維生素D受體單核苷酸多態(tài)性與妊娠期高血壓疾病易感性的相關(guān)性分析

鹿 莎,李瑞華,陳雪蓉,初正敏,孟海云

(昆明市延安醫(yī)院產(chǎn)科,云南 昆明 650000)

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorders of pregnancy,HDP)是一組妊娠與高血壓共存的疾病[1-2]。該病隱匿或突發(fā),常發(fā)現(xiàn)于孕婦產(chǎn)檢時(shí),且病情迅速進(jìn)展,易誘發(fā)子癇、胎兒生長(zhǎng)受限等,嚴(yán)重影響母嬰健康。我國(guó)妊娠期女性中HDP發(fā)病率占6%～8%,是孕婦和新生兒死亡的主要原因之一[3]。目前,HDP病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確,可能由多種因素、機(jī)制和通路共同參與,包括胎盤缺血、氧化應(yīng)激反應(yīng)、某些遺傳基因等[4-5]。

維生素D(vitamin D,VitD)因在鈣、磷代謝中的作用而廣為人知,其主要以25-羥基維生素D[25-hydroxyvitamin D,25-(OH)-D]的形式與維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)特異性結(jié)合來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[6]。目前,有很多關(guān)于VitD缺乏與各類疾病的相關(guān)研究[7],如妊娠期高血壓(gestational hypertension,GH)、糖尿病、慢性鼻竇炎、子癇前期(preeclampsia,PE)等,尚缺乏VDR單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorhism,SNP)與HDP易感性的相關(guān)性分析。因此,本研究選擇HDP孕婦為研究對(duì)象,分析VDR基因多態(tài)性與HDP易感性的關(guān)系,以期為臨床有效干預(yù)提供更多的理論依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年9月至2022年10月于昆明市延安醫(yī)院就診的122例HDP孕婦為研究對(duì)象(HDP組)。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合HDP診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];②于本院進(jìn)行規(guī)范化產(chǎn)檢;③初產(chǎn)婦、單胎;④孕周≥30周。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并肝炎、肺結(jié)核、腫瘤;②合并妊娠期糖尿病;③伴有免疫功能障礙、遺傳性疾病;④孕前具有高血壓病史。另選同期同院正常妊娠的122例孕婦為對(duì)照組。HDP組年齡20～40歲,平均(29.54±6.13)歲;孕周34～40周,平均(36.40±1.88)周;GH 55例,PE 67例。對(duì)照組年齡21～38歲,平均(28.71±6.08)歲;孕周36～40周,平均(39.17±1.85)周。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),孕婦及家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料收集

年齡、孕周、孕前體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、初潮年齡、新生兒體重、流產(chǎn)次數(shù)、收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)等資料經(jīng)醫(yī)院病歷收集。

1.2.2基因分型檢測(cè)

取靜脈血2mL置于EDTA抗凝管中,保存于-80℃冰箱中,用于基因組DNA的提取;用采血管采集全血2mL,分離血清,測(cè)定血清VitD水平。嚴(yán)格按提取試劑盒(Qiagen,中國(guó)上海)說(shuō)明書提取全血標(biāo)本DNA。通過(guò)TaqMan熒光探針(美國(guó)Therom Fisher Scientific公司)及ABI Prism 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司),進(jìn)行rs11568820、rs2228570及rs1544410的SNP測(cè)定。PCR擴(kuò)增所需引物及探針由Applied Biosystems公司提供。

rs11568820引物序列:上游5′-ACCCATAATAAGAAATAAGTTTTTA-3′,下游5′-TGTGACCTAGTTTACTCAGGAATAT-3′;rs2228570引物序列:上游5′-GGAAGTGCTGGCCGCCATTGCCTCC-3′,下游5′-TCCCTGTAAGAACAGCAAGCAGGCC-3′;rs1544410引物序列:上游5′-GAGCAGAGCCTGAGTATTGGGAATG-3′,下游5′-GCAGGCCTGTCTGTGGCCCCAGGAA-3′。

PCR擴(kuò)增:95℃下3min,95℃下45次循環(huán)15s,60℃下1min,對(duì)于每個(gè)周期,測(cè)定來(lái)自參比基因循環(huán)數(shù)(visit gene cycle count,VIC)或羧基熒光素(carboxynuorescein,FAM)標(biāo)記探針的熒光信號(hào)。PCR基因分型采用Bio-Rad CFX manager 3.0軟件分析(美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)

通過(guò)BC-5800全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(邁瑞,深圳)檢測(cè)甘油三酯(triglycerides,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine amino-transferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)及1,25-(OH)2D3水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三個(gè)基因型的SNP分析

VDR基因rs11568820、rs2228570及rs1544410的基因型,經(jīng)比對(duì),分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致,見圖1～3。

圖1 rs11568820基因CC型和TT型

圖2 rs2228570基因GG型和AA型

圖3 rs1544410基因CC型和TT型

2.2 SNP的LD分析

將r2>0.80視為強(qiáng)LD,軟件計(jì)算結(jié)果顯示,rs11568820、rs2228570和rs1544410三個(gè)位點(diǎn)間不存在強(qiáng)連鎖現(xiàn)象,見圖4。

注:各SNP間r2值如方塊中數(shù)字(%)所示,數(shù)字越大表示LD越強(qiáng)。

2.3 兩組孕婦的基因型及等位基因分布情況比較

各SNP位點(diǎn)的基因型分布均符合HWE(P>0.05),表明研究對(duì)象具有群體代表性。與對(duì)照組相比,HDP組rs2228570基因GG型及G等位基因的比例均更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為6.799、4.066,P<0.05);rs2228570 G等位基因使HDP患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.348倍;而rs11568820及rs1544410基因均與HDP風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1和表2。

表1 兩組孕婦的基因型分布情況比較 [n(%)]

表2 兩組孕婦的等位基因分布情況比較 [n(%)]

2.4 兩組孕婦的臨床資料比較

與對(duì)照組相比,HDP組孕婦的孕周、新生兒體重及1,25-(OH)2D3水平更低,TG、ALT、AST、BUN、Cr、SBP及DBP水平更高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值介于6.056～19.644之間,P<0.05);兩組孕婦的其余指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05),見表3。

表3 兩組孕婦的臨床資料比較

2.5 分層分析rs2228570位點(diǎn)多態(tài)性與HDP易感性

進(jìn)一步分層分析了rs2228570位點(diǎn)與HDP發(fā)病之間的關(guān)系,結(jié)果顯示與AG/AA基因型相比,GG基因型組TG≥3.82mmol/L、1,25-(OH)2D3<20.18nmol/L及Cr≥68.78μmol/L的孕婦比例均更高,其OR值及95%CI分別為1.555(1.320～1.927)、2.402(1.215～2.734)、1.902(1.267～2.303),P<0.05,見表4。

表4 分層分析rs2228570位點(diǎn)多態(tài)性與HDP易感性 [n(%)]

3 討論

3.1 VitD的存在形式、主要作用及與妊娠期疾病的關(guān)系

在體內(nèi),VitD主要以VitD2和VitD3的形式存在,并參與各種免疫細(xì)胞功能調(diào)節(jié),影響細(xì)胞因子和抗微生物肽的分泌,以維持細(xì)胞生長(zhǎng)和分化,對(duì)人體健康有益[9]。在肝臟內(nèi),VitD發(fā)生酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為25-(OH)-D的活性形式,與VDR結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)各種生理、病理活動(dòng),如胚胎著床、妊娠激素合成、支持胎兒生長(zhǎng)等,并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,如鈣平衡、細(xì)胞增殖等[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),VitD缺乏與PE和GH發(fā)病有關(guān),孕早期VitD缺乏可增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[11]。

3.2 VDR基因三個(gè)SNP位點(diǎn)與HDP風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)3帶處的VDR基因具有多個(gè)SNP位點(diǎn),極易發(fā)生基因多態(tài)性突變,從而影響VitD水平發(fā)生結(jié)構(gòu)異常,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)[12]。rs11568820位于VDR啟動(dòng)區(qū),其多態(tài)性影響VDR基因表達(dá);rs2228570位于VDR第2外顯子上,其多態(tài)性直接改變VDR分子結(jié)構(gòu);rs1544410位于VDR第8內(nèi)含子上,其多態(tài)性會(huì)影響VDR基因轉(zhuǎn)錄效率及mRNA穩(wěn)定性。因此,本研究選擇了上述三個(gè)功能位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,即FokI(rs2228570),Cdx2(rs11568820)和BsmI(rs1544410),以評(píng)估它們與HDP風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,HDP組rs2228570位點(diǎn)GG基因型及G等位基因的比例均更高,且rs2228570位點(diǎn)G等位基因使HDP患病風(fēng)險(xiǎn)增加1.348倍。Zhan等[13]人的研究結(jié)果表明,rs2228570位點(diǎn)G等位基因與PE發(fā)病有關(guān)。李祥雯等[14]人的研究結(jié)果表明,孕婦發(fā)生PE與VitD水平和BsmI、FokI位點(diǎn)相關(guān)。rs2228570位點(diǎn)G等位基因是HDP發(fā)病的危險(xiǎn)因素,這表明VDR基因rs2228570位點(diǎn)多態(tài)性可能與HDP患病具有一定關(guān)系,其中GG基因型可能是易感基因,這可能是由于VDR基因突變后與VitD結(jié)合,造成胎盤和子宮內(nèi)血管壁炎癥增加,從而導(dǎo)致孕婦患病風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)增加。此外,攜帶GG基因型孕婦的1,25-(OH)2D3水平更低,提示VDR基因多態(tài)性突變可能是通過(guò)影響1,25-(OH)2D3水平發(fā)生結(jié)構(gòu)異常,進(jìn)而在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用,具體機(jī)制有待深入研究。

同時(shí),與rs2228570位點(diǎn)AG/AA基因型相比,GG基因型TG≥3.82mmol/L及Cr≥68.78μmol/L的孕婦比例均更高。人體的脂肪成分TG是機(jī)體存儲(chǔ)能量的主要形式。有研究顯示,多數(shù)妊娠期并發(fā)癥與血脂水平異常升高密切相關(guān),可表現(xiàn)為不同程度的血壓、血糖、血脂升高等癥狀[15]。正常妊娠需要旺盛的血脂代謝來(lái)支撐,且隨著妊娠進(jìn)程發(fā)展,激素水平不斷變化,脂肪合成代謝來(lái)不及分解,易出現(xiàn)高血脂癥。此外,血脂水平異?？稍鰪?qiáng)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng),氧自由基無(wú)法被及時(shí)清除,造成細(xì)胞功能紊亂和損傷,從而導(dǎo)致HDP發(fā)生。相關(guān)研究表明,在妊娠期間血壓升高,大多數(shù)情況下會(huì)影響腎功能穩(wěn)定性,影響生活質(zhì)量[16]。Cr水平可作為反映腎小球?yàn)V過(guò)功能的良好指標(biāo),主要反映腎功能是否正常,Cr水平偏高或上升有可能是腎功能損傷,病情加重[17]。此外,本研究中還發(fā)現(xiàn),rs11568820和rs1544410與HDP易感性無(wú)關(guān)。Rezavand等[18]的研究結(jié)果亦表明,VDR TaqI和BsmI均與PE風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。

3.3 HDP的不良影響及各因素的變化

HDP多發(fā)于妊娠20周后,臨床主要表現(xiàn)為高血壓、蛋白尿、水腫等,嚴(yán)重者還會(huì)并發(fā)機(jī)體各器官功能損傷,易發(fā)生胎盤早剝、死胎等不良妊娠結(jié)局,對(duì)母嬰健康的近、遠(yuǎn)期傷害較高。因此對(duì)于HDP孕婦血清相關(guān)指標(biāo)水平的檢測(cè)十分重要,有利于早期防治。本研究中,HDP組孕婦的血清TG、ALT、AST、BUN及Cr水平均顯著高于對(duì)照組。相關(guān)研究結(jié)果顯示,HDP的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,而其中脂代謝異常具有十分重要的作用[19]。既往研究發(fā)現(xiàn),ALT和AST均與高血壓呈正相關(guān)[20]。肝胰島素抵抗使大量TG于肝臟沉積,以致肝損傷,引起轉(zhuǎn)氨酶水平升高[21]。全身胰島素抵抗使得脂代謝異常更嚴(yán)重,導(dǎo)致形成動(dòng)脈粥樣硬化,進(jìn)而血壓升高。BUN和Cr主要通過(guò)腎臟排泄。在正常妊娠期間,由于腎小球血流總量與濾過(guò)率增加,使得BUN和Cr排泄增多,進(jìn)而血清中二者水平降低[22];但若伴隨HDP,就會(huì)發(fā)生腎小動(dòng)脈痙攣,進(jìn)而動(dòng)脈壓升高,循環(huán)血流量減少,腎臟供血不足以致BUN和Cr排泄減少,導(dǎo)致血清中BUN和Cr水平升高。另外,HDP組孕婦孕周較短,新生兒體重較低,這可能是由于HDP孕婦通常需要提前終止妊娠以緩解臨床癥狀,繼而發(fā)生早產(chǎn)。

本研究也存在一定的不足。一方面,納入研究的樣本數(shù)量較少;另一方面,未檢測(cè)VDR蛋白數(shù)量和活性。盡管存在一些局限性,但本研究為VDR多態(tài)性與HDP易感性之間的關(guān)聯(lián)提供了參考證據(jù)。未來(lái)需要在更大的樣本量中進(jìn)行驗(yàn)證及功能分析,以闡明潛在機(jī)制。

綜上所述,rs2228570位點(diǎn)多態(tài)性與HDP易感性,以及HDP孕婦高TG、Cr水平和低1,25-(OH)2D3水平密切相關(guān),而與rs11568820和rs1544410無(wú)關(guān)。rs2228570位點(diǎn)攜帶G等位基因會(huì)增加HDP患病風(fēng)險(xiǎn)。