紅花注射液生物活性測(cè)定法的建立與評(píng)價(jià)研究

劉金輝，梁耀月，田穎穎，趙新月，李依林，呂英楠，劉闖，左澤平，王志斌，（.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 00029；2.北京同仁堂股份有限公司科學(xué)研究所，北京 00079；.康龍化成（北京）生物技術(shù)有限公司，北京 0076）

質(zhì)量的穩(wěn)定可控是確保中藥安全有效的前提[1]。目前，中藥質(zhì)量控制手段仍以化學(xué)手段檢測(cè)指標(biāo)性成分為主[2]。然而，中藥療效涉及多個(gè)代謝和信號(hào)途徑，由多組分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)共同發(fā)揮作用[3-6]。中藥的藥效是綜合生物效應(yīng)的體現(xiàn)，中藥注射劑更是如此，進(jìn)入體內(nèi)后發(fā)揮藥效物質(zhì)眾多，單一的化學(xué)成分控制并不能全面反映藥效，現(xiàn)有的中藥質(zhì)控模式并不能完全保證中藥的有效性。因此，亟須建立一種能夠體現(xiàn)臨床療效的質(zhì)控新模式，通過量化中藥有效性反應(yīng)并從整體控制中藥的質(zhì)量。近年來，生物活性測(cè)定已經(jīng)引起廣泛關(guān)注和認(rèn)可[7]，該方法從中藥臨床療效的角度反映其質(zhì)量，可用于有效成分不清、組分繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、常規(guī)方法不能有效鑒定，但具有明確的生物活性的中藥的評(píng)估。

紅花注射液有顯著的抗血栓作用，部頒標(biāo)準(zhǔn)中紅花注射液是以羥基紅花黃色素A、總黃酮（以山柰酚計(jì)）來評(píng)價(jià)其質(zhì)量是否合格。已有研究對(duì)紅花注射液中的化學(xué)成分進(jìn)行全面表征，并研究其進(jìn)入體內(nèi)后的代謝產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除指標(biāo)性成分外，還有其他具有抗血小板聚集的成分及其代謝產(chǎn)物[8-9]，由此可見，僅僅依賴這些指標(biāo)性成分難以表征其有效性。所以，本研究以抗血小板聚集作用為紅花注射液生物活性測(cè)定的指標(biāo)，在現(xiàn)有的紅花注射液質(zhì)量控制的模式上作為補(bǔ)充方法，并通過試驗(yàn)系、量效關(guān)系及方法學(xué)研究建立紅花注射液生物活性測(cè)定方法，為其生物活性測(cè)定奠定了基礎(chǔ)，推動(dòng)更加全面的紅花注射液的質(zhì)量控制，本研究對(duì)于補(bǔ)充優(yōu)化紅花注射液的質(zhì)量控制方法具有重要意義。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)日本大耳白兔，1.8～2.2 kg [北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0006，合格證號(hào)為1103231911000416]。

1.2 試藥

生理鹽水（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：1809013205），血小板聚集功能檢測(cè)試劑盒[花生四烯酸（AA）激活的比濁法，批號(hào)：401034]、血小板聚集功能檢測(cè)試劑盒[二磷酸腺苷（ADP）激活的比濁法，批號(hào)：20190109B]、一次性測(cè)試杯、AG 400半自動(dòng)血小板聚集儀（山東泰利康信生物科技有限公司），全自動(dòng)血液分析儀（ADVIA 2120I西門子股份公司），紅花注射液標(biāo)準(zhǔn)品（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào)：19030100504）；紅花注射液供試品共4個(gè)廠家9個(gè)批次，詳見表1。

表1 紅花注射液供試品廠家批號(hào)信息Tab 1 Batch number of test material manufacturers of Safflower injection

2 方法與結(jié)果

2.1 血漿制備

采取家兔頸總動(dòng)脈血，加3.2%枸櫞酸鈉抗凝（采血量∶抗凝劑＝9∶1），160 g離心10 min，吸取上層富血小板血漿（PRP），剩余血樣以3500 g離心10 min，吸取貧血小板血漿（PPP）。用全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定PRP和PPP中的初始血小板數(shù)量。后續(xù)實(shí)驗(yàn)用PPP稀釋調(diào)整PRP數(shù)量。

2.2 血小板聚集率測(cè)定

取PPP 290 μL，添加生理鹽水10 μL，依次添加不同含量的樣品液10 μL，用其進(jìn)行儀器調(diào)零。再取PRP 290 μL，依次添加不同含量的樣品液10μL，37℃孵育180 s，并加入適量體積的血小板凝聚為誘導(dǎo)劑，讀取在300 s內(nèi)的最大凝聚量，得出聚集曲線。血小板測(cè)定在采血后4 h內(nèi)完成。

2.3 試驗(yàn)系考察

2.3.1 紅花注射液對(duì)不同誘導(dǎo)劑致血小板聚集作用的影響 將ADP配制成600 μmol·L－1的溶液，在血小板聚集試驗(yàn)中ADP終濃度分別為20、10、5、2.5 μmol·L－1。將AA配制成5 g·L－1的溶液，在血小板聚集試驗(yàn)中AA終質(zhì)量濃度為250 μg·mL－1。按照“2.2”項(xiàng)下血小板聚集率測(cè)定方法，考察不同誘導(dǎo)劑對(duì)血小板聚集作用的影響，結(jié)果如表2所示，與正常對(duì)照組相比，紅花注射液對(duì)ADP和AA致家兔體外血小板聚集均有明顯的抑制作用（P＜0.01）；紅花注射液對(duì)ADP致血小板聚集具有更為顯著的抑制作用，因此選取ADP作為血小板聚集誘導(dǎo)劑。

表2 紅花注射液對(duì)不同誘導(dǎo)劑致家兔體外血小板聚集作用的影響(±s，n＝7)Tab 2 Effect of Safflower injection on the platelet aggregation in rabbits in vitro caused by different inducers (±s，n＝7)

表2 紅花注射液對(duì)不同誘導(dǎo)劑致家兔體外血小板聚集作用的影響(±s，n＝7)Tab 2 Effect of Safflower injection on the platelet aggregation in rabbits in vitro caused by different inducers (±s，n＝7)

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01。Note：Compared with the normal control group，**P＜0.01.

ADPAA血小板聚集率/%組別抑制率/%正常對(duì)照組43.92±2.23—76.19±4.49—紅花注射液 16.96±2.33**61.38 59.16±2.71**22.35抑制率/%血小板聚集率/%

2.3.2 血小板數(shù)量和誘導(dǎo)劑ADP濃度對(duì)家兔體外血小板聚集率的影響 將不同數(shù)量血小板（100×109、200×109、300×109、400×109、500×109、600×109、700×109個(gè)·L－1）加入不同濃度的血小板激動(dòng)劑ADP（20、10、5、2.5 μmol·L－1），所得到的血小板聚集率結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，當(dāng)ADP濃度為10 μmol·L－1時(shí)，血小板數(shù)量大于300×109個(gè)·L－1時(shí)，血小板聚集率達(dá)到平臺(tái)期；但血小板數(shù)量在700×109個(gè)·L－1時(shí)，血小板聚集率稍有下降。當(dāng)ADP濃度為5 μmol·L－1時(shí)，血小板數(shù)量大于400×109個(gè)·L－1時(shí)，血小板聚集率達(dá)到平臺(tái)期，且血小板聚集率曲線波動(dòng)變化平緩，因此選用ADP濃度為5 μmol·L－1。為后期避免加入藥液體積和ADP的體積對(duì)血小板數(shù)量的影響，因此選用血小板的數(shù)量為500×109個(gè)·L－1。

圖1 血小板數(shù)量和誘導(dǎo)劑ADP濃度對(duì)血小板聚集率的影響Fig 1 Effect of platelet count and inducer ADP concentration on platelet aggregation rate

2.4 劑間比考察

按照生物活性測(cè)定法中量反應(yīng)平行線測(cè)定法對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的高低劑間比例的要求（1∶0.8）～（1∶0.5），紅花注射液標(biāo)準(zhǔn)品分別按劑間比1∶0.8、1∶0.7、1∶0.6、1∶0.5進(jìn)行配制，用生理鹽水分別稀釋成濃度為80.0%、64.0%、51.2%、41.0%、32.8%、26.2%、21.0%、16.8%、13.4%、10.7%、8.6%（劑間比1∶0.8）；70.0%、49.0%、34.3%、24.0%、16.8%、11.8%、8.2%（劑間比1∶0.7）；60.0%、36.0%、21.6%、13.0%、7.8%（劑間比1∶0.6）；50.0%、25.0%、12.5%、6.3%（劑間比1∶0.5），備用。

分別考察在1∶0.8、1∶0.7、1∶0.6、1∶0.5不同劑間比的量效關(guān)系，每個(gè)濃度點(diǎn)平行測(cè)定3次，以紅花注射液濃度為X軸，血小板抑制率均值為Y軸作量效關(guān)系曲線圖，結(jié)果如圖2所示，紅花注射液劑間比為1∶0.5時(shí)，隨著紅花注射液濃度的上升，血小板聚集抑制率呈上升趨勢(shì)，紅花注射液的濃度與血小板聚集抑制率的量效關(guān)系更為顯著且3次測(cè)定的平行性良好。

圖2 紅花注射液標(biāo)準(zhǔn)品（不同劑間比）的量效關(guān)系考察結(jié)果Fig 2 Quantitative and qualitative relationship of Safflower injection standard（different inter-dose ratios）

2.5 量效學(xué)考察結(jié)果

取配制好的紅花注射液，分別測(cè)定含藥兔血漿在5 min內(nèi)的血小板最大聚集率，平行測(cè)定3次，考察量效關(guān)系。綜合評(píng)判量效關(guān)系檢測(cè)結(jié)果，選取劑間比為1∶0.5（6.3%、12.5%、25%、50%、100%）測(cè)定，平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示，隨著紅花注射液濃度的上升，血小板聚集抑制率呈上升趨勢(shì)，且量效關(guān)系較好。以紅花注射液濃度為X軸，血小板聚集抑制率均值為Y軸作量效關(guān)系曲線圖，如圖3所示，結(jié)果顯示3次測(cè)定的平行性良好，每次測(cè)定的結(jié)果均顯示良好量效關(guān)系。

圖3 三次測(cè)定的量效關(guān)系考察結(jié)果Fig 3 Examination results of the quantitative and qualitative relationships of the three measurements

2.6 測(cè)定方法的確定

利用量反應(yīng)平行線（3.3）法[10]進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。按照量反應(yīng)平行線（3.3）測(cè)定法中要求對(duì)數(shù)劑量（x）和反應(yīng)或反應(yīng)的特定函數(shù)（y）呈直線關(guān)系，因此需要考察線性關(guān)系。紅花注射液選取100%、50%、25% 3個(gè)濃度劑量，以紅花注射液濃度對(duì)數(shù)值為X軸，體外血小板聚集抑制率的對(duì)數(shù)值為Y軸作圖，標(biāo)示線性方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如圖4所示，紅花注射液在100%、50%、25% 3個(gè)濃度劑量時(shí)，血小板聚集抑制率的對(duì)數(shù)值與紅花注射液濃度對(duì)數(shù)值線性關(guān)系較好，3次測(cè)定結(jié)果的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)分別為 0.9887、0.9941、0.9624，均在0.9以上，因此可以采用量反應(yīng)平行線（3.3）法測(cè)定效價(jià)。

圖4 線性考察結(jié)果Fig 4 Linear investigation

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 效價(jià)測(cè)定與可靠性 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品按劑間比1∶0.5分別配制高（SH）、中（SM）、低（SL）3個(gè)濃度，即100%、50%和25%。每一濃度平行測(cè)定3次，相應(yīng)的血小板聚集抑制率如表3所示。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品及供試品的血小板聚集抑制率(%，n＝3)Tab 3 Platelet aggregation inhibition rate of the standard and the test material (%，n＝3)

以濃度為100%的紅花注射液標(biāo)準(zhǔn)品血小板聚集抑制率1%為1個(gè)效價(jià)單位（U），1 mL的效價(jià)（U·mL－1）＝X×（1/0.01），X為紅花注射液血小板聚集抑制率的數(shù)值。據(jù)效價(jià)定義，測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)為75.94×（1/0.01）＝7594 U·mL－1，測(cè)定供試品（批號(hào)：19040101001）的效價(jià)為8478.5 U·mL－1，可信限率（FL）為15.421%，可信限范圍在7288～9903 U·mL－1。采用量反應(yīng)平行線（3.3）測(cè)定法進(jìn)行供試品的效價(jià)測(cè)定，并進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，結(jié)果如表4所示，供試品間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明兩組的效價(jià)無顯著性差異，表示供試品的標(biāo)示量基本正確。變異來源中的回歸應(yīng)非常顯著（P＜0.01），偏離平行、二次曲線、反向二次曲線均應(yīng)無顯著性意義，表示兩條直線基本平行并符合直線關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)中，回歸項(xiàng)非常顯著（P＜0.01），其余三項(xiàng)均無顯著性意義（P＞0.05），符合要求。劑間差異應(yīng)有顯著性意義，表示試驗(yàn)劑量安排合理，本試驗(yàn)中劑間差異顯著（P＜0.01），滿足要求。以上結(jié)果表明測(cè)定供試品紅花注射液的效價(jià)準(zhǔn)確，F(xiàn)L＜20%，說明方法可靠。

表4 供試品的可靠性檢驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Reliability of the test material

2.7.2 重復(fù)性 在相同條件下，取待測(cè)批次的紅花注射液重復(fù)測(cè)定6次，分別測(cè)得6次效價(jià)和可信限率并進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，計(jì)算結(jié)果的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），6次測(cè)定的效價(jià)為（7697.32±321.38）U·mL－1，RSD為4.175%，小于10%；FL平均值16.47%，小于20%，說明該方法測(cè)定的效價(jià)重復(fù)性良好。

2.7.3 中間精密度 在相同條件下，不同人員取待測(cè)批次的紅花注射液進(jìn)行的生物活性效價(jià)測(cè)定，每個(gè)人員重復(fù)測(cè)定3次并進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)。不同的實(shí)驗(yàn)人員測(cè)得的結(jié)果均通過可靠性檢驗(yàn)，效價(jià)的RSD為3.613%，小于10%，F(xiàn)L平均值10.88%，小于20%，說明不同實(shí)驗(yàn)人員對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響不大，中間精密度良好。

2.7.4 方法適用性 在方法適用性的考察中，選取了4個(gè)廠家8個(gè)批次的紅花注射液，測(cè)定結(jié)果見圖5，表5，不同批次的紅花注射液測(cè)得的效價(jià)不同，F(xiàn)L均＜20%，檢定結(jié)果精密度良好?？煽啃钥疾祜@示，不同批次間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明供試品的效價(jià)測(cè)定值基本準(zhǔn)確，且供試品的效價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)品無明顯差異，偏離平行和反向二次曲線統(tǒng)計(jì)所得結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），變異來源中的回歸顯著（P＜0.01），表明標(biāo)準(zhǔn)品和供試品是兩條平行直線。本實(shí)驗(yàn)中，不同劑量間所測(cè)結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)置合理，且供試品效價(jià)測(cè)定方法穩(wěn)定可靠。

圖5 不同廠家不同批次的紅花注射液線性考察結(jié)果Fig 5 Linearity of different batches of Safflower Injection from different manufacturers

表5 不同廠家不同批次紅花注射液效價(jià)結(jié)果Tab 5 Summary of potency of different batches of Safflower injection from different manufacturers

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SAS 9.4（序列號(hào)：647652）軟件處理數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用Dunnett’st檢驗(yàn)和單因素方差分析（One-Way ANOVA）法。采用《中國藥典》生物檢定統(tǒng)計(jì)程序BS2000進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，并計(jì)算各組供試品的效價(jià)和FL。

3 討論

可控的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是我國科技工業(yè)發(fā)展和中醫(yī)藥現(xiàn)代化、國際化的國家戰(zhàn)略，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和現(xiàn)代技術(shù)的應(yīng)用，特別是中醫(yī)藥的創(chuàng)新，中醫(yī)藥的質(zhì)量和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究不斷提高[11-12]。當(dāng)前，基于化學(xué)方法的中藥注射劑質(zhì)量控制已被廣泛采用。中藥注射劑化學(xué)成分的復(fù)雜性給當(dāng)前以色譜和光譜技術(shù)為基礎(chǔ)的化學(xué)方法識(shí)別所有化合物造成了很大的困難[13]。此外，由于化學(xué)方法提供的化學(xué)信息與體內(nèi)整體活性之間的聯(lián)系還未證實(shí)，化學(xué)信息無法完全保證中藥注射劑安全有效[14-15]。因此，用化學(xué)方法控制中藥注射劑的質(zhì)量存在一定的缺陷。近年來，利用生物測(cè)定方法控制復(fù)方中草藥的質(zhì)量受到了廣泛的關(guān)注[16]。盡管生物測(cè)定不能提供化學(xué)信息，但它們具有提供生物制品直接生物活性甚至臨床安全性和有效性信息的優(yōu)勢(shì)[17]。受這些事實(shí)的啟發(fā)，我們認(rèn)為將生物測(cè)定法引入中藥注射劑的質(zhì)量控制體系，有利于提高中藥注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[18-19]。目前，生物評(píng)價(jià)逐漸成為中藥質(zhì)量控制的發(fā)展方向之一，被2020年版《中國藥典》收錄[20]，為控制中藥有效性提供了新的思路。

紅花注射液是臨床上的常用品種，主要功效是活血化瘀。在最新的紅花注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，新增了羥基紅花黃色素A、總黃酮（以山柰酚計(jì)）的含量測(cè)定，并新增成品的指紋圖譜（相似度≥0.85）[21]。但經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，紅花注射液中的山柰酚-3-O-β-蕓香糖苷、綠原酸、咖啡酸、山柰酚-3-O-β-槐糖苷等成分均有不同程度的抗血小板聚集作用，而藥典中規(guī)定檢測(cè)的山柰酚卻表現(xiàn)出較低的抗血小板聚集活性[22]。這說明，目前紅花注射液的質(zhì)量控制方法尚處于單純的化學(xué)控制階段，含量測(cè)定項(xiàng)目仍不足以整體控制其質(zhì)量，難以全面保證有效性，加之進(jìn)入體內(nèi)后代謝產(chǎn)物繁多，發(fā)揮藥效的物質(zhì)形式并不明確，指紋圖譜相似度考察也僅是對(duì)于成分的整體控制，缺乏直接與有效性關(guān)聯(lián)的指標(biāo)。因此，有必要在現(xiàn)有中藥質(zhì)量控制模式的基礎(chǔ)上引入生物活性測(cè)定方法，對(duì)紅花注射液的質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

鑒于紅花注射液對(duì)血小板聚集具有良好的抑制作用，本研究以血小板聚集抑制率來定義效價(jià)，測(cè)定紅花注射液標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)為7594 U·mL－1，對(duì)不同誘導(dǎo)劑的種類（ADP和AA）、血小板的數(shù)量及不同的劑間比進(jìn)行研究，綜合評(píng)判各項(xiàng)結(jié)果，選擇最適宜的條件建立方法并進(jìn)行后期驗(yàn)證。研究顯示所建立的方法量效關(guān)系明顯，線性關(guān)系良好，測(cè)定的效價(jià)可靠，能夠較好地用于紅花注射液質(zhì)量評(píng)價(jià)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同廠家不同批次的紅花注射液雖然同質(zhì)，理化檢驗(yàn)結(jié)果均符合藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，但通過生物活性測(cè)定方法測(cè)得的效價(jià)卻各不相同，說明不同廠家不同批次間的紅花注射液抑制血小板聚集的生物活性存在差異，從而進(jìn)一步說明單純依靠化學(xué)指標(biāo)并不能全面反映藥品的有效性，而應(yīng)該基于臨床藥效控制其有效性。本研究中基于“藥效”建立的生物活性測(cè)定方法能夠衡量不同廠家不同批次樣品間抑制血小板聚集的活性，可以作為紅花注射液質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的補(bǔ)充。后期可以采用更多廠家更多批次的紅花注射液運(yùn)用此方法來進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的適用性。

本方法的建立有望在一定程度上作為現(xiàn)行紅花注射液質(zhì)量控制方法的補(bǔ)充，為生物活性測(cè)定法在中藥質(zhì)量控制方面的發(fā)展提供一定借鑒意義，進(jìn)而可以為中藥注射液標(biāo)準(zhǔn)品的確立和方法學(xué)的發(fā)展開創(chuàng)新的思路，為中藥質(zhì)量控制模式及質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的建立提供新的研究思路，推動(dòng)中藥國際化進(jìn)程。