布魯氏菌病疫苗免疫評估與野毒感染區(qū)分試驗

高武成，魏美清，王耀榮，彭 鈺，周芙蓉，胡鳳娜，楊海龍，丁忠杰

（華池縣動物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 華池 745600）

布魯氏菌病簡稱布病，是由布魯氏菌侵入機體引起的一種人畜共患傳染病，常引起母畜流產(chǎn)、不育、關(guān)節(jié)炎等，人感染該病后，病程長，反復(fù)發(fā)作，難以治愈，嚴重威脅畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生事業(yè)健康發(fā)展[1]。

華池縣在20世紀70年代初首次發(fā)現(xiàn)羊感染布病的病例，當時采用羊型5號布病疫苗對牛羊進行了大面積飲水免疫，80年代后集中進行布病檢測，直到1992年達到甘肅省列布病“穩(wěn)定控制區(qū)”考核達標縣。隨著華池縣肉羊產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展壯大，加之畜禽調(diào)運頻繁，導(dǎo)致羊布病病例逐漸增多，羊布魯氏菌病的發(fā)病數(shù)由2012年的22只上升到2015年的616只，陽性率由0.2%上升到2.2%，華池縣布病流行態(tài)勢日趨嚴重，檢出陽性率在逐年加大，除喬川、紫坊畔兩鄉(xiāng)外，其余各鄉(xiāng)鎮(zhèn)都有不同程度布病感染病例，布病發(fā)生最嚴重的鄉(xiāng)鎮(zhèn)有城壕鎮(zhèn)、南梁鎮(zhèn)、悅樂鎮(zhèn)，新的布病流行形勢引起了政府的高度重視。

為了遏制布魯氏菌病流行，從2016年開始，對華池縣1月齡以上的羊只（不包括種羊場和種公羊）采用S2疫苗灌服免疫，但S2疫苗免疫羊后，6個月內(nèi)不能完全轉(zhuǎn)陰，且與自然患病動物無法進行區(qū)分，給羊調(diào)運檢疫工作帶來一定的困擾。為了解決這一問題，華池縣動物疫病預(yù)防控制中心在縣內(nèi)試點免疫布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株），通過開展免疫注射、抗體效果評估、抗體陽性與野毒感染區(qū)分等試驗，探討布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）在實際生產(chǎn)中的使用效果，以期為華池縣布魯氏菌病防控工作提供更多參考。

1 布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）免疫效果評估

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 在華池縣內(nèi)選取2個養(yǎng)殖場，選取的試驗羊群為3月齡以上羊只，未免疫過布魯氏菌病疫苗，在免疫接種前對所有試驗羊只加掛耳標進行標記。

1.1.2 試驗疫苗 布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）購自金宇保靈生物藥品有限公司，批號23950303，并搭配該公司專用稀釋液進行稀釋。

1.1.3 試驗試劑 虎紅平板凝集試驗抗原，批號10012302。試管凝集試驗抗原，批號10042302。陽性血清、陰性血清均購自青島立見生物科技有限公司。

1.1.4 免疫物資 防護服、防護帽、乳膠手套、長臂手套、護目鏡、N95口罩、雨鞋、金屬注射器、注射用針頭、新潔爾滅消毒液、75%酒精、棉球、碘酊、疫苗冷藏箱、消毒桶、垃圾回收袋等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組 免疫接種前，對試驗動物健康狀況進行詢問調(diào)查和現(xiàn)場臨床觀察，并采集血液、分離血清，用虎紅平板凝集試驗進行布魯氏菌病檢測，剔除陽性畜。剔除陽性羊只后，組建陽性群、陰性群各300只（表1）。

表1 試驗動物分組及免疫數(shù)量

1.2.2 疫苗稀釋 用0.1%新潔爾滅對疫苗稀釋液瓶和疫苗瓶進行噴霧消毒，再用75%酒精對疫苗瓶、稀釋液瓶及瓶蓋進行擦拭消毒，按照說明書要求比例用專用稀釋液進行稀釋。

1.2.3 環(huán)境壓塵及畜群消毒 在免疫前首選對布魯氏菌病敏感性高的消毒藥，對免疫場地、圈舍地面及周圍環(huán)境等進行壓塵消毒，以噴濕地面、不泥濘、不起灰塵為最佳。消毒時將噴頭高舉空中，噴嘴向上以畫圓圈方式按“先里后外，先上后下，先左后右”的順序逐步噴灑，使藥液呈霧狀下落。以地面、圈舍及各角落濕潤，羊體表稍濕為宜，由內(nèi)及外，達到全面消毒壓塵的目的。

1.2.4 免疫注射 對3月齡以上的羊只，用布魯氏菌基因缺失活疫苗腿部皮下免疫注射1 mL。免疫結(jié)束后做好免疫記錄，記錄內(nèi)容包括羊只數(shù)量、出生日齡、疫苗種類、生產(chǎn)批次、免疫時間和免疫劑量等。免疫后觀察羊只有無過敏反應(yīng)，如有及時采取補救措施。

1.2.5 免疫后抗體檢測 免疫接種后30 d、90 d、120 d、150 d、180 d采集血清樣品，按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2018）中的虎紅平板凝集試驗進行初步鑒定，并通過試管凝集試驗進行復(fù)檢。平板凝集被檢血清出現(xiàn)顆粒狀或絮狀的凝集現(xiàn)象時，判定為陽性，試管凝集中被檢血清以1∶50血清稀釋，出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時，判定為陽性。統(tǒng)計抗體轉(zhuǎn)陽率、轉(zhuǎn)陰率等指標。轉(zhuǎn)陽率=檢測陽性樣品數(shù)/樣品總數(shù)×100%；轉(zhuǎn)陰率=檢測陰性樣品數(shù)/樣品總數(shù)×100%。

1.3 試驗結(jié)果

1.3.1 安全狀況觀察 免疫后12 h內(nèi)未出現(xiàn)過敏反應(yīng)，48 h內(nèi)注射部位未見異常，羊只未出現(xiàn)不良反應(yīng)，說明布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）腿部皮下注射比較安全。

1.3.2 免疫后抗體檢測結(jié)果 由表2可知，陰性群免疫30 d后的虎紅平板凝集試驗抗體合格率為90.3%，試管凝集試驗抗體合格率為88.5%，達到抗體合格率的高峰；隨后抗體水平開始下降，免疫90 d后，因飼養(yǎng)管理不當，羊群感染傳染性胸膜肺炎，死亡3只，虎紅平板凝集試驗檢測轉(zhuǎn)陰率為79.3%，布病試管凝集試驗抗體轉(zhuǎn)陰率為88.5%；免疫120 d后，虎紅平板凝集試驗檢測樣品轉(zhuǎn)陰率為93.2%，試管凝集試驗樣品轉(zhuǎn)陰率為94.6%；免疫150 d后，虎紅平板凝集試驗樣品轉(zhuǎn)陰率為97.6%，試管凝集試驗樣品轉(zhuǎn)陰率為98%；免疫180 d后，虎紅平板凝集試驗樣品轉(zhuǎn)陰率為98%，試管凝集試驗樣品轉(zhuǎn)陰率為98.7%。

表2 免疫接種后抗體水平檢測結(jié)果

陽性群免疫30 d后，虎紅平板凝集試驗抗體合格率為88.6%，試管凝集試驗抗體合格率為80.6%，達到抗體合格率的高峰；免疫90 d后，虎紅平板凝集試驗檢測樣品轉(zhuǎn)陰率為75%，試管凝集試驗抗體轉(zhuǎn)陰率為81.3%；免疫120 d后，虎紅平板凝集試驗檢測樣品轉(zhuǎn)陰率為86.2%，試管凝集試驗樣品轉(zhuǎn)陰率為87.3%；免疫150 d后，虎紅平板凝集試驗樣品轉(zhuǎn)陰率為90.5%，試管凝集試驗樣品轉(zhuǎn)陰率為91.3%；免疫180 d后，虎紅平板凝集試驗樣品轉(zhuǎn)陰率為93.6%，試管凝集試驗樣品轉(zhuǎn)陰率為94%，殘留6%的陽性畜。

2 布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）免疫陽性和野毒感染區(qū)分試驗

在臨床檢測過程中，存在布病免疫抗體和感染抗體難以區(qū)分的現(xiàn)象，給布魯氏菌病診斷檢測凈化工作帶來困難，而布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）中敲除bp26基因，使用該疫苗免疫動物后可以區(qū)分自然感染抗體和免疫抗體[2]，能夠為布病的檢測凈化提供一定參考。

2.1 材料與方法

2.1.1 試驗動物及試劑 在免疫注射過程中，發(fā)現(xiàn)免疫180 d后，仍有動物血清檢測為陽性，且陽性群高于陰性群，原因可能是陽性羊群養(yǎng)殖環(huán)境、水源等被污染，也可能是試驗動物隱性帶毒，因此對180 d未轉(zhuǎn)陰的22只陽性羊采集血清進行檢測。羊布魯氏菌LPS和BP26蛋白ELISA抗體檢測試劑盒購自內(nèi)蒙古金邁詩生物科技有限公司。

2.1.2 結(jié)果判定 被檢樣品S/N值LPS＜3.1時，與S/N值BP26無關(guān)，則結(jié)果判定為陰性，表示沒有免疫羊布魯氏菌疫苗，同時也沒有羊布魯氏菌野毒株感染；被檢樣品S/N值LPS≥3.6，且S/N值BP26＜3.3，則結(jié)果判為LPS陽性，表示布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）免疫抗體陽性。被檢樣品S/N值LPS≥3.6，且S/N值BP26≥3.8，則結(jié)果判為LPS和BP26蛋白抗體陽性，表示羊布魯氏菌野毒株感染（S/N值LPS=SLPS/NCLPS；S/N值BP26=SBP26/NCBP26，S/N值LPS表示樣品在LSP包被板上S/N值，S/N值BP26表示樣品在BP26包被板上S/N值，SLPS表示樣品在LSP包被板上OD450nm值，SBP26表示樣品在BP26包被板上OD450nm值，NCLPS表示LSP包被板上陰性對照OD450nm平均值，NCBP26表示BP26包被板上陰性對照OD450nm平均值）。

2.2 試驗結(jié)果

采用ELISA方法分別對陰性場群、陽性場群的陽性羊只采集血清進行檢測，結(jié)果（表3）顯示：陰性群4份陽性樣品均為免疫抗體陽性，陽性群18份樣品16份為免疫抗體陽性，2份為布魯氏菌野毒感染。

表3 免疫陽性和野毒感染區(qū)分試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

采用皮下注射的方法進行免疫接種不容易形成氣溶膠，可有效降低環(huán)境污染和人員感染，更有利于布病防控。腿部皮下注射布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）后，陰性場群和陽性場群免疫30 d后抗體水平達峰值，陰性群抗體合格率達88.5%，陽性群轉(zhuǎn)陰率達80.6%，隨后抗體水平逐漸下降，免疫90 d后轉(zhuǎn)陰率均在80%以上，陰性群轉(zhuǎn)陰率大于陽性群，說明疫苗具有保護率高、轉(zhuǎn)陰快的特點，對陰性群、陽性群都有較好的保護作用。

對超過180 d后不能轉(zhuǎn)陰的羊只，采用羊布魯氏菌LPS和BP26蛋白ELISA抗體檢測試劑盒開展檢測，可有效區(qū)分疫苗免疫陽性與野毒感染，避免因陽性畜漏檢造成病原擴散蔓延以及陰性畜誤殺造成養(yǎng)殖場（戶）經(jīng)濟損失[3]，扭轉(zhuǎn)了因注射其他疫苗導(dǎo)致羊只無法調(diào)運的被動局面。本次免疫陽性和野毒感染區(qū)分試驗結(jié)果顯示，陽性群體陽性數(shù)量增加2只，原因可能是陽性羊群養(yǎng)殖環(huán)境、水源等被污染，也可能是試驗動物隱性帶毒，還需要進一步跟蹤評估。

羊布魯氏菌LPS和BP26蛋白ELISA抗體檢測試劑盒具有較好的敏感性，為布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）的應(yīng)用提供配套疫苗免疫陽性與野毒感染區(qū)分方法，在布魯氏菌病的快速診斷、檢測和凈化等方面發(fā)揮著積極作用，但該方法的前提是羊只未免疫過其他疫苗，在臨床診斷過程中應(yīng)予以注意。

本次布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）免疫效果評估試驗和免疫陽性和野毒感染區(qū)分試驗取得了較好效果，為華池縣下一步開展集中免疫工作提供了科學(xué)依據(jù)。

4 建議

布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）為減毒活疫苗，應(yīng)當避免對懷孕母羊進行免疫，應(yīng)于產(chǎn)羔后或配種前進行免疫。但在實際生產(chǎn)過程中，無法精準確定懷孕羊只，尤其是妊娠初期，無法進行識別，在進行疫苗推廣時，建議與農(nóng)戶進行溝通，明確配種日期，避免造成不必要的經(jīng)濟損失。

布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90△26株）為減毒活疫苗，對牲畜和免疫接種操作人員仍有一定危害。因此，應(yīng)對獸醫(yī)技術(shù)人員和其他協(xié)助免疫的人員進行疫苗免疫技術(shù)、個人防護和防止疫病傳播知識的培訓(xùn)。免疫時必須正確穿戴工作服、膠靴、手套、口罩、護目鏡等，做好個人防護。