復(fù)合酶改性玉米皮可溶性膳食纖維的工藝優(yōu)化及理化特性分析

魏旭瑤，姜彩霞,2，曾祥瑞，王 萌，鄭喜群,2,3, ，劉曉蘭

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；3.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；4.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

膳食纖維（Dietary Fibre，DF）是一種植物衍生的寡糖或多糖，不能被人類消化系統(tǒng)完全消化。主要由纖維素、木質(zhì)素、半纖維素、果膠、低聚糖組成[1]。含有多種抗人類消化酶消化的化學(xué)結(jié)構(gòu)[2]。膳食纖維也被認(rèn)為是植物的重要組成部分[3]，根據(jù)溶解度可以分為可溶性膳食纖維（Soluble Dietary Fibre，SDF）和不可溶性膳食纖維（Insoluble Dietary Fiber，IDF），對人體健康和維持身體功能平衡至關(guān)重要[4]。SDF 可降低血液中的膽固醇含量和葡萄糖水平，有助于預(yù)防或改善心血管疾病和糖尿病等慢性疾病[5]。SDF 也可用于食品加工，改善食品的質(zhì)地結(jié)構(gòu)和口感，滿足人體對膳食營養(yǎng)素的需求[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)玉米皮膳食纖維是谷物中最重要的膳食纖維來源之一，可以吸收亞硝酸鹽，顯著降低患癌癥的風(fēng)險[8]。

玉米是世界上三大糧食作物之一。在糧食作物中玉米的世界總產(chǎn)量最高[9]。根據(jù)中國玉米產(chǎn)量數(shù)據(jù)，玉米皮年產(chǎn)量為3000 萬噸。而人們往往忽略其潛在的價值，部分僅應(yīng)用在飼料生產(chǎn)中。玉米皮富含優(yōu)質(zhì)的碳水化合物，如半纖維素、纖維素和淀粉[10]。酶解法已被證明通過改變麩皮結(jié)構(gòu)或重新分配內(nèi)部組成來改善膳食纖維的功能特性[11]。張向輝等[12]采用高溫蒸煮復(fù)合酶法提取綠豆皮中的SDF，其理化性質(zhì)及體外降血糖能力均優(yōu)于高溫蒸煮法提取的綠豆皮SDF。楊開等[13]采用復(fù)合酶法提取雷筍中的SDF，將雷筍中的IDF 部分水解變?yōu)檩^小分子量的SDF，使原本有序的纖維素晶型被打亂，得率可達(dá)到5.78%，且理化特性均有較大改善。Ma 等[14]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶法改性能顯著提高膳食纖維得率。且與未改性的原料相比，復(fù)合酶法改性后的膳食纖維具有更高的可溶性單糖含量、更強的熱穩(wěn)定性和更高的多孔率。纖維素酶和木聚糖酶可以水解DF 原料中的纖維素和半纖維素成分，使纖維素多糖分子量降低，聚合度下降，大幅度提升了SDF 含量。目前關(guān)于復(fù)合酶法改性提取玉米皮中可溶性膳食纖維的報道較少，因此探尋優(yōu)質(zhì)的提取工藝將玉米皮中IDF 轉(zhuǎn)化為SDF 有著重要的意義。

本文采用復(fù)合酶法改性玉米皮可溶性膳食纖維，通過單因素實驗、響應(yīng)面優(yōu)化玉米皮可溶性膳食纖維制備的工藝參數(shù)。并對提取產(chǎn)物進(jìn)行了相關(guān)的體外試驗，進(jìn)一步明確改性前后玉米皮可溶性膳食纖維功能特性的差異，研究結(jié)果可能為開發(fā)玉米皮高附加值功能產(chǎn)品以及對玉米加工副產(chǎn)物的精深利用提供有利參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米皮 京糧龍江生物工程有限公司；淀粉酶（2×105U/g）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；堿性蛋白酶（2×105U/g）南寧龐博生物有限公司；淀粉糖苷酶（1.5×105U/g）、纖維素酶（1.1×104U/mL）、木聚糖酶（2.8×105U/g）滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

TGL-16M 離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV-2501PC 紫外-可見分光光度計 日本島津公司；DF-101 智能磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)合酶改性玉米皮SDF 的制備 根據(jù)Li 等[15]的方法略有修改。玉米皮粉碎后，過60 目篩得玉米皮粗粉，進(jìn)行石油醚脫脂，經(jīng)低溫干燥后按料液比1:10（g/mL）加入去離子水，混合液調(diào)至溫度60 ℃、pH5.0 后加入纖維素酶（40 U/mg）、木聚糖酶（13 U/mg）進(jìn)行酶解，酶解后100 ℃沸水浴滅酶15 min。按照AOAC 方法，經(jīng)α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉糖苷酶順序酶解，以去除膳食纖維中的淀粉和蛋白質(zhì)等組分。具體參數(shù)為：當(dāng)復(fù)合酶改性玉米皮混合液溫度降至60 ℃，pH 調(diào)至6.5，加入1%淀粉酶，酶解1 h，沸水浴滅酶；當(dāng)溫度降至55 ℃時調(diào)整pH至9.0，加入2%蛋白酶，酶解3 h，沸水浴滅酶；當(dāng)溫度降至50 ℃時調(diào)整pH 至4.2，加入1%淀粉糖苷酶，酶解2 h，沸水浴滅酶。待料液冷卻至室溫，4000 r/min 離心15 min，收集上清液，經(jīng)真空減壓濃縮至總體積的1/3，加入4 倍體積95%的乙醇溶液，4 ℃醇沉10 h，沉淀物離心后干燥，即為復(fù)合酶改性玉米皮SDF，簡稱C-SDF。

1.2.2 單因素實驗 利用復(fù)合酶法改性玉米皮SDF，考察纖維素酶添加量、木聚糖酶添加量、酶解溫度和酶解時間對玉米皮SDF 得率的影響。4 個因子試驗范圍如下：以玉米皮可溶性膳食纖維得率為衡量指標(biāo)，分別在木聚糖酶添加量1.2%、酶解時間120 min、酶解溫度60 ℃的條件下考察纖維素酶（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）對玉米皮SDF 的影響；在纖維素酶添加量1.5%、酶解時間120 min、酶解溫度60 ℃的條件下考察木聚糖酶（0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.6%）對玉米皮SDF 得率的影響；在纖維素酶添加量1.5%、木聚糖酶添加量1.2%、酶解溫度60 ℃的條件下考察酶解時間（60、90、120、150、180 min）對玉米皮SDF 得率的影響；在纖維素酶添加量1.5%、木聚糖酶添加量1.2%、酶解時間120 min 的條件下考察酶解溫度（40、50、60、70、80 ℃）對玉米皮SDF 得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上，運用Design expert-13 軟件，根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，以纖維素酶添加量（A）、木聚糖酶添加量（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）為自變量，以C-SDF 得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定制備的最優(yōu)條件，因素與水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box Behnken test

1.2.4 C-SDF 理化特性的測定

1.2.4.1 溶解性（Water solubility，WS）根據(jù)Li 等[16]的方法略有修改。精確稱量0.3 g 樣品于50 mL 離心管中，加入30 mL 蒸餾水，75 ℃水浴1 h，4000 r/min離心15 min，除去上清液并將沉淀烘干至恒重，按下式計算：

式中：M0樣品干重（g）；M1上清液干燥后的固形物質(zhì)量（g）。

1.2.4.2 持水力（Water holding capacity，WHC）根據(jù)Yin 等[17]的方法確定，但略有修改。精確稱量0.3 g 樣品于50 mL 離心管中，加入30 mL 蒸餾水，25 ℃混勻振蕩2 h，靜置12 h，4000 r/min 離心15 min，除去上清液后用濾紙將殘留在離心管內(nèi)的剩余水分吸干并稱量沉淀質(zhì)量。

式中：M2為樣品濕重（g）；M0為樣品干重（g）。

1.2.4.3 持油力（Oil holding capacity，OHC）根據(jù)Ji 等[18]的方法確定，但略有修改。精確稱量0.3 g 樣品于50 mL 離心管中，加入30 mL 大豆油，25 ℃振蕩2 h，靜置12 h，4000 r/min 離心15 min，除去上清液后用濾紙將殘留在離心管內(nèi)的剩余大豆油吸干并稱量沉淀質(zhì)量。

式中：M3為樣品濕重（g）；M0為樣品干重（g）。

1.2.4.4 葡萄糖吸附能力（Glucose adsorption capacity，GAC）的測定 根據(jù)Zheng 等[19]的方法確定，但略有修改。準(zhǔn)確稱量0.3 g 樣品加入200 mmol/L的葡萄糖溶液中。在37 ℃下180 r/min 水浴振蕩6 h，4000 r/min 離心15 min，取上清液用3,5-二硝基水楊酸法（DNS 法）測定其葡萄糖含量。GAC 的計算方法如下：

式中：C0為吸附前溶液中葡萄糖濃度（mmol/L）；C1為吸附后溶液中上清液葡萄糖濃度（mmol/L）；V0為離心后上清液體積（mL）；Mm為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.4.5 膽固醇吸附能力（Cholesterol adsorption capacity，CAC）的測定 根據(jù)Benitez 等[20]的方法確定，但略有修改。新鮮的雞蛋黃中加入9 倍體積的蒸餾水充分?jǐn)嚢杌旌希瑴?zhǔn)確稱量0.3 g 待測樣品加入到30 mL 蛋黃稀釋液中，分別用NaOH 和HCl 將體系調(diào)節(jié)到pH 至7.0±0.1（模擬腸道環(huán)境）和pH 至2.0±0.1（模擬胃環(huán)境）。將混合液37 ℃水浴振蕩4 h，4000 r/min 離心15 min，取上清液采用鄰苯二甲醛的方法測定上清液中膽固醇含量。

式中：M1為吸附前膽固醇含量（mg）；M2為吸附后膽固醇含量（mg）；M0為樣品干重（g）。

1.2.4.6 膽酸鈉吸附能力（Sodium cholate adsorption capacity，SCAC）的測定 根據(jù)Cheng 等[21]的方法確定，但略有修改。取0.3 g 樣品與30 mL 0.75 mg/mL膽酸鈉溶液充分混合。分別用NaOH 和HCl 將體系調(diào)節(jié)到pH 至7.0±0.1（模擬腸道環(huán)境）和pH 至2.0±0.1（模擬胃環(huán)境）。37 ℃下水浴3 h，4000 r/min離心15 min，采用糠醛比色法測定上清液中膽酸鈉含量。

式中：Ma為吸附前膽酸鈉含量（mg）；Mb為吸附后膽酸鈉含量（mg）；M0為樣品干重（g）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗均進(jìn)行了三次平行，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性分析采用SPSS 26 統(tǒng)計軟件，經(jīng)單因素方差分析，比較方法采用Tukey 分析，P＜0.05表示差異性顯著；采用Origin 2022 進(jìn)行圖形繪制；響應(yīng)面優(yōu)化試驗借助Design Expert 13 進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 纖維素酶添加量對C-SDF 得率的影響 纖維素酶添加量對玉米皮SDF 得率的影響由圖1 所示，由圖1 可知，隨著纖維素酶添加量的增加C-SDF 得率呈現(xiàn)的趨勢為先增加后減少，且在纖維素酶添加量為1.5%時C-SDF 得率達(dá)到最大值。當(dāng)?shù)孜镆欢〞r，隨著酶添加量的增加，酶解速率也隨之相應(yīng)增加，但是當(dāng)酶添加量大于1.5%時，C-SDF 的得率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，可能是因為酶添加量過多，將CSDF 水解生成分子質(zhì)量更低且易溶于乙醇的糖類物質(zhì)，使得C-SDF 的得率降低[22-23]。因此，纖維素酶的最佳添加量以1.5%進(jìn)行響應(yīng)面試驗分析較適宜。

圖1 纖維素酶添加量對玉米皮SDF 得率的影響Fig.1 Effect of cellulase supplemental level on the extraction rate of SDF from corn bran

2.1.2 木聚糖酶添加量對C-SDF 得率的影響 木聚糖酶添加量對玉米皮SDF 得率的影響由圖2 可知，C-SDF 的得率在木聚糖酶添加量為1%時達(dá)到最高，隨后呈現(xiàn)酶解速率下降的趨勢。底物中非淀粉多糖被木聚糖酶充分酶解后形成了聚合度較小的糖組分，使C-SDF 含量增加[24]。當(dāng)木聚糖酶添加量超過1%時，木聚糖酶則水解SDF 中低聚木糖等組分，使C-SDF 得率降低。故選木聚糖酶1%添加量時提取C-SDF 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗為宜。

圖2 木聚糖酶添加量對玉米皮SDF 得率的影響Fig.2 Effect of xylanase addition on SDF extraction rate of corn bran

2.1.3 酶解時間對C-SDF 得率的影響 酶解時間對玉米皮SDF 得率的影響由圖3 所示，隨著酶解時間的不斷上升，酶的作用時間對C-SDF 得率的影響呈現(xiàn)150 min 之前穩(wěn)步增加隨之減小的變化趨勢，在酶解時間為150 min 時，C-SDF 的得率達(dá)到最高值。隨著時間的延長，底物與酶結(jié)合的作用位點越來越多，隨之呈現(xiàn)飽和狀態(tài)，再繼續(xù)延長酶解時間，底物會被過度消耗，酶分子的有效含量也將有所降低，酶的速率也隨之降低。時間過長時C-SDF 也會被進(jìn)一步降解，導(dǎo)致C-SDF 得率變小[25]。因此最適酶解時間為150 min 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖3 酶解時間對玉米皮SDF 得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction rate of corn bran SDF

2.1.4 酶解溫度對C-SDF 得率的影響 酶解溫度對玉米皮SDF 得率的影響如圖4 可知，隨著酶解溫度的上升，酶解溫度對C-SDF 得率的影響呈先增加后降低的變化趨勢，且在60 ℃時C-SDF 得率到達(dá)最高值。高溫環(huán)境下，酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致無論其活性、穩(wěn)定性都有所下降，而低溫條件不能提高相對反應(yīng)體系的活化能，與底物酶解不充分也會導(dǎo)致酶解效果的降低[26]。因此，故選酶解溫度控制在50 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗為宜。

圖4 酶解溫度對玉米皮SDF 得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction rate of corn bran SDF

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果見表2。結(jié)果表明CSDF 得率及自變量纖維素酶添加量（A）、木聚糖酶添加量（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）的回歸方程為：Y=16.58+1.78A+1.64B+1.63C+1.27D+0.15AB+0.28AC-0.6025AD+0.5075BC-0.1525BD+0.0625CD-2.26A2-2.96B2-2.48C2-2.65D2。

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

由表3 所示，此回歸方程模型P＜0.0001 呈極顯著趨勢；模型失擬項P＞0.05 呈不顯著趨勢，表明所建立模型的回歸方程有較好的擬合性，可以作為預(yù)測C-SDF 優(yōu)化提取工藝參數(shù)的模型。此模型的相關(guān)回歸系數(shù)R2=0.9905，絕對校正系數(shù)R2Adj=0.9809，以上數(shù)據(jù)表明該模型的可靠性高。其中A、B、C、D、A2、B2、C2、D2的P值均＜0.001，說明相關(guān)數(shù)值對CSDF 得率影響呈極顯著。AD 的P＜0.01 對C-SDF得率為高度顯著影響。BC 的P＜0.05 呈現(xiàn)顯著趨勢。各因素對C-SDF 得率影響的順序依次為：A（纖維素酶添加量）＞B（木聚糖酶添加量）＞C（酶解時間）＞D（酶解溫度）。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由圖5 所示，兩因素交互響應(yīng)面3D 圖的趨勢越陡，說明因素之間的交互作用越明顯；響應(yīng)面趨勢越平緩，影響程度越不明顯。根據(jù)3D 響應(yīng)圖中各因素交互的趨勢也可以推斷響應(yīng)值作用的大小。結(jié)果表明，AD、BC 的交互作用對響應(yīng)值的影響顯著，這與方差分析的結(jié)果相同。

圖5 各因素交互作用對玉米皮SDF 得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph of the interaction of various factors on the extraction rate of corn bran SDF

2.3 工藝優(yōu)化可靠性驗證結(jié)果

通過Design-Expert 軟件優(yōu)化分析，得到C-SDF最優(yōu)改性工藝條件參數(shù)：纖維素酶添加量1.76%、木聚糖酶添加量1.08%、酶解溫度56.08 ℃、酶解時間152 min。

結(jié)合實際工藝設(shè)置的可行性，對優(yōu)化的C-SDF提取條件進(jìn)行修正：纖維素酶添加量1.5%、木聚糖酶添加量1%、酶解溫度55 ℃、酶解時間150 min；以此工藝參數(shù)進(jìn)行三次驗證試驗得到C-SDF 得率平均值為16.64%±0.21%。結(jié)果與模型預(yù)測的理論值相差較小，從而得出該模型優(yōu)化后的玉米皮可溶性膳食纖維的工藝參數(shù)可靠性較高。

2.4 理化性質(zhì)結(jié)果與分析

通過復(fù)合酶法改性的C-SDF 理化特性如表4所示。通過復(fù)合酶改性后的C-SDF 與對照組U-SDF相比WHC 和OHC 都顯著增強（P＜0.05）。結(jié)果表明復(fù)合酶改性后能夠有效改善C-SDF 的理化特性，這可能是由于復(fù)合酶法改性導(dǎo)致C-SDF 的微觀結(jié)構(gòu)變得更加松散，且暴露出的親水基團(tuán)增多，導(dǎo)致了持水力的增強。OHC 在食品加工過程中是決定保留脂肪和脂溶性風(fēng)味的重要指標(biāo)[27]。C-SDF 對葡萄糖溶液也有著良好的吸附性，可能是因為玉米皮進(jìn)行改性后含有較高的有機(jī)木質(zhì)素，可以吸附部分有機(jī)化合物[28]。pH 對膽固醇的吸附有一定的影響。C-SDF在pH7.0 條件下的吸附能力明顯優(yōu)于pH2.0 條件下的吸附力，可以推斷，C-SDF 在小腸中作用位點的膽固醇吸收能力更強。而在酸性反應(yīng)的環(huán)境條件下存在大量氫離子，使得C-SDF 與膽固醇均攜帶了部分正電荷，兩者之間相互排斥的作用力使其結(jié)合力減弱，最終導(dǎo)致C-SDF 對膽固醇的吸附能力有所下降。另外，C-SDF 對膽酸鈉的結(jié)合能力在pH7.0 條件下優(yōu)于pH2.0 條件下，這可能是因為改性后CSDF 結(jié)構(gòu)更加疏松多孔，比表面積增大，從而增加了C-SDF 與膽酸鈉的結(jié)合位點，增強了膽酸鈉吸附性能[29]。也可能因為C-SDF 在pH7.0 條件下溶液中呈現(xiàn)出一種凝膠狀結(jié)構(gòu)，能夠吸附和結(jié)合膽汁酸，使其膽汁酸及其鹽可在小腸中更好的結(jié)合，部分膽汁酸及其鹽類在小腸內(nèi)與膳食纖維相結(jié)合后隨糞便排出體外，這樣就需要有額外的膽固醇被轉(zhuǎn)化成膽酸以補償被排出的部分。因此加速了體內(nèi)膽固醇的分解，從而達(dá)到降低血脂的作用[30]。

表4 C-SDF 的的理化特性Table 4 Physical and chemical properties of C-SDF

3 結(jié)論

本研究以玉米加工副產(chǎn)物玉米皮為原料，以纖維素酶和木聚糖酶為復(fù)合酶改性膳食纖維，通過設(shè)計單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化工藝，確定最佳改性提取工藝為：纖維素酶添加量1.5%、木聚糖酶添加量1%、酶解溫度55 ℃、酶解時間150 min，改性后的玉米皮可溶性膳食纖維得率為16.64%±0.21%，且具有良好的溶解性、持水力、持油力、葡萄糖吸附力、膽固醇吸附性和膽酸鈉吸附性。本研究對提高玉米皮綜合利用，實現(xiàn)糧食加工副產(chǎn)物的提質(zhì)增效具有重要的意義。