干旱脅迫對青稞幼苗小分子代謝成分的影響

雷東花 王楚軼 王紫陽 趙昊民 康志鈺

摘要： 為探究短期干旱脅迫下不同耐旱性青稞幼苗小分子代謝物的變化，以青稞品種（滇青1號和滇青2號）為材料，用20%聚乙二醇（PEG）模擬干旱脅迫，采用氣相質(zhì)譜-色譜聯(lián)用儀（GC-MS）對處理組（24 h）和對照組（0 h）的代謝組學(xué)進(jìn)行分析，研究干旱脅迫下青稞的代謝物質(zhì)變化。結(jié)果表明，2個(gè)處理組（D1-0與D1-24、D2-0與D2-24）分別有24、10個(gè)差異代謝物，其中差異代謝物木糖醇、D-葡萄糖、1-單棕櫚素、甘油、乙?；?L-賴氨酸在2個(gè)處理組中共有。對2個(gè)處理組的差異代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)D1-0與D1-24在脅迫24 h的差異代謝物多于 D2-0 與D2-24，在D1-0與D1-24中，糖類及多元醇主要以上調(diào)為主，而有機(jī)酸和氨基酸主要以下調(diào)為主；在 D2-0 與D2-24中發(fā)現(xiàn)，糖類及多元醇以上調(diào)表達(dá)為主。還發(fā)現(xiàn)D-葡萄糖、木糖醇、甘油在2個(gè)處理組中都是上調(diào)表達(dá)，而乙酰基-L-賴氨酸、尸胺都是下調(diào)表達(dá)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸途徑在2個(gè)處理組中分別有5、1條通路，而碳水化合物途徑分別有3、2條通路，其中D1-0與D1-24主要在氨基酸途徑中富集，D2-0與D2-24在碳水化合物途徑中富集。由此可知在應(yīng)對短期干旱脅迫時(shí)，青稞幼苗主要通過積累木糖醇、D-葡萄糖、甘油、乙?；?L-賴氨酸等差異代謝物抵御干旱，還發(fā)現(xiàn)通路分析中的氨基酸代謝通路和碳水化合物代謝通路與青稞抗旱性密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 青稞；干旱脅迫；代謝組；差異代謝物；GC-MS技術(shù)；KEGG分析

中圖分類號：S512.301 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）02-0051-06

干旱是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的全球性問題，能使農(nóng)作物減產(chǎn)達(dá)50%以上，由此帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。青稞主要種植在氣溫低、海拔高、環(huán)境比較惡劣的地方，在這種環(huán)境長期的馴化下使得其逐漸適應(yīng)并生活下來，也由此獲得了耐旱、耐寒等優(yōu)異特性［3-4］。對青稞進(jìn)行抗旱性研究有助于抗旱基因的發(fā)掘和應(yīng)用，也有助于其他作物抗旱性的遺傳與育種研究。作物的幼苗在面對逆境時(shí)其抵抗能力減弱［5］，這是由于幼苗對逆境脅迫的忍受能力弱，使得作物在幼苗期就停止了生長，所以對作物幼苗期的研究是當(dāng)下研究的重中之重［6-7］。對于青藏人民來說，由于青稞是他們的主食，所以必要的研究可以促進(jìn)當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)增長和社會(huì)穩(wěn)定［8］。

代謝組學(xué)是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中廣泛使用的生物技術(shù)工具［9-10］，大多應(yīng)用于植物對逆境脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制，用來評估某一特定代謝物質(zhì)或代謝途徑中的代謝水平［11-12］，包括用氣相色譜-質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）、核磁共振、高效液相色譜和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜等多種方法鑒定植物、微生物等在各種逆境脅迫下的反應(yīng)機(jī)制［13］。該技術(shù)已經(jīng)用于冬小麥［14］、野生大豆［15］、藜麥［16］、紫花苜蓿［17］、長白落葉松［18］、高羊茅［19］、黃芪［20］等的抗旱性研究，從中可以看出脂類、糖類和氨基酸類代謝物是影響較大的幾類。代謝組學(xué)可以反映植物應(yīng)對干旱的生理生化變化，從而揭示植物的抗旱機(jī)制。本研究用2個(gè)抗旱性不同的青稞品種（滇青1號抗旱性強(qiáng)于滇青2號）在20%PEG中處理24 h后，應(yīng)用GC-MS技術(shù)分析小分子代謝物的變化，明確其抗旱機(jī)制，為青稞的抗旱性育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理

試驗(yàn)材料是由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)自主培育的2個(gè)青稞品種，分別為滇青1號和滇青2號，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其抗旱性不同［21］。將滇青1號和滇青2號種子用10%過氧化氫消毒40 min，之后用蒸餾水沖洗4～5次。將青稞種子放入有吸水紙的發(fā)芽盒中，用蒸餾水浸濕，每個(gè)發(fā)芽盒50粒種子，先放入25 ℃的黑暗培養(yǎng)箱中催芽，待第1張真葉可見時(shí)，轉(zhuǎn)入溫度為23～25 ℃培養(yǎng)箱（濕度75%～80%，光—暗周期為 12 h—12 h），期間加少量水保證種子正常生長。待2張真葉可見時(shí)，加入1/2的霍格蘭水培營養(yǎng)液，每 2 d 換1次。3葉期在營養(yǎng)液中加入20%的PEG模擬中度干旱。將滇青1號和滇青2號分別標(biāo)記為D1和D2，并分別在干旱脅迫0、24 h時(shí)取樣，標(biāo)記為D1-0、D1-24、D2-0、D2-24，葉片迅速用液氮冷凍，用于代謝組學(xué)測定。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 代謝物提取和測定

代謝物的提取和測定參照Lisec等的方法［22-24］稍作修改進(jìn)行。采用7890A/5975B GC-MS氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫公司）進(jìn)行。

氣相參數(shù)設(shè)置：進(jìn)樣口的溫度為280 ℃，柱流量2 mL/min；初始溫度為80 ℃，反應(yīng)2 min，之后以 15 ℃/min 的速度增長到230 ℃，反應(yīng)10 min。

質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV。傳輸線溫度：250 ℃，離子源的溫度為 230 ℃，四極桿的溫度為150 ℃。采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測，掃描范圍為70～600質(zhì)荷比，溶劑延遲時(shí)間3 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

得到的GC-MS數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行整理，主成分分析（PCA）、差異代謝物篩選、KEGG富集分析用在線軟件MetaboAnalyst5.0（https：//www.Metaboanalyst.ca/）進(jìn)行。Venn圖、熱圖用TBtools（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools）軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞葉片代謝物主成分分析

首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，根據(jù)主成分分析可知（圖1），不同處理下的3個(gè)樣本相互聚集，說明試驗(yàn)重復(fù)性好。第1主成分把D1-0、D2-0和 D1-24、D2-24分離， 解釋樣品總變化量的40.7%。 第2主成分把D1-0和D2-0、D2-24明顯分離，其中D1-24分離不明顯，解釋樣品總變化量的33.0%。第1主成分中D1-0和D2-24分離明顯，而D1-0和D2-0在第2主成分中分離明顯。

2.2 青稞葉片24 h干旱處理下的差異代謝物篩選

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采取t檢驗(yàn)和正交偏最小二乘法得出的VIP值來篩選差異代謝物（VIP>1，P<0.05）。對干旱脅迫24 h的2個(gè)處理組作Venn圖分析（圖2），D1-0與D1-24、D2-0與D2-24分別有24、10個(gè)差異代謝物，2個(gè)處理組共有5個(gè)差異代謝物，分別是木糖醇、D-葡萄糖、1-單棕櫚素、甘油、乙?；?L-賴氨酸。說明青稞在干旱脅迫24 h時(shí)，糖類及多元醇、氨基酸和有機(jī)酸發(fā)揮了重要作用。

2.3 青稞葉片24 h干旱處理下差異代謝物聚類熱圖分析

對2個(gè)處理組（D1-0與D1-24、D2-0與D2-24）的差異代謝物的差異倍數(shù)作熱圖分析（圖3），發(fā)現(xiàn)D1-0與D1-24在脅迫24 h的差異代謝物多于D2-0與D2-24，D1-0與D1-24有9個(gè)上調(diào)，8個(gè)下調(diào)，而D2-0與D2-24有7個(gè)上調(diào)，3個(gè)下調(diào)。在D1-0與D1-24中，糖類及多元醇主要以上調(diào)為主，而氨基酸和有機(jī)酸主要以下調(diào)為主；在D2-0與D2-24中，糖類及多元醇以上調(diào)表達(dá)為主（表1）。塔羅糖（talose）、D-（+）-木糖［D-（+）-xylose］、阿拉伯糖醇（arabinitol）、蔗糖 （sucrose）、蜜二糖［melibiose，octakis（trimethylsilyl）-］ 、天冬酰胺（asparagine）、絲氨酸（serine）、L-谷氨酸（L-glutamic acid）、硬脂酸（stearic acid）、苯甲酸（benzoic acid）、腺嘌呤（adenine）只在D1-0與 D1-24 處理組中表達(dá)；而L-蘇氨酸（L-threonine）、4-氨基丁酸（4-aminobutanoic acid）、丙烯胺（propylamine）、腺苷醇（adonitol）只在D2-0與D2-24處理組中表達(dá)，由此可說明這些代謝物的表達(dá)影響了2個(gè)青稞品種耐旱性的差異。還發(fā)現(xiàn)D-葡萄糖（D-glucose）、木糖醇（xylitol）、甘油（glyceryl-glycoside TMS ether）在2個(gè)處理組中都是上調(diào)表達(dá)，而乙?；?L-賴氨酸（N-alpha-acetyl-L-lysine）、尸胺（cadaverine）都是下調(diào) 表達(dá)，乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷（ethyl-alpha-D- glucopyranoside）在D1-0與D1-24處理組中上調(diào)表達(dá)，在D2-0與D2-24處理組中下調(diào)表達(dá)，說明D-葡萄糖、木糖醇、甘油、乙?；?L-賴氨酸、尸胺、乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷代謝物對青稞的耐旱性發(fā)揮了積極的作用。

2.4 干旱處理24 h下青稞葉片差異代謝物KEGG富集分析和注釋

將得到的差異代謝物注釋到KEGG通路上并進(jìn)行通路富集分類分析（圖4）。D1-0與D1-24、D2-0與D2-24分別注釋了11、4條代謝通路（P<0.05），抗旱性強(qiáng)的D1在干旱脅迫24 h下激活了更多的代謝通路，還發(fā)現(xiàn)新霉素、卡那霉素和慶 大霉素（neomycin，kanamycin and gentamicin?biosynthesis）的生物合成在2個(gè)處理組中富集率均最高。本研究發(fā)現(xiàn)，D1-0與D1-24注釋了5條氨基酸類代謝通路（表2），分別包括丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的代謝（alanine，aspartate and glutamate metabolism）、精氨酸的生物合成（arginine biosynthesis）、氨基酸-tRNA的生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）、組氨酸代謝（histidine metabolism）、精氨酸和脯氨酸的代謝（arginine and proline metabolism）（圖4-A）；而 D2-0 與D2-24注釋了1條，為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成（valine，leucine and isoleucine biosynthesis）（圖4-B）。D1-0與D1-24注釋了3條碳水化合物通路，包括半乳糖代謝（galactose metabolism）、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化（pentose and glucuronate interconversions）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）；而D2-0與D2-24注釋了2條碳水化合物通路（表2），包括戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、淀粉和蔗糖代謝。D1-0 與D1-24注釋了1條脂質(zhì)代謝通路，為不飽和脂肪酸的生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acids）。研究發(fā)現(xiàn)戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、淀粉和蔗糖代謝同時(shí)在2個(gè)處理組中，說明碳水化合物通路在2個(gè)處理組中顯著富集，同時(shí)這些代謝物對青稞干旱脅迫的調(diào)控起到關(guān)鍵的作用。氨基酸代謝通路在D1-0與D1-24處理組中富集率較大，說明D1主要通過氨基酸代謝來抵御干旱脅迫；而碳水化合物代謝途徑在D2-0與D2-24處理組中富集率較大，說明D2主要通過碳水化合物代謝來抵御干旱脅迫，可知2個(gè)抗旱性不同的品種通過不同的途徑來抵御干旱脅迫。由此可說明，碳水化合物代謝和氨基酸代謝途徑參與了2個(gè)不同抗性青稞在干旱脅迫中的響應(yīng)。

3 討論

植物對逆境脅迫的應(yīng)答是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中代謝的改變是極為重要的一步。在面對脅迫時(shí)，植物通過調(diào)節(jié)代謝網(wǎng)絡(luò)刺激產(chǎn)生特殊代謝物來抵御各種逆境脅迫，也可以通過監(jiān)測代謝產(chǎn)物的變化來揭示逆境脅迫下植物的應(yīng)答機(jī)制，因此，研究作物逆境下的代謝物表達(dá)水平是了解作物抗逆機(jī)制的良好途徑［25］。本研究應(yīng)用GC-MS技術(shù)對2個(gè)耐旱性不同的青稞品種脅迫24 h，研究其代謝組學(xué)的變化，發(fā)現(xiàn)D1-0與D1-24在脅迫24 h的差異代謝物多于D2-0與D2-24，且D1-0與D1-24激活了更多的糖類及多元醇、有機(jī)酸、氨基酸，差異代謝物大多都以上調(diào)為主。有研究采用GC-MS技術(shù)探討冬麥1號在不同溫度下的代謝物質(zhì)變化發(fā)現(xiàn)大部分氨基酸、糖類和有機(jī)酸代謝隨著溫度的降低顯著升高，可以知道本研究與冬小麥通過大部分氨基酸、有機(jī)酸和糖類代謝的顯著增加來抵御低溫脅迫的研究［26］一致。說明青稞通過增加氨基酸、糖類及多元醇和有機(jī)酸等代謝物來抵御干旱脅迫。從Venn圖中發(fā)現(xiàn)糖類及多元醇、氨基酸、有機(jī)酸在2個(gè)青稞品種中具有較高的表達(dá)水平，其中木糖醇、D-葡萄糖、1-單棕櫚素、甘油、乙?；?L-賴氨酸在干旱處理下的2個(gè)品種中都表達(dá)，與在拔節(jié)孕穗期小麥干旱脅迫下代謝物變化規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn)葡萄糖、木糖醇、海藻糖等含量顯著表達(dá)的結(jié)果［27］一致，說明青稞在面對短暫干旱脅迫時(shí)通過木糖醇、D-葡萄糖、1-單棕櫚素、甘油、乙酰基-L-賴氨酸代謝物來維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓的穩(wěn)定。有研究表明，在干旱脅迫下，耐旱小麥基因型的蔗糖含量較高［28］，本研究發(fā)現(xiàn)蔗糖在耐旱品種D1中表達(dá)的結(jié)果與之一致。

而本研究中的1-單棕櫚素、甘油等有機(jī)酸代謝物可以提供能量給各種分解和合成代謝途徑的前體，使作物面對逆境脅迫時(shí)，可以維持生物正常的運(yùn)行［29］。對2個(gè)處理組進(jìn)行差異代謝物分析發(fā)現(xiàn)，D-葡萄糖、木糖醇、甘油、乙酰基-L-賴氨酸、尸胺、乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷代謝物在2個(gè)處理組中都有表達(dá)，說明這些代謝物參與了青稞干旱脅迫。而各種糖代謝物的表達(dá)使逆境脅迫下細(xì)胞內(nèi)的滲透達(dá)到平衡，從而有利于植物抵抗逆境［30］。

D1-0與D1-24、D2-0與D2-24有28個(gè)和20個(gè)差異代謝物分別被注釋了11、4條代謝通路，D1中多條通路被激活來抵御干旱，其中D1-0與D1-24、D2-0與D2-24主要在氨基酸途徑分別有5、1條通路，碳水化合物途徑分別有3、2條通路富集。有研究表明植物對非生物脅迫的標(biāo)志性反應(yīng)是氨基酸代謝物的積累，因此氨基酸途徑在抵御逆境對植物的侵害中發(fā)揮著極其重要的作用［31］，這與本研究發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝通路多于其他代謝通路的結(jié)果一致。而在D1-0與D1-24處理組中氨基酸代謝途徑主要富集，其中差異代謝物天冬酰胺、絲氨酸、L-谷氨酸等顯著表達(dá)，而絲氨酸作為光呼吸的產(chǎn)物，在一定程度上反映光呼吸的強(qiáng)弱，有研究發(fā)現(xiàn)在滲透脅迫下植物葉片中谷氨酸、絲氨酸等氨基酸會(huì)大量積累［32］，還發(fā)現(xiàn)D1-0與D1-24的絲氨酸和L-谷氨酸下調(diào)，說明D1在干旱脅迫下通過下調(diào)來維持滲透壓的穩(wěn)定。而D2-0與D2-24處理組中碳水化合物代謝途徑顯著富集，其中D-葡萄糖、木糖醇、甘油等代謝物顯著表達(dá)，其中糖類代謝除了可以生成大量的可溶性糖等代謝物，還可以促進(jìn)植物的呼吸作用，通過吸收礦物質(zhì)并合成有機(jī)物為植物的生長發(fā)育提供能量，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢，使植物在逆境環(huán)境下也可以正常生長［33-36］。通路富集分析還發(fā)現(xiàn)，戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、淀粉和蔗糖代謝在2個(gè)處理組中顯著富集，說明糖類代謝在青稞干旱脅迫下發(fā)揮著顯著作用，糖類的分解和合成會(huì)影響細(xì)胞的滲透性，而滲透能力的變化可以影響機(jī)體的抗逆能力，因此細(xì)胞內(nèi)糖類的積累對細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，可以增強(qiáng)植物抗逆能力［37］。

4 結(jié)論

本研究采用GC-MS技術(shù)對2個(gè)青稞品種在干旱24 h下的代謝物進(jìn)行分析。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)處理組（D1-0與 D1-24 、D2-0與D2-24）分別有24和10個(gè)差異代謝物，可知抗旱性強(qiáng)的D1青稞品種的代謝物多于抗旱性弱的D2青稞品種，其中木糖醇、D-葡萄糖、1-單棕櫚素、甘油、乙酰基-L-賴氨酸在2個(gè)處理組中都有，說明干旱脅迫下糖類及多元醇、氨基酸和有機(jī)酸發(fā)揮著重要的作用。代謝物D-葡萄糖、木糖醇、甘油、乙?；?L-賴氨酸、尸胺、乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷在2個(gè)處理組中都有表達(dá)，說明這些代謝物在青稞干旱過程中發(fā)揮著顯著的作用。在KEGG通路分析中發(fā)現(xiàn)，氨基酸途徑在2個(gè)處理組中分別有5、1條通路，而碳水化合物途徑分別有3、2條通路，其中D1-0與D1-24主要在氨基酸途徑中富集，D2-0與D2-24在碳水化合物途徑中富集，可知2個(gè)品種通過不同的代謝途徑來抵御干旱脅迫。因此在干旱脅迫中，青稞品種主要通過氨基酸途徑和碳水化合物途徑來應(yīng)對干旱。

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收 稿日期：2023-03-09

基金項(xiàng)目： 云南省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃子課題（編號：202102AE090014）。

作者簡介：雷東花（1996—），女，甘肅慶陽人，碩士研究生，主要從事麥類作物遺傳育種研究。E-mail：1914970517@qq.com。

通信作者：康志鈺，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事作物遺傳育種以及種子科學(xué)與工程研究。E-mail：kangzhiyu@ynau.edu.cn。