灰氈毛忍冬bZIP25基因的克隆及其表達(dá)模式分析

王珊，曾娟，謝瑜，周日寶，劉湘丹，童巧珍，龍雨青，陳言，劉小麗*（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，長沙 4000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 40208；3.湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點(diǎn)研究室，長沙 40208；4.湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 40208；.焦作市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河南 焦作 44000）

灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.是中藥材山銀花的主要來源，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效[1]，是治療內(nèi)癰、外癰之要藥。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，灰氈毛忍冬分子水平的相關(guān)研究也越來越多。其中對(duì)灰氈毛忍冬的基因研究多集中在參與其活性成分綠原酸生物合成[2-4]、黃酮類化合物合成[5-6]、植物激素乙烯合成[7-8]以及其花冠特殊表型等方面[9-11]，而關(guān)于其轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究報(bào)道則很少。

bZIP（basic leucine zipper）轉(zhuǎn)錄因子是植物中非常重要且常見的一類生物蛋白，由高度保守的堿性區(qū)和相對(duì)保守的亮氨酸拉鏈區(qū)組成。bZIP 轉(zhuǎn)錄因子通過與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，激活或抑制其轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控基因的表達(dá)，參與植物各種生物學(xué)過程，在植物的生長發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物合成以及抵御逆境脅迫等方面都發(fā)揮著不可替代的作用[12-13]，如 bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可以加速馬鈴薯生殖塊莖的生長和衰老[14]。蘋果MdbZIP44通過增加MdMYB1與下游靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合，促進(jìn)了脫落酸誘導(dǎo)的花青素生物合成[15]。陸地棉GhVIP1過表達(dá)后，提高種子發(fā)芽率和改善根系發(fā)育，使其耐旱性增強(qiáng)[16]。有研究對(duì)金銀花五個(gè)花期的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn) 49 個(gè) bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量存在明顯差異，提示其可能參與金銀花的發(fā)育[17]。

本研究利用課題組前期研究獲得的灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選出在花不同發(fā)育階段具有顯著表達(dá)差異的bZIP25（log2Fold Change：2.12，P＜0.05），對(duì)其進(jìn)行克隆及生信分析，并對(duì)其在不同器官、不同開花階段的表達(dá)量進(jìn)行研究分析，為后續(xù)深入探索灰氈毛忍冬bZIP25在花發(fā)育方面的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材

灰氈毛忍冬花、葉及莖在湖南隆回采摘，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授鑒定為灰氈毛忍冬的花、葉及莖，將采集的花樣品按不同花期分成七個(gè)階段（f1～f7）[5]。將樣品于封口袋中密封，裝入液氮罐中，帶回實(shí)驗(yàn)室于－80℃冰箱保存。

1.2 試藥

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）；RevertAid First Strand cDNA synthesis試劑盒（美國Thermo Fisher公司）；快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TS-GelRed Ver.2 1000 x in Water、Trelief 5α感受態(tài)細(xì)胞（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）；SMARTer RACE 5'/3'試劑盒（日本Takara公司）；pEASY-Blunt Cloning試劑盒、pEASY-T1 Cloning試劑盒、TranStart Green qPCR SuperMix UDG（北京全式金生物科技有限公司）；2×Taq Master Mix（Dye）（康為世紀(jì)科技有限公司）。所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示，濃度為10 μmol·L－1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

2 方法與結(jié)果

2.1 bZIP25基因克隆

2.1.1bZIP25基因核心片段擴(kuò)增 取適量灰氈毛忍冬花蕾，根據(jù)多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒的方法提取灰氈毛忍冬總 RNA，瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀檢測(cè)合格后，參照 RevertAid First Strand cDNA synthesis試劑盒的步驟，用提取得到的RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成灰氈毛忍冬 cDNA。根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，篩選出標(biāo)注為 bZIP 的序列，設(shè)計(jì)引物bZIP25-S 和bZIP25-A（見表1），以上述步驟得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 體系共25 μL，其中cDNA 1 μL，2×Taq Master Mix（Dye）12.5 μL，bZIP25-S 和bZIP25-A 各 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 擴(kuò)增條件為 94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃30 s，72℃，90 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，凝膠回收試劑盒回收目的條帶，與 pEASY-T1 克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞后，涂抹于 LB 固體培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取出白斑進(jìn)行菌落 PCR，得到約 300 bp的目的條帶（見圖 1A），送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，明確核心片段序列長為 286 bp。

2.1.2bZIP25基因RACE擴(kuò)增 根據(jù)上述測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì) RACE 引物bZIP25-5'和bZIP25-3'（見表1）。參照 RACE試劑盒的步驟分別獲得bZIP25的 5'和 3'RACE-Ready cDNA。PCR體系包括5' 或 3' RACEReady cDNA 2.5 μL，Seq Amp DNA Polymerase 1 μL，bZIP25-5'或bZIP25-3'引物 1 μL，10×UPM 5 μL，PCR-Grade H2O補(bǔ)足 50 μL，以及 2×Seq Amp Buffer 25 μL。PCR 擴(kuò)增條件為 94℃ 30 s，72℃ 2 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，40 個(gè)循環(huán)?；厥?、連接、克隆與測(cè)序等步驟同“2.1.1”項(xiàng)下，其中所用載體為 pEASY-Blunt 克隆載體。5'-端和3'-端RACE擴(kuò)增結(jié)果顯示，分別在400 bp 和600 bp 左右有一明亮條帶（見圖 1B 和 1C）。

2.1.3bZIP25基因cDNA全長獲得及驗(yàn)證 應(yīng)用序列拼接軟件對(duì) 5'-端和 3'-端進(jìn)行拼接，獲得灰氈毛忍冬bZIP25基因cDNA序列全長。根據(jù)全長序列設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物Y-bZIP25-F和Y-bZIP25-R（見表1），以“2.1.1”項(xiàng)下所得cDNA為模板進(jìn)行全長驗(yàn)證。PCR體系共包括cDNA 1 μL，Y-bZIP25-F和Y-bZIP25-R各 1 μL，2×Pfu Master Mix（Dye）12.5 μL，以及ddH2O 補(bǔ)足 25 μL。PCR 擴(kuò)增條件為 94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃10 min?；厥?、連接、克隆與測(cè)序等步驟同“2.1.1”項(xiàng)下，其中所用載體為 pEASY-Blunt克隆載體。將5'-端、3'-端及核心片段序列的測(cè)序結(jié)果用 Conting Express 軟件拼接后，得到bZIP25基因cDNA全長序列共 892 bp。驗(yàn)證 cDNA全長，發(fā)現(xiàn)在 900 bp 左右一明顯亮帶（見圖1D），經(jīng)過回收、連接、克隆及測(cè)序，證實(shí)測(cè)序結(jié)果與拼接全長序列一致。

圖1 bZIP25 基因PCR產(chǎn)物Fig 1 PCR product of bZIP25 gene

2.2 bZIP25 基因生物信息學(xué)分析

對(duì)灰氈毛忍冬bZIP25進(jìn)行生物信息學(xué)分析所用的在線軟件及具體網(wǎng)址見表2。

表2 生物信息學(xué)分析方法Tab 2 Bioinformatics analysis method

2.2.1 LmbZIP25 蛋白理化性質(zhì)分析 灰氈毛忍冬bZIP25基因全長為892 bp，包含的ORF 區(qū)長度為576 bp，編碼191個(gè)氨基酸，命名為LmbZIP25，其GenBank 登錄號(hào)為：OR551766。

LmbZIP25蛋白分子式為C966H1525N305O295S7，相對(duì)分子質(zhì)量為 22.35 kDa，理論等電點(diǎn)為 9.99。LmbZIP25蛋白的 191個(gè)氨基酸殘基中，精氨酸（Arg）和絲氨酸（Ser）含量最高，為11.5%；絡(luò)氨酸（Tyr）含量最低，僅 0.5%。LmbZIP25 蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為 72.09，大于閾值 40，屬于不穩(wěn)定蛋白。LmbZIP25 蛋白的脂溶系數(shù)為 63.25，總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為 －1.007，為親水性蛋白。通過 ProtScale 軟件分析，該蛋白親水/疏水氨基酸分布負(fù)值明顯大于正值，提示親水區(qū)占比遠(yuǎn)大于疏水區(qū)，與ProtParam 預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

經(jīng) WOLF PSORT 在線分析，該蛋白定位于細(xì)胞核中。利用 TMHMM 2.0 在線分析，其編碼的氨基酸均在膜外，不具跨膜區(qū)域。通過 Signal P 4.1 Server 軟件可知該蛋白無信號(hào)肽序列，為非分泌蛋白。NetPhos 3.1 在線軟件分析提示，LmbZIP25中共有 28 個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，其中有 22 個(gè) Ser磷酸化位點(diǎn)、5 個(gè) Thr 磷酸化位點(diǎn)及 1 個(gè) Tyr 磷酸化位點(diǎn)。

2.2.2 bZIP25 蛋白結(jié)構(gòu)分析 通過 CD-Search 在線分析，發(fā)現(xiàn)灰氈毛忍冬 bZIP25 蛋白在第 81～132 位氨基酸殘基上含有 bZIP_plant_GBF1 保守結(jié)構(gòu)域（見圖2），提示其屬于 bZIP 家族，與家族中其他成員具有相同或相似的功能。

圖2 LmbZIP25 蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig 2 Domain prediction of LmbZIP25 proteins

SOPMA在線預(yù)測(cè)LmbZIP25 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。α螺旋為其主要結(jié)構(gòu)組成元件，占46.07%；其次為無規(guī)則卷曲，占41.88%。通過SWISS-MODEL對(duì)LmbZIP25 蛋白進(jìn)行同源建模，發(fā)現(xiàn)其與阿拉伯咖啡的bZIP蛋白在三級(jí)結(jié)構(gòu)水平的相似度為53%，三級(jí)結(jié)構(gòu)的覆蓋率達(dá) 99%，且以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符，結(jié)果見圖 3。

圖3 LmbZIP25 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig 3 Prediction of tertiary structure of LmbZIP25 proteins

2.2.3 氨基酸序列同源性比對(duì)、進(jìn)化分析和基序分析 將LmbZIP25 編碼的氨基酸序列與 NCBI-Blast中的植物蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與可可Theobromacacao、哥倫比亞錦葵Herraniaumbratica、小蓬草Erigeroncanadensis、萵苣Lactucasativa、狹葉油茶Camellialanceoleosa和甜橙Citrussinensis等的同源性較高，下載上述植物的氨基酸序列，使用 DNAMAN 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果見圖4。這些植物中均包含有符合 bZIP 轉(zhuǎn)錄因子的“N-X7-R-X9-L-X6-L-X6-L”特征結(jié)構(gòu)，且堿性區(qū)的同源性非常高，亮氨酸拉鏈區(qū)相對(duì)稍低。

圖4 LmbZIP25 與其他植物bZIP 蛋白的多序列比對(duì)Fig 4 Multiple sequence alignment of LmbZIP25 with bZIP proteins of other plants

將在 NCBI-Blast 上下載的部分植物bZIP基因家族氨基酸序列，利用 MEGA 11.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖 5A 可知，進(jìn)化樹分為三支，灰氈毛忍冬LmbZIP25與芝麻SibZIP4、木犀欖OebZIP4、旋蒴苣苔DhbZIP5、小蓬草EcbZIP4、刺苞菜薊CcbZIP4、萵苣LsbZIP4和除蟲菊TcbZIP4聚為一支，說明與這些植物的親緣關(guān)系較近。茄科的3種植物，漸狹葉煙草NabZIP11、馬鈴薯StbZIP63和辣椒CabZIP11聚為一支，其余植物為另一支。

對(duì)參與分析植物的蛋白序列進(jìn)行保守基序分析（見圖 5B），結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有序列均具有 Motif 1、Motif 3、Motif 4 及 Motif 6 等4個(gè)保守基序，而不同進(jìn)化分支 bZIP 的基序組成有較明顯的種屬特性，如第一大類均不含 Motif 8，第二大類的3個(gè)茄科植物NabZIP11、CabZIP11和StbZIP63均無 Motif 7，但具有 Motif 9。另外，同一種屬的植物保守基序也呈現(xiàn)出個(gè)體差異，如第三大類中的菊科植物EcbZIP4無Motif 8，同為菊科的CcbZIP4則無 Motif 5 和 Motif 7。

圖5 LmbZIP25 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹（A）和基序（B）Fig 5 Phylogenetic tree（A）and motif（B）of LmbZIP25 proteins

2.3 bZIP25 基因的表達(dá)分析

基于bZIP25基因的全長序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物Q-bZIP25-F和Q-bZIP25-R（見表2）。提取灰氈毛忍冬七個(gè)花期的花及莖、葉的總 RNA，定量后逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。將18SrRNA基因作為內(nèi)參，設(shè)計(jì)引物18S-F、18S-R（見表 2）進(jìn)行 qRT-PCR。反應(yīng)體系包括 2×TransStart Green qPCR SuperMix UDG 10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足 20 μL。擴(kuò)增條件為 50℃ 2 min，94℃ 10 min；94℃ 5 s，55℃ 15 s，72℃ 10s，40 個(gè)循環(huán)。重復(fù) 3次，進(jìn)行熔解曲線分析，運(yùn)用2－ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見圖6。不同花期中，LmbZIP25在黃色花蕾期的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他花期；不同器官中，以花期黃色花蕾期為參照，LmbZIP25相對(duì)表達(dá)量在莖中最高，其次為花期黃色花蕾期，而在葉中最低。其中，在莖中的相對(duì)表達(dá)量為葉的20.67倍，為黃色花蕾期的2.07倍。

圖6 LmbZIP25 基因相對(duì)表達(dá)量Fig 6 Relative expression level of LmbZIP25 gene

3 討論

bZIP 家族作為最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，具有多種生物學(xué)功能，廣泛地參與到植物的生命活動(dòng)中。本研究為探索其在灰氈毛忍冬花器官發(fā)育中的功能克隆了bZIP25基因序列全長，開放閱讀框（ORF）為 576 bp，編碼 191個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其為不穩(wěn)定親水蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，為非分泌蛋白。研究顯示，bZIP 主要定位于細(xì)胞核中[18]，LmbZIP25 蛋白分析結(jié)果與之相符。結(jié)構(gòu)域分析其含有 bZIP_plant_GBF1 保守結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其屬于 GBF1 類 bZIP 轉(zhuǎn)錄因子，與蓖麻[19]、橡膠草[20]和野菊[21]等 bZIP 編碼的結(jié)構(gòu)域一致。同源性比對(duì)結(jié)果表明，同源性較高的區(qū)域主要位于保守結(jié)構(gòu)域上。與灰氈毛忍冬LmbZIP25進(jìn)化關(guān)系較近的芝麻、木犀欖、旋蒴苣苔、萵苣和除蟲菊等的 bZIP 蛋白在基序組成上高度保守，均含有Motif 1～Motif 8。

灰氈毛忍冬的入藥部位為花蕾或帶初開的花，為研究bZIP25在灰氈毛忍冬開花進(jìn)程中的表達(dá)量差異，課題組將整個(gè)花期細(xì)分為七個(gè)階段。qRTPCR 結(jié)果顯示，LmbZIP25在灰氈毛忍冬七個(gè)花期、莖和葉中均有表達(dá)，表達(dá)量為莖＞黃色花蕾期＞葉，但表達(dá)量存在時(shí)空差異與組織特異性。bZIP 家族在不同的物種中具有不同的組織表達(dá)模式。如金銀花LjbZIP1表達(dá)量在葉中高于成熟花中[22]。牡丹PobZIP1在莖和葉中的表達(dá)量基本持平，在花芽中表達(dá)量最少[23]。紅花CtbZIP47在莖中的表達(dá)量高于花中，在葉中則最低[24]。

LmbZIP25在灰氈毛忍冬不同花期的表達(dá)水平整體呈先升后降的趨勢(shì)，其中黃色花蕾期的LmbZIP25表達(dá)量顯著高于其他花期。黃色花蕾期是灰氈毛忍冬開花前的最后階段，此時(shí)的LmbZIP25表達(dá)量突增，提示其很可能促進(jìn)灰氈毛忍冬花的開放。在其他植物中，也發(fā)現(xiàn)不少此類現(xiàn)象。如大豆GmbZIP33在擬南芥中過表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因擬南芥出現(xiàn)早花，并使FT等開花基因的表達(dá)量升高[25]。bZIP 轉(zhuǎn)錄因子GmFDL19能與開花基因GmFT2a和GmFT5a相互作用，GmFDL19在大豆中過表達(dá)時(shí)，能上調(diào)開花基因的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致大豆出現(xiàn)早花[26]。水稻OsbZIP62不僅能夠調(diào)控水稻的成花轉(zhuǎn)變，還參與調(diào)控分枝、幼穗、花分生組織以及花器官的發(fā)育[27]。后續(xù)可通過獲得LmbZIP25基因的過表達(dá)植株或功能缺失突變株，為深入研究其對(duì)灰氈毛忍冬開花的調(diào)控機(jī)制及驗(yàn)證其生物學(xué)功能提供參考。