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      當(dāng)歸芍藥散對(duì)血管性癡呆模型大鼠炎癥反應(yīng)、神經(jīng)凋亡、Aβ 轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)細(xì)胞因子的影響

      2024-03-14 01:52:42曲美潔唐詠春臧運(yùn)華王瀟慧周喜燕
      江蘇中醫(yī)藥 2024年3期
      關(guān)鍵詞:芍藥海馬低劑量

      曲美潔 唐詠春 臧運(yùn)華 于 淼 王瀟慧 周喜燕

      (1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,山東濟(jì)南 250199;2.青島大學(xué)附屬海慈醫(yī)院,山東青島 266033)

      隨著我國(guó)老齡人口的增加,血管性癡呆(vascular dementia,VaD)的發(fā)病率與日俱增,我國(guó)VaD患者占據(jù)全球VaD患者總數(shù)的四分之一。本病作為血管性認(rèn)知障礙,是由腦血管疾病引起腦區(qū)低灌注引起,以語(yǔ)言、情感功能、認(rèn)知功能的障礙及記憶力下降為主要臨床表現(xiàn)[1]。當(dāng)前VaD發(fā)病機(jī)制尚不明確,主要集中在炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元細(xì)胞鈣超負(fù)荷等方面[2]。作為僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆類型,也是目前唯一可以預(yù)防治療的癡呆類型[3],本病目前主要的治療方法是采用多種藥物聯(lián)合,控制炎癥反應(yīng)、保護(hù)腦神經(jīng)[4],但尚未取得理想的治療效果。因此,臨床針對(duì)VaD的研究重點(diǎn)主要以早期防治為主,延緩病情進(jìn)展,減輕VaD患者痛苦。相關(guān)研究表明,炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡等機(jī)制是VaD形成的關(guān)鍵[5]。腦組織缺血缺氧,導(dǎo)致局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元等被激活,釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核因子κB(NF-κB)等炎性因子,促進(jìn)腦組織β-淀粉樣蛋白(Aβ)產(chǎn)生,引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,損傷腦組織,從而引起認(rèn)知障礙[6-7]。因此,減少炎性因子釋放和Aβ產(chǎn)生、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善神經(jīng)損傷是防治血管性癡呆發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子機(jī)制。

      當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》,具有養(yǎng)血柔肝、健脾祛濕等功效?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),當(dāng)歸芍藥散中含有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)神經(jīng)等多種有效成分[8],可以起到明顯的擴(kuò)張末梢血管、改善微循環(huán)、促進(jìn)腦代謝活化功效[9],對(duì)VaD患者的癥狀具有較好的改善作用。因此本實(shí)驗(yàn)研究基于炎癥因子釋放、神經(jīng)元凋亡等因素,通過(guò)永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立VaD動(dòng)物模型,觀察當(dāng)歸芍藥散對(duì)VaD模型大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力、海馬組織細(xì)胞凋亡的影響,及其對(duì)TNF-α/NF-κB信號(hào)通路,以及B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、兔抗人單克隆抗體(Bax)蛋白和低密度脂蛋白受體(LRP1)、糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)基因的調(diào)控作用,探索其可能的作用機(jī)制。

      1 實(shí)驗(yàn)材料

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 封閉群純種SPF級(jí)SD雄性健康大鼠,體重180~220 g,由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬海慈醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(倫理審批編號(hào):2022HC05LS013)。大鼠在安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng),自由飲水、攝食,室溫(23±1)℃,相對(duì)濕度60%,光線自動(dòng)控制,每12 h明暗交替,統(tǒng)一使用符合規(guī)定的大鼠飼料和水喂養(yǎng)。

      1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 當(dāng)歸芍藥散,藥物組成:當(dāng)歸9 g、白芍48 g、川芎24 g、茯苓12 g、澤瀉24 g、白術(shù)12 g,所有藥品均購(gòu)自青島市中醫(yī)院中藥房,且均為道地藥材。藥液制備方法:藥物使用超純水浸泡1 h后,大火煮沸,轉(zhuǎn)文火再煮沸30 min,收集藥液,剩余藥材重復(fù)上述步驟再次煎煮,收集并混合2次藥液,60 ℃濃縮,分裝,置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?,使用前加熱并用超純水稀釋成濃度分別為72 mg/mL(高劑量)、18 mg/mL(低劑量)的藥液。

      尼莫地平片,拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn),批號(hào):H20003010,規(guī)格20 mg,研磨成粉,用超純水配置成濃度16.8 mg/mL的溶液,置于-20 ℃冰箱備用。

      1.3 主要試劑 二甲苯、無(wú)水乙醇、碳酸鋰、冰醋酸、30%H2O2(批 號(hào):10023418、10009218、20022818、10000218、10011218),購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蘇木素伊紅(批號(hào):G1004),購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司;Bax兔抗人單克隆抗體(1∶1000,批號(hào):PAB46088)、兔Bcl-2 單克隆抗體(1∶1000,批號(hào):A00040-1),購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;兔抗大鼠TNF-α抗體、兔抗大鼠NF-κB抗體,購(gòu)自英國(guó)abcam公司;TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、NF-κB ELISA試劑盒、蛋白Marker、DAB顯色液、2×Tap聚合酶鏈?zhǔn)?反 應(yīng)(PCR)master Mix(批 號(hào):QYH-12018、P12103、G1022、G3302-01),購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司;PVDF轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑(批號(hào):IPVH00010、WBKLS0500),購(gòu)自上海未熹生物科技有限公司;DAB濃縮試劑盒、封閉山羊血清、終止液(批號(hào):DA1010、SL038、C1058),購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;20×Tris-EDTA修復(fù)液、TBE電泳緩沖液(批號(hào):G1203、G3002),購(gòu)自武漢塞維爾生物科技公司;PBS緩沖液,購(gòu)自山東西亞化學(xué)有限公司;枸櫞酸緩沖液(批號(hào):BL604A),購(gòu)自福州奧研實(shí)驗(yàn)器材責(zé)任公司;溴酚藍(lán)指示劑(批號(hào):115-39-9),購(gòu)自湖北興琰新材料科技有限公司。

      1.4 主要儀器 正置顯微鏡、石蠟切片機(jī)(型號(hào):DM1000、RM2235),購(gòu)自徠卡纖維系統(tǒng)有限公司;移液器(型號(hào):P100、P200),購(gòu)自吉爾森P型移液器公司;恒溫烘箱(型號(hào):DHG-9023A),購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;攤片烤片機(jī)、自動(dòng)組織脫水機(jī)(型號(hào):TKD-TK、TKD-TSF),購(gòu)自湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司;穩(wěn)壓DNA電泳儀(型號(hào):mini protean 3 cell),購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司;恒溫烘箱(型號(hào):TY-HX),購(gòu)自臺(tái)裕科技公司;水迷宮(型號(hào):BW-MWM101),購(gòu)自上海軟隆科技發(fā)展有限公司;實(shí)時(shí)免疫熒光PCR儀(型號(hào):MiniAmp),購(gòu)自美國(guó)ABI公司;全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(型號(hào):HISCL-5000),購(gòu)自上海繼圣醫(yī)療器械有限公司;離心機(jī)(批號(hào):SMP-2),購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。

      2 實(shí)驗(yàn)方法

      2.1 造模與分組 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后,行Morris水迷宮測(cè)試,剔除120 s內(nèi)找不到平臺(tái)者。測(cè)試結(jié)束3 d后采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法建立VaD動(dòng)物模型[10]:造模前禁食12 h,注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉,確保手術(shù)期間大鼠有自主呼吸;保持仰臥姿勢(shì),固定頭部,去毛備皮,消毒后沿頸正中切開(kāi),分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈后選用0號(hào)慕絲線結(jié)扎,縫合傷口。另取12只SD大鼠作為假手術(shù)組,假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎頸總動(dòng)脈,只做皮膚切口和組織分離處理后縫合皮膚。手術(shù)后各組大鼠均予青霉素10萬(wàn)單位肌注3 d防感染,觀察大鼠待活動(dòng)正常后放回實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)喂養(yǎng)。術(shù)后3 d,所有造模大鼠再次行水迷宮測(cè)試,逃避潛伏期>55 s,跨越平臺(tái)頻率<1 次/60 s,且出現(xiàn)精神較差、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少、舌質(zhì)暗紅等表現(xiàn)者,表明造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和當(dāng)歸芍藥散低、高劑量組,每組12只。

      2.2 給藥 造模完成1 周后開(kāi)始灌胃給藥。陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予尼莫地平片1.68 g/(kg·d),當(dāng)歸芍藥散低、高劑量組分別灌胃給予中藥溶液1.8、7.2 g/(kg·d),假手術(shù)組、模型組每日灌胃給予等體積蒸餾水。各組均每日灌胃1次,灌胃體積為1 mL/10 g,連續(xù)4周。

      2.3 取材 末次灌胃后次日,每組隨機(jī)取8只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試;測(cè)試結(jié)束后次日,每組大鼠再隨機(jī)取8只,腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉,于腹主動(dòng)脈處取血,離心分離血清,于-20 ℃冰箱中保存擬用于ELISA法檢測(cè);隨后迅速斷頭處死大鼠,取部分海馬組織,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,用于免疫組化、蘇木素-伊紅(HE)染色;另取部分海馬組織放入凍存管,立即轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中凍存,用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。

      2.4 指標(biāo)檢測(cè)

      2.4.1 Morris水迷宮測(cè)試行為能力 末次灌胃結(jié)束后,各組大鼠禁食禁水24 h,每組隨機(jī)選取8只,采用Morris水迷宮測(cè)試檢測(cè)各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。測(cè)試包括兩項(xiàng):(1)定位巡航試驗(yàn)檢測(cè)逃避潛伏期:每只大鼠連續(xù)訓(xùn)練4 d,按照設(shè)計(jì)好的順序?qū)⑵涿嫦虺乇?,從各入水口放入水中,記?0 s內(nèi)找到平臺(tái)的實(shí)際時(shí)間(即逃避潛伏期),如果大鼠在60 s內(nèi)找不到平臺(tái),則由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)找到平臺(tái),記錄逃避潛伏期為60 s。每次找到平臺(tái)后,均使其于平臺(tái)停留20 s。(2)空間探索試驗(yàn)檢測(cè)穿越平臺(tái)數(shù):定位巡航試驗(yàn)結(jié)束后次日,使大鼠面向池壁,輕輕放入水中,入水口選在平臺(tái)對(duì)角處,測(cè)試時(shí)間60 s,記錄其穿越平臺(tái)位置的次數(shù),判斷大鼠記憶存儲(chǔ)和再現(xiàn)能力。

      2.4.2 HE染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元組織病理形態(tài)變化 取浸泡于4%多聚甲醛中固定的各組大鼠海馬組織,按常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋,沿矢狀面切片,厚度約4 μm,嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行HE染色,中性樹(shù)脂膠封片,光鏡下觀察海馬組織病理形態(tài),評(píng)價(jià)神經(jīng)元損傷程度。

      2.4.3 免疫組化法檢測(cè)海馬組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 取每組8只大鼠海馬組織按常規(guī)步驟脫水、浸蠟、包埋后切片,厚度4 μm,65 ℃烤片1 h后脫蠟水化;用枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù);3%H2O2濕盒孵育10 min,PBS緩沖液沖洗,阻斷后置于封閉山羊血清中室溫封閉,分別滴加Bax(稀釋比為1∶200)、Bcl-2抗體(稀釋比為1∶100),4 ℃冰箱孵育過(guò)夜,復(fù)溫45 min后滴加二抗,DAB顯色后,經(jīng)蘇木精復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。于光學(xué)顯微鏡下拍照觀察,并采用Image J軟件分析OD值。

      2.4.4 ELISA法 檢 測(cè) 大 鼠 血 清TNF-α、NF-κB含量 取每組8只大鼠血清,按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)上的操作步驟進(jìn)行檢測(cè),于多功能酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取OD值并進(jìn)行分析,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠血清TNF-α、NF-κB含量。

      2.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)海馬組織LRP1 mRNA、RAGE mRNA表達(dá) 取凍存的各組大鼠海馬組織約100 mg,使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,電泳確定RNA完整性,并檢測(cè)RNA純度及濃度,將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,以適量cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性持續(xù)1 min,95 ℃變性持續(xù)5 s,60 ℃退火持續(xù)10 s,72 ℃延伸30 s,連續(xù)循環(huán)40次。系列反應(yīng)結(jié)束后得到Ct值,采用2-△△Ct計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

      表1 大鼠海馬組織LRP1、RAGE mRNA引物序列

      2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究所有計(jì)量資料均滿足正態(tài)分布,采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,經(jīng)檢驗(yàn)(檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05),資料均滿足方差齊性,采用單因素方差分析,組間比較采用LSD法。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      3.1 各組大鼠行為能力比較 定位巡航試驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組大鼠每日逃避潛伏期均明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組(P<0.01);各給藥組大鼠每日逃避潛伏期均明顯短于模型組(P<0.01),其中當(dāng)歸芍藥散高劑量組每日逃避潛伏期均明顯短于低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05,P<0.01),當(dāng)歸芍藥散低劑量組第4天逃避潛伏期與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)??臻g探索試驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯少于假手術(shù)組(P<0.01);各給藥組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯多于模型組(P<0.05,P<0.01),其中當(dāng)歸芍藥散高劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)明顯多于低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01),當(dāng)歸芍藥散低劑量組穿越平臺(tái)次數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

      表2 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試行為能力比較(±s)

      表2 各組大鼠Morris水迷宮測(cè)試行為能力比較(±s)

      注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與當(dāng)歸芍藥散低劑量組比較,☆☆P<0.01。

      逃避潛伏期/s穿越平臺(tái)數(shù)/次第1天 第2天 第3天 第4天假手術(shù)組 8 22.36±1.00 13.39±0.84 10.93±0.37 9.63±0.75 2.72±0.46模型組 8 56.43±3.09** 48.20±3.59** 42.18±3.58** 39.17±2.68** 1.35±0.09**陽(yáng)性對(duì)照組 8 29.44±2.15△△ 27.43±1.62△△ 20.52±1.24△△ 12.08±1.08△△ 1.51±0.11△△當(dāng)歸芍藥散低劑量組 8 42.44±2.10△△## 37.03±1.88△△## 28.08±1.30△△## 12.03±0.68△△ 1.40±0.05△當(dāng)歸芍藥散高劑量組 8 25.71±2.07△△##☆☆ 19.08±2.60△△##☆☆ 13.61±1.58△△##☆☆ 9.94±0.94△△#☆☆ 2.89±0.32△△##☆☆組別 動(dòng)物數(shù)/只

      3.2 各組大鼠海馬組織病理形態(tài)比較 假手術(shù)組大鼠海馬組織CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)量多,體積大,排列整齊,結(jié)構(gòu)正常,邊界清晰,胞膜、核膜清晰,胞核明顯。模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,排列稀疏,部分細(xì)胞腫脹,結(jié)構(gòu)不齊,胞核變小、固縮、凋亡,細(xì)胞膜、核膜界限不清。與模型組比較,各給藥組大鼠神經(jīng)元病理改變均較輕,其中當(dāng)歸芍藥散高劑量組大鼠海馬組織CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)量顯著多于模型組,排列分布相對(duì)齊整,結(jié)構(gòu)形態(tài)基本正常。詳見(jiàn)圖1。

      圖1 各組大鼠海馬組織病理形態(tài)(HE染色,×100)

      3.3 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 模型組大鼠海馬組織Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量、Bcl-2/Bax值均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01),Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)。各給藥組大鼠海馬組織Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量、Bcl-2/Bax值均明顯低于模型組(P<0.01),Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組(P<0.01)。當(dāng)歸芍藥散高劑量對(duì)上述指標(biāo)的改善作用顯著優(yōu)于低劑量和陽(yáng)性藥物(P<0.01),當(dāng)歸芍藥散低劑量組Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá) 量、Bcl-2/Bax值 與 陽(yáng) 性 對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖2、表3。

      表3 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量及Bcl-2/Bax值比較(±s)

      表3 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量及Bcl-2/Bax值比較(±s)

      注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與當(dāng)歸芍藥散低劑量組比較,☆☆P<0.01。

      組別 動(dòng)物數(shù)/只 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax假手術(shù)組 8 0.19±0.04 0.13±0.03 1.46±0.25模型組 8 0.28±0.03** 0.08±0.02** 3.54±0.66**陽(yáng)性對(duì)照組 8 0.18±0.02△△ 0.19±0.01△△ 0.96±0.09△△當(dāng)歸芍藥散低劑量組 8 0.18±0.02△△ 0.15±0.01△△# 1.18±0.11△△當(dāng)歸芍藥散高劑量組 8 0.11±0.03△△##☆☆ 0.33±0.05△△##☆☆ 0.35±0.05△△##☆☆

      3.4 各組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量比較 模型組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量均顯著高于假手術(shù)組(P<0.01);各給藥組大鼠血清上述指標(biāo)含量均顯著低于模型組(P<0.01),其中當(dāng)歸芍藥散高劑量組大鼠上述指標(biāo)水平均顯著低于低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01)。詳見(jiàn)表4。

      表4 各組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量比較(±s)

      表4 各組大鼠血清TNF-α、NF-κB含量比較(±s)

      注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較,##P<0.01;與當(dāng)歸芍藥散低劑量組比較,☆☆P<0.01。

      組別 動(dòng)物數(shù)/只 TNF-α/(pg/mL) NF-κB/(pg/mL)假手術(shù)組 8 50.16±10.10 26.81±4.11模型組 8 339.05±36.32** 180.13±11.64**陽(yáng)性對(duì)照組 8 176.08±11.14△△ 90.97±5.32△△當(dāng)歸芍藥散低劑量組 8 236.96±14.9△△## 118.58±7.70△△##當(dāng)歸芍藥散高劑量組 8 117.90±19.34△△##☆☆ 59.94±6.76△△##☆☆

      3.5 各組大鼠海馬組織LRP1、RAGE mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 模型組大鼠海馬組織LRP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于假手術(shù)組(P<0.01),RAGE mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)。各給藥組大鼠海馬組織LRP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于模型組(P<0.01),RAGE mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.01)。當(dāng)歸芍藥散高劑量對(duì)大鼠海馬組織上述基因表達(dá)的改善作用顯著優(yōu)于低劑量和陽(yáng)性藥物(P<0.05,P<0.01),當(dāng)歸芍藥散低劑量對(duì)大鼠海馬組織LRP1 mRNA表達(dá)的提升作用顯著優(yōu)于陽(yáng)性藥物(P<0.01)。詳見(jiàn)表5。

      表5 各組大鼠海馬組織LRP1 mRNA、RAGE mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

      表5 各組大鼠海馬組織LRP1 mRNA、RAGE mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

      注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與當(dāng)歸芍藥散低劑量組比較,☆☆P<0.01。

      組別 動(dòng)物數(shù)/只 LRP1 mRNA RAGE mRNA假手術(shù)組 8 8.55±0.24 0.20±0.02模型組 8 0.85±0.07** 13.18±1.50**陽(yáng)性對(duì)照組 8 1.66±0.31△△ 1.00±0.07△△當(dāng)歸芍藥散低劑量組 8 2.10±0.12△△## 7.92±0.52△△##當(dāng)歸芍藥散高劑量組 8 9.79±0.53△△##☆☆ 0.30±0.03△△#☆☆

      4 討論

      研究表明,VaD疾病進(jìn)程與NF-κB、TNF-α等炎性因子激活炎癥反應(yīng),Bax、Bcl-2等凋亡因子加速神經(jīng)凋亡,LRP1、RAGE等轉(zhuǎn)運(yùn)因子調(diào)控Aβ沉積等密切相關(guān),治療本病則應(yīng)基于改善Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元凋亡,調(diào)節(jié)Aβ沉積,抑制炎癥信號(hào)傳遞,增強(qiáng)血流灌注,在一定程度上減少腦組織損傷。

      血管性癡呆屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”范疇,《雜病源流犀燭·中風(fēng)源流》中提及“中風(fēng)后善忘”。本病病機(jī)復(fù)雜,可因五臟失和、腦竅失養(yǎng)、神失所養(yǎng)、神機(jī)失用而發(fā)病?,F(xiàn)代醫(yī)家基于前人經(jīng)驗(yàn)提出本病病因病機(jī)為髓海不足、脾腎不足、肝氣郁結(jié)、痰濁蒙竅等,以補(bǔ)髓益智、補(bǔ)益脾腎、行氣化郁等為治則,祛邪扶正,改善患者癥狀。當(dāng)歸芍藥散由當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、澤瀉、川芎六味藥物組成。方中川芎、當(dāng)歸、白芍補(bǔ)益氣血,茯苓、澤瀉、白術(shù)祛水化濕,其中白芍兼疏肝化瘀[11]。諸藥合用,開(kāi)斂結(jié)合,走守并進(jìn),以肝脾兩臟入手,健脾益氣、養(yǎng)血柔肝,增強(qiáng)患者正氣,祛除積留體內(nèi)濕瘀之邪[12]。VaD患者多因肝脾不足、痰瘀阻滯而腦竅不通、神機(jī)失養(yǎng),故以當(dāng)歸芍藥散補(bǔ)益肝脾、化痰祛瘀?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸芍藥散可通過(guò)調(diào)控凋亡因子、抑制炎癥反應(yīng)和減少Aβ沉積等途徑,調(diào)控炎癥介質(zhì)分泌,發(fā)揮抗炎作用,延緩細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)免疫[13-15],與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥物治療VaD方向一致。

      細(xì)胞凋亡受Bcl-2、Bax等凋亡因子影響[16],控制線粒體膜的通透性,調(diào)節(jié)凋亡激活物的釋放,激活通道,Bax與Bcl-2形成易聚體,兩者協(xié)作調(diào)控細(xì)胞凋亡,因此逆轉(zhuǎn)兩種蛋白表達(dá),可減輕腦損傷,一定程度上起到修復(fù)腦神經(jīng)的作用[17-18]。Aβ對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用導(dǎo)致血管壁淀粉樣變,進(jìn)而導(dǎo)致血管硬化、彈性變差,增加血管壁破裂以及血栓形成風(fēng)險(xiǎn),甚至誘使神經(jīng)元過(guò)早凋亡。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),Aβ沉積抑制突觸生長(zhǎng),導(dǎo)致神經(jīng)變性,降低神經(jīng)元存活率,進(jìn)而推動(dòng)VaD病情進(jìn)展[19]。LRP1作為大腦中參與代謝的主要受體,廣泛存在于神經(jīng)元細(xì)胞中,不僅參與脂質(zhì)代謝,而且是清除Aβ的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體,其功能水平降低與認(rèn)知性障礙加重密切相關(guān)[20];RAGE作為膜蛋白,則是通過(guò)介導(dǎo)多種激酶,激活炎癥信號(hào)通路,引起細(xì)胞凋亡壞死[21]。LRP1與RAGE均為Aβ重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,參與調(diào)節(jié)Aβ沉積[22],抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活、神經(jīng)炎癥發(fā)生、神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程[23]。NF-κB作為缺血損傷反應(yīng)最早的關(guān)鍵因子,同時(shí)又是起關(guān)鍵作用的核轉(zhuǎn)錄因子[24],在機(jī)體炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的分裂分化和成熟等方面發(fā)揮重要作用[25],腦缺血組織損傷激活NF-κB[26],促進(jìn)TNF-α表達(dá)[27],若抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用,減少神經(jīng)炎癥反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,保護(hù)神經(jīng)元功能,則能延緩VaD疾病進(jìn)程[28]。

      本研究結(jié)果表明,模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯異常,海馬組織神經(jīng)元損傷,血清TNF-α、NF-κB表達(dá)增加,海馬組織Bcl-2蛋白表達(dá)增加,Bax蛋白表達(dá)降低,Bcl-2/Bax值增加,LRP1 mRNA表達(dá)降低,RAGE mRNA表達(dá)增加,炎癥、凋亡及Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)細(xì)胞因子均出現(xiàn)異常表現(xiàn)。經(jīng)當(dāng)歸芍藥散、尼莫地平治療后,VaD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高,海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)明顯恢復(fù),上述細(xì)胞因子得到顯著改善,其中當(dāng)歸芍藥散高劑量效果更為明顯,顯著優(yōu)于低劑量和陽(yáng)性藥物尼莫地平。

      綜上,當(dāng)歸芍藥散對(duì)VaD模型大鼠有一定的治療作用,且可顯著改善VaD模型大鼠海馬組織細(xì)胞形態(tài),其可能的作用機(jī)制:通過(guò)抑制TNF-α、NF-κB表達(dá)緩解大鼠海馬組織炎癥反應(yīng),一定程度上減少腦組織損傷,提高認(rèn)知水平;通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax凋亡因子延緩細(xì)胞凋亡,改善VaD神經(jīng)損傷,起到腦保護(hù)作用;通過(guò)激活LRP1、抑制RAGE兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,促進(jìn)Aβ清除,減少Aβ沉積,促進(jìn)海馬突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng),進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元,促進(jìn)神經(jīng)重塑。且當(dāng)歸芍藥散上述作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。由于本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本數(shù)較少,藥物濃度梯度不足,下一步將增加樣本量,豐富中藥濃度梯度,并進(jìn)一步分析當(dāng)歸芍藥散有效成分,探索其他作用靶點(diǎn),深入研究其作用機(jī)制,從而更好地指導(dǎo)臨床運(yùn)用。

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