泰山黃精寄生真菌的分離鑒定

穆淑媛 付均惠 秦 寧 董 斌 龐獻(xiàn)偉 仉 勁

黃精（Polygonatum sibiricumRed.）， 又 名 老 虎姜、仙人余糧，為百合科黃精屬多年生草本植物，是泰山四大名藥之一，在國(guó)內(nèi)享有盛譽(yù)。黃精以其根莖入藥，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾潤(rùn)肺、益腎的功效，在我國(guó)已有2 000 多年的藥用歷史。 其根莖富含多糖、脂肪、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、維生素等，兼具藥用和食用價(jià)值， 國(guó)內(nèi)研發(fā)了多種具有保健功能的黃精食品、飲品、護(hù)膚品等。目前在四川、貴州、安徽、河南、遼寧等地已有規(guī)模化人工栽培，山東泰安、威海等地也得到快速發(fā)展。但隨著集中栽培規(guī)模的不斷擴(kuò)大，黃精病害也日益嚴(yán)重，影響了黃精的產(chǎn)量和質(zhì)量。已報(bào)道的黃精病害主要有葉斑病、炭疽病、葉枯病、根腐病、花腐病、病毒病等，以真菌病害為主，但目前對(duì)泰山黃精病害的研究較少。 筆者對(duì)泰安市林業(yè)局實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)人工栽培的泰山黃精的寄生真菌進(jìn)行了分離與鑒定，為病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 2021 年6 月，在泰安市林業(yè)局實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)黃精栽培基地采集泰山黃精病株7 株。

1.2 方法

1.2.1 真菌分離 將不同癥狀的病葉、 病根用清水清洗晾干后，用75%酒精浸沒消毒30 s，0.1%升汞浸沒消毒1 min，無菌水清洗3 遍，用無菌吸水紙吸取葉片水分后， 剪取病健交界部放到PDA 培養(yǎng)皿上，28 ℃避光培養(yǎng)3~5 d， 觀察同一培養(yǎng)物上長(zhǎng)出的菌落顏色、形狀等是否相同，若有則進(jìn)一步分離純化，直至長(zhǎng)出單一菌落。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 觀察PDA 培養(yǎng)基上菌落的顏色、形態(tài)變化，并在光學(xué)顯微鏡下觀察記錄孢子形態(tài)特征。 查閱《真菌鑒定手冊(cè)》等，初步鑒定菌株種類。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 用真菌基因組DNA 提取試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）提取菌株的基因組DNA。 ITS 序列PCR 擴(kuò)增體系：2.5 μL 10×PCR Buffer、2 μL dNTPs（10 mmol/L）、1 μL ITS1、1 μL ITS4、0.25 μL Taq 酶、1 μL DNA 模板，17.25 μL ddH2O。 擴(kuò)增程序：94 ℃4 min，94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，33 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min，4 ℃保存。 ITS 序列通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 的合成及PCR 反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序均由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。通過NCBI-Nucleotide BLAST 分析測(cè)序結(jié)果， 以相似度最高的序列作為參考序列，根據(jù)Per.Ident 值確定目的菌株分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 寄生真菌分離結(jié)果 從采集樣品中共分離出18皿真菌（圖1），對(duì)分離出的寄生真菌菌落形態(tài)特征觀察記錄并統(tǒng)計(jì)（表1），分析可知，18 株菌株可歸為11組。

表1 泰山黃精寄生真菌的菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)和菌落形態(tài)

圖1 泰山黃精寄生真菌的菌落形態(tài)圖

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 由表2 可知， 各菌株ITS 序列與參考序列的相似值均超過99%， 可初步認(rèn)定為同一種。 綜合分析表1~2、圖2 可知，分離出鏈格孢屬真菌共7 株，占菌落總數(shù)的38.89%，其中包括細(xì)極鏈格孢菌2 株，交互鏈格孢菌5 株；分離出刺盤孢屬真菌共6 株，占菌落總數(shù)的27.78%，其中包括旋卷蔥刺盤孢菌2 株、山茶刺盤孢菌2 株、膠孢炭疽菌1 株； 鐮刀菌屬真菌2 株， 占菌落總數(shù)的11.11%；此外還分離出聚生小穴殼菌、高粱附球菌、Diaporthe eres、數(shù)絲頂多毛孢各1 株。

表2 寄生真菌ITS 序列在NCBI 庫中的比對(duì)結(jié)果

因此，可初步認(rèn)定，泰安市林業(yè)局實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)人工栽培黃精的優(yōu)勢(shì)寄生種為鏈格孢屬真菌和刺盤孢屬真菌， 且有包括鐮刀菌在內(nèi)的其他多種寄生真菌混合侵染。

3 討論與結(jié)論

本研究確定泰山黃精的葉部病害主要致病菌為鏈格孢屬和刺盤孢屬真菌。 刺盤孢屬真菌能引起黃精炭疽病，但對(duì)葉斑病病原菌研究有不同觀點(diǎn)，主要認(rèn)為葉斑病的病原菌有交互鏈格孢菌（A.alternata）、細(xì)極鏈格孢菌（A.tenuissima）、葉點(diǎn)霉屬（Phyllostictasp. sp）等。 因此，根據(jù)本次分離鑒定結(jié)果和發(fā)病癥狀，初步認(rèn)為鏈格孢菌侵染泰山黃精引起葉斑病、刺盤孢屬真菌引起黃精炭疽病， 在防治泰山黃精病害時(shí)，應(yīng)以鏈格孢屬和刺盤孢屬真菌為主，篩選敏感藥劑，提高防治效果。