雙向孟德爾隨機(jī)化分析總膽固醇升高風(fēng)險(xiǎn)與膽石癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

趙偉偉， 杜曉旭， 戈宏焱

1 內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 通遼 028000

2 興平市湯坊鎮(zhèn)衛(wèi)生院， 陜西 興平 713100

3 內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 通遼 028000

膽石癥發(fā)病率在中西方國家都比較高，在西方國家一些大城市的醫(yī)院中，大約有10%的成年人患有膽石癥［1］。目前關(guān)于膽石癥的風(fēng)險(xiǎn)因素有很多研究，但在這些研究中存在互相矛盾的地方，如有的研究［2］認(rèn)為較低的總膽固醇水平是膽石癥的危險(xiǎn)因素，但有的研究［3］認(rèn)為較低膽固醇水平是膽石癥的保護(hù)性因素。關(guān)于膽石癥對(duì)總膽固醇水平的影響和因果關(guān)系尚未得到證實(shí)。已有的研究大多依靠傳統(tǒng)的觀察性研究得出關(guān)聯(lián)結(jié)論。傳統(tǒng)的觀察性研究由于本身的缺陷，受到大量混雜因素的干擾，因此本研究引入孟德爾隨機(jī)化（MR）來進(jìn)行因果推斷，MR利用等位基因在減數(shù)分裂時(shí)隨機(jī)分配到子代的原理模擬隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，從而規(guī)避了不同混雜因素對(duì)暴露和對(duì)照的影響［4］。MR在觀察性研究中使用遺傳變異作為工具變量來檢測和量化因果關(guān)系。本研究使用雙向孟德爾隨機(jī)化（bidirectional MR）來探索總膽固醇水平和膽石癥之間的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系和因果推斷。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與研究設(shè)計(jì) 通過搜索open gwas（https：//gwas.mrcieu.ac.uk/datasets）數(shù)據(jù)庫中有關(guān)總膽固醇水平和膽石癥相關(guān)的全基因組相關(guān)聯(lián)研究（GWAS）匯總數(shù)據(jù)，得到兩組樣本量相對(duì)較大和單核苷酸多態(tài)性（SNP）個(gè)數(shù)比較多的GWAS數(shù)據(jù)，具體信息見表1～2。將其中一組數(shù)據(jù)中的任意一個(gè)GWAS數(shù)據(jù)和另外一組數(shù)據(jù)中的任意一個(gè)GWAS數(shù)據(jù)進(jìn)行組合，得到四種不同的暴露和結(jié)局的組合。利用設(shè)計(jì)的bidirectional MR模型來評(píng)估暴露和結(jié)局（總膽固醇和膽石癥）之間的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系和因果推斷（圖1）。

表1 總膽固醇GWAS數(shù)據(jù)匯總信息Table 1 Summary of the GWAS data for total cholesterol

圖1 bidirectional MR的模型圖Figure 1 Model diagram of bidirectional Mendelian randomization

1.2 工具變量的選擇 從全基因組（GWAS）上獲得P＜5×10-8水平的與暴露相關(guān)的遺傳變異。該遺傳變異必須滿足MR分析的三大假設(shè)：（1）關(guān)聯(lián)性假設(shè)，SNP與暴露強(qiáng)相關(guān)；（2）獨(dú)立性假設(shè)，遺傳變異與影響“暴露和結(jié)局”的混雜因素相獨(dú)立；（3）排他性假設(shè)，遺傳變異只能通過暴露對(duì)結(jié)局發(fā)生作用，而不通過其他途徑。設(shè)置連鎖不平衡參數(shù)（r2＜0.001），即兩個(gè)SNP之間是完全連鎖平衡的（這兩個(gè)SNP的分配是完全隨機(jī)的），遺傳距離設(shè)定為10 000 kb以選擇SNP，從而確保其獨(dú)立性，并排除連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）對(duì)結(jié)果的影響。通過GWAS提取滿足MR三大假設(shè)的SNP，合并暴露與結(jié)局的數(shù)據(jù)集，并刪除回文SNP。最后剩余的SNP即為指代暴露的最佳工具變量。

1.3 bidirectional MR方案 本研究分為兩部分，第一部分分別以表1總膽固醇GWAS數(shù)據(jù)為暴露、表2膽石癥GWAS數(shù)據(jù)為結(jié)局，應(yīng)用MR分析方法中的Egger回歸法、中位數(shù)加權(quán)法、逆方差加權(quán)法隨機(jī)效應(yīng)模型和固定效應(yīng)模型等主要方法來初步計(jì)算因果效應(yīng)值（b值）、OR值及95%CI等。然后將上述暴露和結(jié)局調(diào)換，以膽石癥GWAS數(shù)據(jù)為暴露、以總膽固醇水平GWAS為結(jié)局進(jìn)行MR分析。第二部分將第一部分的數(shù)據(jù)去除異質(zhì)性后做同樣分析。

表2 膽石癥GWAS數(shù)據(jù)匯總信息Table 2 Summary of the GWAS data for cholelithiasis

1.4 敏感性分析 用MR分析R包對(duì)所涉及的SNP進(jìn)行Cochran’s Q檢驗(yàn)，用于評(píng)估個(gè)體遺傳變異之間的異質(zhì)性。如果Cochran’s Q檢驗(yàn)的P＜0.05，代表基因間存在異質(zhì)性可能。一般來說當(dāng)異質(zhì)性很大（P＜0.001）的時(shí)候，需要使用隨機(jī)效應(yīng)模型，當(dāng)異質(zhì)性小的時(shí)候，使用固定效應(yīng)模型。檢測SNP的水平多效性，當(dāng)P＜0.05代表存在水平多效性，即所挑選的工具變量通過暴露以外的途徑影響結(jié)局，違反了MR三大假設(shè)。計(jì)算MR-Egger法的截距值，Egger回歸中的截距估計(jì)值可以解釋為遺傳變異間的平均多效效應(yīng)的估計(jì)值［5］。當(dāng)截距值與零相差較大代表存在總體方向多效性［6］，可能導(dǎo)致有偏差的MR估計(jì)值，所以本研究中列出MR-Egger方法的截距項(xiàng)。用MR-PRESSO檢驗(yàn)去除離群的SNP后再進(jìn)行上述步驟，得到最終的因果效應(yīng)b值和OR值。

1.5 工具變量的評(píng)價(jià) 利用計(jì)算公式：R2=2×(1-MAF)(MAF)×其中，MAF為暴露的次要等位基因頻率，β為暴露的等位基因效應(yīng)值，SD為標(biāo)準(zhǔn)差。注意，參與F值計(jì)算的R2為所有SNP的R2相加之和，表示最終工具變量指代了暴露的比率。再利用公式：F=其中N為暴露的總樣本數(shù)，K為SNP個(gè)數(shù)，R2同上；F＞10即為強(qiáng)工具變量，F(xiàn)＜10為弱工具變量。在兩樣本MR研究中，I2GX統(tǒng)計(jì)量比傳統(tǒng)F統(tǒng)計(jì)量更合適MR-Egger回歸方法，用MR-Egger方法計(jì)算I2GX。對(duì)于Egger回歸法來說，I2GX值越高，檢測定向多效性和因果效應(yīng)的能力越強(qiáng)，弱工具變量偏差可能性越?。?］。以上所有方法學(xué)及可視化圖形均采用R 4.2.3版本獲得。

2 結(jié)果

2.1 總膽固醇水平和膽石癥之間因果關(guān)系的初步分析 以表1中GLGC或met的總膽固醇GWAS數(shù)據(jù)為暴露，用R軟件選擇P＜5×10-8的遺傳變異SNP位點(diǎn)進(jìn)行匯集，去除連鎖不平衡后，篩選出滿足MR三大假設(shè)的SNP。用這些篩選出的SNP提取表2中ukb或finn的膽石癥SNP為結(jié)局。以Egger回歸法、加權(quán)中位數(shù)法、逆方差加權(quán)法（IVW）隨機(jī)效應(yīng)模型、IVW固定效應(yīng)模型做兩樣本MR（圖2），結(jié)果均顯示因果效應(yīng)值b為負(fù)數(shù)，代表總膽固醇水平和膽石癥是負(fù)相關(guān)的，除了部分Egger方法P＞0.05外，大部分P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傮wOR＜1，其95%CI＜1，可知總膽固醇對(duì)膽石癥具有負(fù)向因果關(guān)系。

圖2 以總膽固醇為暴露、膽石癥為結(jié)局的MR結(jié)果圖Figure 2 MR results of 4 methods with TC as the exposure and cholelithiasis as the outcome

2.2 膽石癥和總膽固醇水平之間因果關(guān)系的初步分析以表2中ukb或finn的膽石癥GWAS數(shù)據(jù)為暴露，表1中GLGC或met的總膽固醇GWAS數(shù)據(jù)為結(jié)局得到MR結(jié)果（圖3），顯示因果效應(yīng)b值為負(fù)，代表膽石癥和總膽固醇是負(fù)相關(guān)，大部分P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傮wOR＜1，其95%CI＜1，可知膽石癥對(duì)總膽固醇具有負(fù)向因果關(guān)系。

圖3 以膽石癥為暴露、總膽固醇為結(jié)局的MR結(jié)果圖Figure 3 MR results of 4 methods with cholelithiasis as the exposure and TC as the outcome

2.3 刪除離群SNP前的工具變量評(píng)價(jià)以及異質(zhì)性分析利用R2及F值的計(jì)算公式，分別計(jì)算出每對(duì)暴露-結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)的總R2值和F值。F值均＞10（表3），證明本次研究所選取的所有工具變量均為強(qiáng)工具變量。由表2可見全部數(shù)據(jù)都存在異質(zhì)性（P值均＜0.05），可能會(huì)對(duì)MR分析結(jié)果產(chǎn)生偏差，因此需要去除異質(zhì)性后（即刪除離群SNP后）再進(jìn)行分析。雖然全部數(shù)據(jù)均不存在水平多效性（P值均＞0.05），但小部分?jǐn)?shù)據(jù)MR-Egger截距值與零相差較大，也不排除總體方向多效性的存在，可能會(huì)導(dǎo)致這部分MR分析結(jié)果的偏差，待去除離群SNP后觀察能否消除這部分?jǐn)?shù)據(jù)的偏倚。

表3 去除離群SNP前每對(duì)暴露-結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)的工具變量評(píng)價(jià)及異質(zhì)性分析結(jié)果Table 3 Results of R2，F(xiàn) and heterogeneity analysis for each pair of expose-outcome data before removing outlier SNP

2.4 總膽固醇和膽石癥之間去除異質(zhì)性后因果分析將以總膽固醇為暴露、膽石癥為結(jié)局所得到的SNP用MR-PRESSO方法去除離群SNP后再重復(fù)分析，可得MR結(jié)果（圖4），nSNP個(gè)數(shù)較前減少，b值均＜0，代表總膽固醇和膽石癥是負(fù)相關(guān)，大部分P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傮wOR＜1，其95%CI＜1，可知去除異質(zhì)性后總膽固醇水平對(duì)膽石癥仍具有負(fù)向因果關(guān)系。

圖4 以總膽固醇為暴露、膽石癥為結(jié)局去除異質(zhì)性后的MR結(jié)果圖Figure 4 MR results of 4 methods after removing heterogeneity with TC as the exposure and cholelithiasis as the outcome

2.5 膽石癥和總膽固醇之間去除異質(zhì)性后因果分析將以膽石癥為暴露、總膽固醇為結(jié)局所得到的SNP用MR-PRESSO方法去除離群SNP后再重復(fù)分析，可得MR結(jié)果（圖5），SNP個(gè)數(shù)較前減少，b值均＜0，代表膽石癥和總膽固醇是負(fù)相關(guān)的，大部分P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。總體OR＜1，其95%CI＜1，可知去除異質(zhì)性后膽石癥對(duì)總膽固醇仍具有負(fù)向因果關(guān)系。

圖5 以膽石癥為暴露、總膽固醇為結(jié)局去除異質(zhì)性后的MR結(jié)果圖Figure 5 MR results of 4 methods after romoving heterogeneity with cholelithiasis as the exposure and TC as the outcome

2.6 刪除離群SNP后工具變量評(píng)價(jià)以及異質(zhì)性分析可見去除異質(zhì)性后，所有工具變量的F值仍然＞10，P值得到很大提升，除了GLGC-finn和met-ukb這兩對(duì)暴露-結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)的異質(zhì)性較大（P＜0.05），其他的數(shù)據(jù)均不存在異質(zhì)性；多效性檢驗(yàn)顯示P值均＞0.05，提示均不存在水平多效性。ukb-GLGC和ukb-met存在I2GX等于0的情況，表明這兩組數(shù)據(jù)MR分析結(jié)果可能會(huì)產(chǎn)生弱工具偏差。ukb-GLGC這組數(shù)據(jù)的截距值與零相差較大（0.029），進(jìn)一步證明了其可能存在總體方向多效性，從而導(dǎo)致結(jié)果有偏差的可能（表4）。但大部分?jǐn)?shù)據(jù)既排除了多效性和異質(zhì)性，也非弱工具變量，因此確保了結(jié)果的可靠性。

表4 去除離群SNP后每對(duì)暴露-結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)的工具變量評(píng)價(jià)及異質(zhì)性Table 4 Results of R2，F(xiàn) and heterogeneity analysis for each pair of expose-outcome data after removing outlier SNP

2.7 去除異質(zhì)性前后四種MR方法的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 可見無論是否去除異質(zhì)性，IVW固定效應(yīng)模型均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)于IVW隨機(jī)效應(yīng)模型，去除異質(zhì)性后P值均＜0.05。說明總膽固醇和膽石癥之間具有雙向因果效應(yīng)的結(jié)論具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

圖6 去除異質(zhì)性前、后4種MR方法的P值改變Figure 6 The change of P values of MR before and after the removal of heterogeneity

3 討論

膽石癥影響著全世界10%～20%的成年人，是造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)最重的疾病之一［8］。Lammert等［9］確定了幾個(gè)外源性的危險(xiǎn)因素，包括代謝綜合征、飲食因素、膽囊功能低下、腸肝膽紅素循環(huán)和藥物，其中代謝因素的影響可能最大，因?yàn)榄h(huán)境因素可能通過調(diào)節(jié)代謝影響膽石癥。這些代謝性因素中，膽固醇水平與膽結(jié)石之間的相關(guān)性研究比較少。本研究基于bidirectional MR研究，探究總膽固醇水平和膽石癥之間的相互影響。

本次研究中所涉及到的GWAS數(shù)據(jù)均來自open gwas數(shù)據(jù)庫，涉及到的人群除了GLGC為混合人群外，其余均來自歐洲人群，最大程度降低人群分層給本研究帶來的影響。本研究所用數(shù)據(jù)研究不區(qū)分性別，但有研究［10］表明雌激素是膽石癥明顯的危險(xiǎn)因素，女性更容易患膽結(jié)石，下一步可研究不同性別的總膽固醇水平GWAS數(shù)據(jù)與膽石癥GWAS數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。

本研究分為兩部分，一部分為未去除異質(zhì)性探究暴露與結(jié)局的關(guān)系，另一部分為去除異質(zhì)性后探究暴露與結(jié)局的關(guān)系。以met和finn這組數(shù)據(jù)為例，其IVW_fe方法所得b＜0，OR=0.74，P=0.06。而去除異質(zhì)性后可得b＜0，OR=0.83，P=0.000 38，說明去除異質(zhì)性后，既能得出總膽固醇和膽石癥之間負(fù)相關(guān)，又有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，本研究中可以看到去除異質(zhì)性后MR-Egger方法并沒有之前有效的情況。以u(píng)kb-GLGC這組數(shù)據(jù)為例，去除異質(zhì)性后的MR-Egger方法P=0.095，其I2GX值為0，而未去除異質(zhì)性時(shí)P=0.038，I2GX值為97.4%。說明此組暴露-結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)未去除異質(zhì)性的MR-Egger方法P值更有意義且檢出多效性的能力更強(qiáng)，這也可能是由于去除異質(zhì)性后SNP個(gè)數(shù)較少導(dǎo)致。本研究中還可以看到無論是否去除異質(zhì)性，MR-Egger方法都存在無效的情況。以met-finn數(shù)據(jù)為例，去除異質(zhì)性前后，MR-Eggr方法均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能由于MR-Egger估計(jì)值的精確度并不取決于遺傳變異可以解釋的暴露比例（比如IVW方法），而是取決于與暴露有關(guān)的遺傳關(guān)聯(lián)之間的差異所導(dǎo)致［11］。如果這些關(guān)聯(lián)都很相似，那么MR-Egger估計(jì)值的置信區(qū)間就會(huì)很大，這會(huì)導(dǎo)致MR-Egger估計(jì)值的精確度總是會(huì)低于IVW估計(jì)值［11］。從去除異質(zhì)性前后4種MR方法的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析中也可以看到各組暴露-結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)間MR-Egger方法的P值差異性也是最大?？傊?，MR-Egger方法的精確度沒有IVW隨機(jī)效應(yīng)模型和IVW固定模型高。也就是說，MR-Egger方法特別容易出現(xiàn)偏差［12］，這也是本研究MR-Egger方法有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的P值不多的原因。

本研究證實(shí)隨著總膽固醇水平暴露的增加，膽石癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是降低的，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究，有研究表明膽汁中會(huì)形成簡單膠束，能夠溶解膽固醇、磷脂等其他類型的脂質(zhì)，所以可能是由于使總膽固醇水平增高的基因能增加膽汁中可以溶解膽固醇的簡單膠束的形成，從而使膽汁中的膽固醇結(jié)晶減少，抑制膽結(jié)石的形成［2］。也可能是由于基因?qū)е碌母闻K從血漿脂蛋白和從頭合成的膽固醇中攝取的膽固醇減少，而使得轉(zhuǎn)化為膽汁的膽固醇減少來抑制膽結(jié)石的形成。但并不意味著高膽固醇飲食或者其他提高血總膽固醇水平的方法都可以使得膽石癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)下降。因?yàn)檫@是兩種不同的機(jī)制，MR是從基因水平上做出的因果推斷［13］，與暴露有關(guān)的遺傳變異在出生前就已經(jīng)確定［14］，而中途施加的干預(yù)可能不通過暴露-結(jié)局的直接途徑，而通過其他混雜因素影響結(jié)果。對(duì)于隨著膽石癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加，總膽固醇水平是降低的這一結(jié)論，可能是由于膽石癥影響了膽固醇的吸收，或者增加了肝臟膽固醇分泌進(jìn)入膽汁的去路［15］，亦或者膽石癥相關(guān)基因抑制了膽固醇形成相關(guān)酶的活性，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同樣，MR分析中與膽石癥有關(guān)的遺傳變異，并不總是和實(shí)際的干預(yù)措施有相同的作用機(jī)制。

本次研究存在一些局限性。首先，本研究所用數(shù)據(jù)來自open gwas公共數(shù)據(jù)庫里的匯總數(shù)據(jù)，部分?jǐn)?shù)據(jù)距今時(shí)間較長，當(dāng)和新近數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析時(shí)，后來新增的遺傳位點(diǎn)可能分析不到。但這可能只會(huì)影響到分析的精確性，并不會(huì)影響分析的真實(shí)性。其次，數(shù)據(jù)集包括歐洲人群，這限制了結(jié)果對(duì)非歐洲人群的使用性。未來需要更多的研究來驗(yàn)證這些結(jié)果在其他人群和其他種族中的適用性。對(duì)于亞洲人群，只有少量日本數(shù)據(jù)庫有關(guān)于總膽固醇水平相關(guān)GWAS數(shù)據(jù)，對(duì)于膽石癥的全基因研究還是空白。本研究結(jié)果是否可以作為亞洲人群的適用參考還有待考證；再次，從本研究可以看到，以總膽固醇水平為暴露、膽石癥為結(jié)局的SNP個(gè)數(shù)比以膽石癥為暴露、總膽固醇水平為結(jié)局的SNP個(gè)數(shù)多，后者在去除異質(zhì)性后SNP的數(shù)量更少，即研究膽石癥為暴露變量的數(shù)據(jù)集樣本量較少，后者的統(tǒng)計(jì)效能比前者低，所以需增加樣本量后進(jìn)一步分析，但并不影響研究結(jié)果的有效性。從本研究可以看到基于不同數(shù)據(jù)集產(chǎn)生的結(jié)果有些許偏差，可能有如下原因：（1）不同數(shù)據(jù)集篩選入組的患者可能有種族差異，本研究納入的大多為歐洲人群，也有混合人群，這為結(jié)果帶來偏倚，具有明顯的人群效應(yīng)可能。（2）不同數(shù)據(jù)集的納入排除標(biāo)準(zhǔn)不一致，比如本研究部分采用的是2021年的GWAS數(shù)據(jù)，無法明確該數(shù)據(jù)的納入排除標(biāo)準(zhǔn)與2017年的GWAS數(shù)據(jù)集是否一致。（3）樣本量不足，尤其是以膽石癥為暴露、總膽固醇水平為結(jié)局的數(shù)據(jù)集。（4）遺傳變異的方向性，尤其是MREgger方法要求與暴露的遺傳關(guān)聯(lián)具有相同的符號(hào)［16］，而本研究數(shù)據(jù)，大部分與暴露的遺傳關(guān)聯(lián)的符號(hào)不一致，這可能也是導(dǎo)致MR-Egger方法差異性較大的因素之一。

總之，本研究在一定程度上證實(shí)了總膽固醇水平與膽石癥之間的雙向因果關(guān)系，隨著遺傳上有關(guān)能使總膽固醇水平升高的等位基因的增加，發(fā)生膽石癥的風(fēng)險(xiǎn)降低。反之，隨著遺傳上有關(guān)能使膽石癥發(fā)病增高的等位基因的增加，總膽固醇水平降低。這為下一步完善高膽固醇血癥和膽石癥之間關(guān)系的研究指出了方向。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：趙偉偉負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，搜集資料，統(tǒng)計(jì)分析，論文撰寫等；杜曉旭負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)搜集和整理資料；戈宏焱負(fù)責(zé)寫作思路的制訂，論文的寫作指導(dǎo)，修稿以及最終定稿等工作。

致謝：感謝open gwas網(wǎng)站、英國生物銀行、芬蘭生物銀行、代謝組學(xué)研究、全球脂質(zhì)遺傳協(xié)會(huì)等公開數(shù)據(jù)集及有關(guān)工作人員的努力。

數(shù)據(jù)可用性聲明：本研究所用數(shù)據(jù)均來自公共數(shù)據(jù)庫，可從文中提及的PMID或數(shù)據(jù)鏈接進(jìn)行下載。