桿菌肽在獸醫(yī)臨床的研究進(jìn)展

王育丹,霍美霞,劉海燕,黃玲利,3

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070;2. 國家獸藥安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070;3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥殘留檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070)

桿菌肽(Bacitracin,BAC)是一種多肽類抗生素,由地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的某些菌株所產(chǎn)生[1],作用于革蘭陽性菌和部分革蘭陰性菌(螺旋體、放線菌等),在動(dòng)物體內(nèi)代謝快,殘留少,主要產(chǎn)品為桿菌肽鋅(Bacitracin zinc,BZ)和亞甲基水楊酸桿菌肽(Bacitracin methylene disalicylate,BMD)。近年來,由于抗菌藥物使用不科學(xué)和不合理,動(dòng)物源性細(xì)菌耐藥性不斷增加,對(duì)動(dòng)物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全造成了威脅。我國在2019年發(fā)布第194號(hào)公告,禁止了除中藥外的促生長類藥物的使用。本文著重對(duì)桿菌肽的殘留檢測和獸醫(yī)臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,為桿菌肽的臨床應(yīng)用提供理論支撐。

1 桿菌肽理化性質(zhì)

桿菌肽,又叫枯草菌肽、枯草菌素,分子式為C66H103N17O16S,分子量為1 421.68。該藥物呈淡黃或白色粉末狀,有引濕性,味苦,無臭味,易溶于水,可溶解于乙醇、乙醚和丙酮溶液,與多種重金屬鹽類發(fā)生沉淀,耐酸性、煮沸、胃蛋白酶或胰蛋白酶消化。干式桿菌肽粉劑和非水性軟膏在室溫下非常穩(wěn)定,若不冷藏,桿菌肽在水溶液和水溶性堿中很快就會(huì)變質(zhì)。

桿菌肽存在多種異構(gòu)體,是1個(gè)十二肽混合物,由1個(gè)噻唑啉環(huán)和1個(gè)七肽環(huán)構(gòu)成,環(huán)狀結(jié)構(gòu)和鏈狀結(jié)構(gòu)分別由7個(gè)氨基酸和5個(gè)氨基酸組成[2],桿菌肽結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 桿菌肽的結(jié)構(gòu)式

桿菌肽主要產(chǎn)品有BZ和BMD,主要成分為桿菌肽A和桿菌肽B,含量占桿菌肽的95%以上[3]。其中,桿菌肽A的活性成分含量最高,由7個(gè)多肽組成,呈環(huán)狀結(jié)構(gòu),含有1個(gè)位于?；腘末端的噻唑啉環(huán)[4]。

2 桿菌肽作用機(jī)制和特點(diǎn)

桿菌肽作用于大部分革蘭陽性菌和螺旋體等部分革蘭陰性菌。研究發(fā)現(xiàn),桿菌肽對(duì)各種細(xì)菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)分別為產(chǎn)氣莢膜梭菌256 μg/mL[5]、金黃色葡萄球菌16 μg/mL、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌32 μg/mL、耐甲氧西林表皮葡萄球菌32 μg/mL[6]、糞球腸菌32～48 μg/mL、變形鏈桿菌78.12 μg/mL[7]。

將大麻素大麻二酚(Cannabinoid cannabinol,CBD)與桿菌肽合用,CBD可增強(qiáng)桿菌肽對(duì)革蘭陽性菌(葡萄球菌屬、單核細(xì)胞增生李斯特菌和糞腸球菌)的作用,且MIC降低了至少64倍[8]。將粘菌素與桿菌肽聯(lián)合使用,可以使金黃色葡萄球菌的MIC降到1/2 MIC[9]。研究表明,豬鏈球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等對(duì)桿菌肽具有耐藥性,許多革蘭陽性菌生物體中存在“Bce型”三磷酸腺苷結(jié)合盒(ATP binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,該蛋白能形成具有雙組分系統(tǒng)的蛋白質(zhì)復(fù)合物,這些組分共同感知并對(duì)細(xì)胞表面的桿菌肽產(chǎn)生抗性[10]。Ma等[11]通過比較基因組學(xué)和蛋白質(zhì)同源性分析發(fā)現(xiàn),有毒的豬鏈球菌菌株都含有SstFEG編碼的1種潛在的外排泵,SstFEG參與豬鏈球菌在動(dòng)物感染模型中的定植,通過其潛在的競爭性生存優(yōu)勢(shì)對(duì)抗宿主的殺菌作用。

桿菌肽的抑菌機(jī)制主要有3種:(1)阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成,Siewert等[12]研究表明,桿菌肽通過脂質(zhì)載體的去磷酸化而阻礙脂質(zhì)載體進(jìn)入細(xì)胞,從而抑制肽聚糖的合成,最終抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成;(2)損害細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性,導(dǎo)致細(xì)胞無法維持滲透壓平衡,從而引起細(xì)菌破裂死亡[13];(3)誘導(dǎo)細(xì)菌核酸降解,尤其是RNA,Ciesioka等[14]采用幾種模型RNA和DNA寡聚物檢測桿菌肽的核酸降解活性,結(jié)果表明,桿菌肽通過誘導(dǎo)鳥苷殘基中RNA的降解而干擾了細(xì)菌蛋白的合成。近年來也有研究表明,桿菌肽還可以影響細(xì)菌生物膜的形成,Zaidi等[7]使用1/2 MIC,即39.06 μg/mL的桿菌肽處理變形鏈球菌后,其生物膜的形成顯著降低。

桿菌肽經(jīng)口服后幾乎不被胃腸道吸收,在器官和組織中的分布可忽略不計(jì)。在大鼠、雞和豬中,約95%的口服劑量通過糞便排泄,僅3%或更少通過尿液排泄。桿菌肽通過主要代謝產(chǎn)物脫酰胺桿菌肽代謝為氨基酸和較小的肽,在微生物學(xué)上不起作用。糞便中的主要代謝物為桿菌肽A、B1、B2、F、脫酰胺桿菌肽和分解代謝肽,尿液和膽汁中僅存在水解裂解產(chǎn)物(二肽和三肽)[15]。

3 桿菌肽安全性

3.1 桿菌肽的毒理學(xué)特征 根據(jù)給藥途徑的不同,桿菌肽表現(xiàn)出不同程度的毒性反應(yīng)。注射時(shí)毒性最強(qiáng),口服時(shí)毒性最弱。桿菌肽經(jīng)不同途徑給藥對(duì)小鼠、大鼠和鵪鶉的急性毒性半數(shù)致死量(Median lethal dose,LD50)如表1所示[16]。

表1 桿菌肽經(jīng)不同途徑給藥對(duì)不同動(dòng)物的LD50[16]

全身應(yīng)用桿菌肽時(shí)會(huì)損傷腎臟,主要表現(xiàn)在腎小管,同時(shí)抑制腎小球的濾過功能,引起嚴(yán)重的腎毒性反應(yīng),有時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)蛋白尿和管型尿等現(xiàn)象,腎功能逐漸退化,嚴(yán)重者可導(dǎo)致急性腎小管壞死和動(dòng)物死亡。當(dāng)桿菌肽使用劑量接近LD50時(shí),會(huì)對(duì)小鼠的腎小管造成損害,偶爾對(duì)猴子造成損害,但對(duì)大鼠和犬的損害較小;局部應(yīng)用時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致過敏,主要表現(xiàn)為皮膚紅腫、皮疹和局部瘙癢,偶爾出現(xiàn)嚴(yán)重的全身過敏[16]。

3.2 桿菌肽在靶動(dòng)物的安全性 桿菌肽具有優(yōu)良的安全性。BZ按250 mg/(kg·bw)劑量給藥,對(duì)4周齡仔豬無明顯的臨床和病理損傷,表明BZ對(duì)仔豬無毒副作用。桿菌肽的污染物致突變性檢測(Ames)試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)的結(jié)果也均為陰性[17]。

孫晨明等[18]研究了BMD預(yù)混劑對(duì)雞的安全性,按臨床推薦劑量55 mg/(kg·bw·d)的1、3和5倍劑量混飼連續(xù)給藥42 d,結(jié)果顯示,所有受試動(dòng)物均存活,臨床表現(xiàn)、病理剖檢和血液生理生化指標(biāo)均無異常。賀文慶[19]研究了BMD預(yù)混劑對(duì)鴨的安全性,按臨床推薦劑量50 mg/(kg·bw·d)的1、3和5倍劑量混飼連續(xù)給藥42 d,結(jié)果顯示,所有試驗(yàn)組動(dòng)物均未死亡,且臨床表現(xiàn)、病理剖檢和血液生理生化指標(biāo)均正常。胡雪[20]研究了BMD可溶性粉對(duì)兔的安全性,受試藥以桿菌肽計(jì),按臨床推薦劑量6 mg/(kg·bw·d)的1、3和5倍劑量混飲連續(xù)給藥21 d,結(jié)果顯示,兔發(fā)育正常,病理剖檢也未見異常。上述研究表明,BMD按推薦劑量給藥,對(duì)靶動(dòng)物雞、鴨和兔具有較大的安全性。

4 桿菌肽在動(dòng)物體內(nèi)的殘留消除研究

歐盟規(guī)定:牛奶中桿菌肽的殘留不超過100 μg/kg,兔可食性組織中桿菌肽的殘留量不超過150 μg/kg[15]。美國規(guī)定:在牛、豬、雞、火雞、稚雞、鵪鶉以及奶和蛋中,桿菌肽的殘留量不超過500 μg/kg[21]。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定:桿菌肽在豬、牛和家禽的可食性組織及禽蛋和奶中的最大殘留量不超過500 μg/kg[22]。

4.1 桿菌肽殘留檢測方法 目前,桿菌肽殘留檢測方法主要有微生物檢測法、免疫分析法、高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)、毛細(xì)管電泳色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid chromatography mass spectrometer,LC-MS/MS),具體原理和優(yōu)缺點(diǎn)見表2。

表2 桿菌肽殘留檢測方法

4.1.1 微生物檢測法 王正彬等[23]建立了桿菌肽在草魚、鰻鱺和對(duì)蝦肌肉中的測定方法,該方法選擇藤黃微球菌(Micrococcusluteus)為檢測菌種,以0.1%甲酸水-甲醇(7∶3)提取藥物,正己烷除脂,當(dāng)不同水產(chǎn)品肌肉組織中桿菌肽添加濃度在0.5～2.5 μg/g時(shí),各組織回收率均在70%以上,變異系數(shù)均在15%以下。郭桂芳等[24]建立了豬可食性組織中桿菌肽的殘留檢測方法,當(dāng)豬組織樣品中桿菌肽添加濃度在 0.025～0.1 IU/g時(shí),回收率均在80%以上,檢測限(Limit of detection,LOD)為0.025 IU/g(相當(dāng)于410 μg/kg)。

4.1.2 免疫分析法 那冠瓊[25]通過人工合成免疫原免疫小鼠后成功制備單抗,建立了檢測牛奶中BZ殘留的膠體金試紙條;牛奶樣品中桿菌肽添加濃度在0.97～10.29 ng/mL范圍內(nèi),裸眼LOD為25 ng/mL,儀器掃描灰度值LOD為0.82 ng/mL,平均回收率在80%以上,變異系數(shù)小于15%。劉宏軍等[26]制備了ELISA檢測試劑盒,可用于檢測豬肉、豬肝和牛奶中桿菌肽的殘留,檢測范圍在1.0～81.0 μg/L,豬肉、豬肝和牛奶的 LOD分別為20、20和26 μg/kg,線性關(guān)系良好(r>0. 99),平均回收率在70%以上,變異系數(shù)在15%以下,表明該ELISA檢測試劑盒具有靈敏度高、檢測快速和穩(wěn)定等特點(diǎn)。

4.1.3 高效液相色譜法 焦洋[27]建立了檢測脂質(zhì)體中桿菌肽含量的高效液相色譜法,以磷酸鹽緩沖液-甲醇(60∶40,pH 6)為流動(dòng)相等度洗脫,檢測波長為254 nm,藥物濃度在0.061～1.830 μg/mL范圍內(nèi),檢測濃度與目標(biāo)峰面積線性關(guān)系良好,平均回收率達(dá)100.53%。常用的液相檢測器主要有紫外檢測器(Ultraviolet detector,UVD)、熒光檢測器(Fluorescence detector,FLD)、蒸發(fā)光散射檢測器(Evaporative light-scattering detector,ELSD)和化學(xué)發(fā)光檢測器(Chemiluminescent detector,CD)。其中,FLD靈敏度高,選擇性強(qiáng),應(yīng)用廣泛,可用于能激發(fā)熒光的化合物的檢測,而多肽類藥物多數(shù)無熒光反應(yīng),經(jīng)衍生后方可使用該方法,常用的衍生化制劑有異氰硫基苯和鄰苯二甲醛。Capitan-Vallvey等[28]建立了檢測動(dòng)物飼料中桿菌肽含量的高效液相色譜-熒光檢測法(High performance liquid chromatography-fluorescence detection,HPLC-FLD),以鄰苯二甲醛為衍生制劑,該方法的LOD為2.5 mg/L,定量限(Limit of quantification,LOQ)為7.5 mg/L。

4.1.4 毛細(xì)管電泳色譜法 Injac等[29]建立了測定飼料中BZ含量的膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳色譜法,在毛細(xì)管中因電場力的驅(qū)動(dòng),目標(biāo)物和其他物質(zhì)在膠束相和水相間發(fā)生分配行為,從而遷移分離,該方法的LOD為4.72 mg/L。因毛細(xì)管管徑的限制,雷霄云等[30]通過對(duì)毛細(xì)管加壓,與靈敏度更高的激光誘導(dǎo)熒光檢測器聯(lián)用,用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并呋咱[4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole,NBD-F]衍生后,建立了用于多肽類抗生素殘留檢測的毛細(xì)管電色譜-激光誘導(dǎo)熒光聯(lián)用技術(shù)(Capillary electrochromatography-laser induced fluorescence,CEC-LIF),該技術(shù)適用于檢測牛奶和飼料中包括桿菌肽在內(nèi)的3種環(huán)狀多肽,該方法的LOD為10 ng/mL,回收率介于72.9%～112.4%,可滿足相關(guān)殘留檢測要求。

4.1.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 LC-MS/MS是檢測飼料中獸藥含量和分析獸藥殘留的重要手段。高嫣珺等[31]建立了動(dòng)物可食性組織和禽蛋中桿菌肽殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(High performance liquid chromatography mass spectrometry,HPLC-MS/MS)檢測方法,藥物濃度在50～1 000 ng/g,組織中桿菌肽添加濃度與目標(biāo)峰面積有較好的線性關(guān)系,平均回收率大于70%,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%。除上述方法外,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry,UPLC-MS/MS)可提高分析效率和檢測靈敏度,使樣品在短時(shí)間內(nèi)完成分離。杜業(yè)剛等[32]建立了一種可同時(shí)測定動(dòng)物源性食品中8種多肽類抗生素的檢測方法,結(jié)果顯示,在10～1 000 μg/L范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,回收率和變異系數(shù)均滿足檢測要求。Bladek等[33]開發(fā)并驗(yàn)證了可用于測定動(dòng)物肌肉、牛奶和雞蛋中多肽抗生素殘留的新型UPLC-MS/MS方法,該方法首次基于堿性提取劑來檢測動(dòng)物源性食品中多肽類抗生素,與采用酸性萃取相比,該方法具有新穎性,可對(duì)10～1 000 μg/kg線性范圍內(nèi)的多肽進(jìn)行定量,回收率在70%～99%,變異系數(shù)小于15%,具有較好的實(shí)用性。

4.2 桿菌肽在動(dòng)物體內(nèi)的殘留消除特征 全家興[3]將BMD可溶性粉按6 mg/(kg·bw),2 次/d,連續(xù)10 d混飼給藥,研究桿菌肽在兔子可食性組織中的殘留消除規(guī)律,結(jié)果表明,桿菌肽在兔子可食性組織中無殘留。賀文慶[19]將BMD按250 mg/kg濃度添加在飼料中,連續(xù)飼喂20 d后,對(duì)雞的可食性組織中的藥物殘留進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,BMD在雞體內(nèi)無殘留。

5 桿菌肽臨床應(yīng)用

在畜禽上,桿菌肽主要用作飼料添加劑,用于提高飼料的轉(zhuǎn)化率和畜禽的體重,也可用于治療畜禽腸道感染性疾病。2019年,我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194號(hào)公告,規(guī)定自2020年1月1日起,桿菌肽不可再作為促生長劑進(jìn)行使用。

研究發(fā)現(xiàn),桿菌肽可用于治療畜禽胃腸道疾病,臨床上主要用于防治畜禽的壞死性腸炎,產(chǎn)品主要是BZ和BMD。胡雪[20]開展的藥效學(xué)試驗(yàn)證明,在推薦劑量6 mg/(kg·bw·d),連續(xù)混飲給藥10 d,BMD能有效治療兔壞死性腸炎,且無不良反應(yīng)。沈建忠等[34]研究也表明,BMD對(duì)C型魏氏梭菌有明顯的抑菌作用,MIC為1.5 μg/mL,在推薦劑量每公斤飲水中分別加入50、100和200 mg BMD,連續(xù)混飲給藥7 d,對(duì)雞壞死性腸炎具有良好的療效。Kyriakis等[35]將仔豬斷奶后到156 d分為3個(gè)階段,以3種劑量將BZ混飼給藥,發(fā)現(xiàn)36個(gè)治療組的表現(xiàn)均優(yōu)于對(duì)照組,且高劑量組(300或200 ppm)優(yōu)于低劑量組(200或100 ppm、100或50 ppm)。將BMD按275 mg/kg添加在母豬圍產(chǎn)期(產(chǎn)前2周～產(chǎn)后3周)飼料中,可用來控制仔豬的梭菌腸炎[36]。同時(shí),美國也已經(jīng)批準(zhǔn)BMD用于控制豬痢疾。

桿菌肽對(duì)動(dòng)物腸道健康也有一定的影響。Chen等[37]用不同濃度的BMD進(jìn)行日糧補(bǔ)充,飼喂斷奶兔35 d,結(jié)果顯示,在補(bǔ)充劑量為50～100 mg/kg的情況下,BMD能夠提高腸道吸收能力,改善腸道酸堿度,利于有益細(xì)菌的存活,維持腸道的健康。Proctor等[38]按100 mg/kg劑量將BMD加入30日齡仔雞的日糧中連續(xù)18 d后,仔雞腸道微生物多樣性提高,腸道穩(wěn)定性增強(qiáng),同時(shí)壞死性腸炎等胃腸道疾病暴發(fā)期間的潛在病原體減少。

6 展望

近年來,各國對(duì)獸藥濫用和細(xì)菌耐藥性問題越來越重視,我國已禁止桿菌肽在獸醫(yī)臨床中作為促生長制劑使用。美國、韓國等多個(gè)國家已經(jīng)批準(zhǔn)其產(chǎn)品BMD用于豬梭菌性腸炎的治療,大量研究也已經(jīng)表明,BMD可以用于治療雞和兔的壞死性腸炎。基于桿菌肽無殘留和安全性好等特點(diǎn),未來可促進(jìn)該藥物轉(zhuǎn)治療注冊(cè)的申請(qǐng),在畜禽的胃腸道疾病方面發(fā)揮治療作用。同時(shí),由于桿菌肽廣泛的應(yīng)用和耐藥性的產(chǎn)生,建立方便、快捷和靈敏的殘留檢測方法,對(duì)于其在臨床的合理使用尤為重要。