降解菌利用本身降解特性對土壤中的石油有效降解，物理修復(fù)與生物修復(fù)的聯(lián)合促使土壤中石油更快的吸附和降解。除此之外，添加磁性多壁碳納米管不僅可以吸附土壤中的石油，還可以為投入的部分石油降解菌提供一些營養(yǎng)元素，強(qiáng)化石油污染物的降解[23]。

4 結(jié)論

結(jié)果最終篩選得到LD23 和Fe3O4/多壁碳納米管（CF）、NYJ3.6 和Fe3O4/多壁碳納米管（CF）兩種微生物和物理的聯(lián)合修復(fù)方法，這種聯(lián)合修復(fù)技術(shù)不僅不會破壞土壤的土質(zhì)，修復(fù)過程中還可以增加土壤中的有機(jī)質(zhì)成分。

目前為止，對石油污染土壤的修復(fù)技術(shù)研究頗多，但是使用物理吸附載體即磁性多壁碳納米管與石油降解微生物聯(lián)合修復(fù)石油污染土壤的研究較少，為聯(lián)合修復(fù)石油研究提供重要的數(shù)據(jù)。