羊肚菌硒化多糖結(jié)構(gòu)表征及抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用

趙偉科，楊逍然，王美華

（1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)（北京）體育教研部，北京 100083；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029）

運(yùn)動(dòng)性疲勞是機(jī)體在長(zhǎng)時(shí)間或高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后會(huì)出現(xiàn)的一種乏力狀態(tài)，屬于正常的生理現(xiàn)象，輕微的運(yùn)動(dòng)性疲勞會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)動(dòng)作不協(xié)調(diào)、肌肉僵硬、酸痛等癥狀，經(jīng)適當(dāng)休息后可逐漸得到恢復(fù)。然而經(jīng)常處于運(yùn)動(dòng)性疲勞狀態(tài)下，會(huì)導(dǎo)致身體出現(xiàn)亞健康，進(jìn)一步引發(fā)機(jī)體身心疲勞，甚至對(duì)臟器造成一定損傷[1-2]。研究表明，糖原消耗、乳酸和尿素氮堆積、氧化應(yīng)激水平升高、內(nèi)環(huán)境紊亂等均易導(dǎo)致機(jī)體疲勞[3-4]。目前，大量研究顯示通過補(bǔ)充外源營(yíng)養(yǎng)劑可以有效緩解運(yùn)動(dòng)疲勞，例如LIU 等[5]研究表明，補(bǔ)充黑豆皮多糖不僅提高小鼠糖原儲(chǔ)備，還提高了抗氧化酶活性，同時(shí)降低了乳酸等代謝產(chǎn)物的堆積，從而發(fā)揮了較好的抗疲勞作用；張銳等[6]研究表明，補(bǔ)充松杉靈芝多糖后小鼠體內(nèi)糖原含量和血清抗氧化水平均得到了顯著提高，小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力顯著高于空白對(duì)照組；李英基等[7]研究表明，補(bǔ)充川赤芝多糖后明顯提高了小鼠心肌組織的抗氧化能力，改善了運(yùn)動(dòng)疲勞誘導(dǎo)的心肌損傷。這些研究表明補(bǔ)充外源營(yíng)養(yǎng)物可有效緩解機(jī)體的運(yùn)動(dòng)疲勞。

羊肚菌（Morchella esculenta）是近幾年研究較多的一種珍稀食藥用真菌，多糖是羊肚菌子實(shí)體中最重要的活性物質(zhì)之一[8]。大量藥理研究表明，羊肚菌多糖（Morchellaspp polysaccharides，Msp）具有免疫調(diào)節(jié)[9]、保肝護(hù)肝[10]、預(yù)防老年癡呆[11]、抗血栓[12]、降血脂[13]等功效。多糖的諸多藥理活性與其分子結(jié)構(gòu)密不可分，一些研究表明，采取一定手段對(duì)多糖分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾可以明顯提高多糖的藥理活性。目前，對(duì)多糖的修飾作用有硒酸化、磷酸化、硫酸化、甲基化等[14]，這些修飾作用不僅會(huì)改變多糖的空間結(jié)構(gòu)，還會(huì)改進(jìn)多糖的生物學(xué)特性，使得修飾后的多糖具有更高的生物活性[15]。近年來，多糖的硒酸化修飾研究相對(duì)較多，主要因?yàn)槲峄揎椀玫降奈嗵遣粌H具有多糖的特性還具有硒的生物活性，研究表明硒多糖的抗氧化、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等作用比單獨(dú)的多糖和硒元素更強(qiáng)[16-17]?？梢姡ㄟ^硒酸化改性是提高多糖生物活性的一種重要結(jié)構(gòu)修飾方法。

目前對(duì)羊肚菌多糖的硒酸化修飾研究較少，對(duì)修飾后多糖的結(jié)構(gòu)和抗疲勞作用研究還鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究為改善羊肚菌多糖的生物活性，擬通過硝酸-亞硒酸鈉（HNO3-Na2SeO3）法對(duì)羊肚菌多糖進(jìn)行硒酸化修飾，同時(shí)對(duì)硒多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，并建立大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞模型探討硒多糖的抗疲勞作用。本研究獲得的硒多糖不僅為羊肚菌資源的深入開發(fā)提供理論參考，還可作為富硒補(bǔ)充劑和抗疲勞功能食品的潛在來源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌子實(shí)體（品種：川羊肚菌1 號(hào)）來源于四川省食用菌研究所；亞硒酸鈉（Na2SeO3）西隴科學(xué)股份有限公司；氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚 分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、硝酸、無水乙醇、無水硫酸鈉、氯化鋇、氫氧化鈉、抗壞血酸、冰乙酸等 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸、PMP 衍生劑、甲醇、乙腈 均為色譜級(jí)，北京京科瑞達(dá)科技有限公司；血乳酸（blood lactic acid，BLA）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肝糖原（hepatic glycogen，HG）、肌糖原（muscle glycogen，MG）、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；線粒體分離試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；SPF 級(jí)屏障大鼠 雄性大鼠，5 周齡，65 只，質(zhì)量（120±25）g，大鼠維持飼料，營(yíng)養(yǎng)成分符合GB 14924.3-2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分》 斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，倫理試驗(yàn)批準(zhǔn)文號(hào)：202 204006；DEAE纖維素層析柱 上海聯(lián)邁生物工程有限公司；單糖分析標(biāo)準(zhǔn)品、葡聚糖凝膠G-100 上海源葉生物科技有限公司；葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀、傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司；H1850 離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Beta 2-8 LSCplus 真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST 公司；SN-RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海尚儀科技有限公司；HH-501 水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；LC-10A 高效液相色譜儀 日本島津公司；FFA2204E 電子分析天平 常州幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；PF4250 分離純化系統(tǒng) 法國(guó)Interchim 公司；Zetasizer Nano ZS90 zeta 電位分析儀 英國(guó)Malvern 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊肚菌多糖提取 將羊肚菌子實(shí)體45 ℃烘干至恒重，粉碎至顆粒直徑小于5 mm，稱取1000 g羊肚菌粉末，按照料液比1:30 g/mL，加入30 L 去離子水，在功率200 W 下超聲波處理15 min，然后在90 ℃水浴鍋中浸提2 h，并重復(fù)1 次，將全部濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約100 mL，向濃縮液中加入Sevag 試劑，漩渦振蕩后靜置10 min，5000 r/min 離心10 min，取上層液體，重復(fù)多次至無蛋白產(chǎn)生為止。加入無水乙醇靜置過夜，5000 r/min 離心10 min 收集沉淀，沉淀依次經(jīng)無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，去離子水溶解沉淀后，7000 Da 濾膜透析24 h，真空冷凍干燥得到羊肚菌粗多糖粉末，備用。

1.2.2 羊肚菌多糖分級(jí)純化 稱取粗多糖20 g，配制成100 mg/mL 水溶液，上樣到纖維素層析柱，用去離子水和0.1、0.3、0.5 mol/L 的氯化鈉溶液洗脫，控制流速0.8 mL/min，自動(dòng)收集洗脫液，各管收集5 mL，采用苯酚-硫酸法在490 nm 處跟蹤檢測(cè)各管吸光值[18]，根據(jù)吸光值繪制洗脫曲線。選取收集最多的多糖組分，上樣到葡聚糖凝膠G-100 中進(jìn)一步純化，合并洗脫液后透析并真空冷凍干燥得到純化羊肚菌多糖（Msp-1）。根據(jù)下式分別計(jì)算粗多糖得率和純化后多糖的純度。

式中，m0為稱取的羊肚菌粉末質(zhì)量（g）；m1為提取的粗多糖質(zhì)量（g）；m2為純化后多糖質(zhì)量（g）。

1.2.3 Msp-1 硒酸化處理 參考劉韞滔等[19]HNO3-Na2SeO3方法，準(zhǔn)確稱取5 g Msp-1 粉末置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 硝酸溶液（0.1 mol/L），45 ℃磁力攪拌使其全部溶解，加入2.5 g 亞硒酸鈉，溶解后再加入15 g 氯化鋇，密封70 ℃磁力攪拌10 h，冷卻至室溫，通過碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至6.5～7.5，加入足量硫酸鈉，振蕩使Ba2+全部沉淀，5000 r/min 離心，將上清液置于透析袋中，截留分子量7000 Da，向透析液中加入抗壞血酸至溶液不變色為止。參考1.2.1 方法，加入無水乙醇沉淀，依次經(jīng)無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，蒸餾水溶解透析，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并真空冷凍干燥得到硒酸化羊肚菌多糖（Se-Msp1）。

1.2.4 Msp-1 和Se-Msp1 化學(xué)組成分析 樣品中硒含量測(cè)定采用GB 5009.93-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》[20]；多糖含量測(cè)定以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚-硫酸法測(cè)定[18]，y=2.4438x+0.0846，R2=0.9985；蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[21]，y=0.0171x+0.0052，R2=0.9991；糖醛酸含量測(cè)定采用間羥基聯(lián)苯法[22]，y=0.0022x+0.0014，R2=0.9997。

1.2.5 Msp-1 和Se-Msp1 的傅里葉變換紅外光譜測(cè)定 分別稱取適量Msp-1 和Se-Msp1 樣品粉末，加入溴化鉀粉末，混合研磨充分，并在油壓機(jī)上將混合粉末制成透明薄片，在紅外光譜儀上掃描，掃描波長(zhǎng)為4000～500 cm-1，設(shè)置分辨率4 cm-1。

1.2.6 Msp-1 和Se-Msp1 分子量測(cè)定 分別配制分子量為4.32×103、1.26×104、6.06×104、1.1×105、2.89×105、5.0×105、2.45×106Da 的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mg/mL，同時(shí)配制1 mg/mL 的樣品溶液。參考竇祖滿的[23]方法，采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定樣品重均分子量（Mw）和數(shù)均分子量（Mn）大小。

1.2.7 Msp-1 和Se-Msp1 的粒徑和電位測(cè)定 分別配制濃度為1 mg/mL 的Msp-1 和Se-Msp1 溶液，在室溫條件通過納米粒度電位儀測(cè)量樣品的粒徑大小和Zeta 電位。

1.2.8 Msp-1 和Se-Msp1 的電鏡掃描 分別稱取Msp-1 和Se-Msp1 粉末0.5 g，均勻噴灑在導(dǎo)電雙面膠上，真空噴金處理，在掃描電子顯微鏡下2000 倍觀察。

1.2.9 Msp-1 和Se-Msp1 單糖組成測(cè)定 分別配制鼠李糖（rhamnose，Rha）、半乳糖（galactose，Gal）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalUA）、葡萄糖（glucose，Glu）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcUA）、甘露糖（mannose，Man）、木糖（xylose，Xyl）、巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）單糖標(biāo)準(zhǔn)品和Msp-1、Se-Msp1 樣品5 mg/mL，參考金鑫等[24]的方法進(jìn)行PMP 柱前衍生，配制流動(dòng)相A[0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）]和B（乙腈），所有溶液均經(jīng)0.45 μm 過濾。流動(dòng)相設(shè)置A:B=83:17，柱溫40 ℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。

1.2.10 大鼠抗疲勞能力測(cè)定 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后，通過游泳訓(xùn)練剔除游泳不適大鼠，取30 只隨機(jī)分成6 組，每組5 只，分別為空白對(duì)照組（Con）、陽性對(duì)照組（紅景天苷）、普通多糖組（Msp-1）、硒多糖低劑量組（Se-Msp1-L）、硒多糖中劑量組（Se-Msp1-M）、硒多糖高劑量組（Se-Msp1-H）。多糖處理組每天灌胃劑量參考曹亮[25]的方法，紅景天苷和Msp-1劑量均為100 mg/kg，Se-Msp1-L、Se-Msp1-M、Se-Msp1-H 灌胃劑量分別為50、100 和200 mg/kg，Con組每天灌胃無菌生理鹽水，灌胃體積均為0.1 mL/（10g·bw），連續(xù)灌胃5 周，并在每周最后一天灌胃前對(duì)大鼠稱重。試驗(yàn)的最后一次灌胃結(jié)束后大鼠休息60 min，在大鼠尾根處系8%體重鉛塊進(jìn)行力竭游泳運(yùn)動(dòng)，水溫（30±2）℃，水深30 cm，當(dāng)大鼠四肢運(yùn)動(dòng)遲緩，頭部沉入水下10 s 未浮起時(shí)，游泳結(jié)束，記錄大鼠從放入水中到結(jié)束游泳的時(shí)間。

1.2.11 大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞模型建立 取30 只大鼠按體重隨機(jī)分成6 組，分別為安靜對(duì)照組（Q-CG）、運(yùn)動(dòng)疲勞對(duì)照組（E-CG）、陽性對(duì)照（紅景天苷）、普通多糖組（Msp-1）、硒多糖低劑量組（Se-Msp1-L）、硒多糖中劑量組（Se-Msp1-M）、硒多糖高劑量組（Se-Msp1-H），每組5 只。Q-CG 組、E-CG 組每天灌胃無菌生理鹽水，紅景天苷、多糖組灌胃劑量同方法1.2.10，Q-CG 組不運(yùn)動(dòng)，E-CG 組、紅景天苷組、Msp-1組、Se-Msp1 組每天均進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)。灌胃結(jié)束后休息1 h，在大鼠尾根處系5%體重鉛塊進(jìn)行力竭游泳運(yùn)動(dòng)，游泳結(jié)束后吹干毛發(fā)放入鼠籠繼續(xù)飼養(yǎng)，周一至周六上午進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)，周日休息，連續(xù)進(jìn)行5 周，建立大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞模型。

1.2.12 大鼠體內(nèi)糖原、血乳酸、血尿素氮含量測(cè)定

在運(yùn)動(dòng)疲勞模型試驗(yàn)中，大鼠最后一次力竭運(yùn)動(dòng)結(jié)束休息1 h 后，通過麻醉處死，迅速使用注射針刺入血管采血，離心后取上清液保存于凍存管中，同時(shí)解剖取后肢四頭肌肌肉（骨骼?。?、肝臟，使用4 ℃生理鹽水清洗干凈并用濾紙吸干表面水分后，剪碎保存于凍存管中，液氮預(yù)冷30 min，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。通過試劑盒測(cè)定血清中BLA、BUN 含量，取肝臟和骨骼肌肌肉組織，研磨并加入試劑盒提取液，離心取上清液，試劑盒測(cè)定肝臟中HG 和骨骼肌中MG 含量。

1.2.13 骨骼肌線粒體中MDA 含量和抗氧化酶活性測(cè)定 取冰箱保存的骨骼肌肌肉組織，使用線粒體提取試劑盒，按照說明書操作提取獲得骨骼肌線粒體。取線粒體加入裂解液在冰上研磨，離心取上清液待測(cè)，按照試劑盒方法分別測(cè)定線粒體中MDA 含量和SOD、GSH-Px、CAT 活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Excel 2020 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 22.0 one-way ANOVA 統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用±SD 表示，組間數(shù)據(jù)采用LSD 檢驗(yàn)顯著性，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)差異顯著，使用Origin 2018 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌多糖分離純化

經(jīng)計(jì)算，羊肚菌多糖得率為7.21%；圖1A 顯示，經(jīng)過纖維素柱層析共洗脫出3 個(gè)峰，分別為Msp-1（8～18 管）、Msp-2（25～35 管）、Msp-3（50～53 管），占比分別為85.25%、9.38%和2.74%；選取最大組分Msp-1 經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析得到單一洗脫曲線，如圖1B 所示，純化后總多糖質(zhì)量為7.35 g，純化效率為36.75%。研究表明，經(jīng)去離子水洗脫所得的多糖通常為中性多糖，經(jīng)NaCl 溶液洗脫所得多糖通常為酸性多糖[26]。羊肚菌多糖分離所得的Msp-1 為去離子水所洗脫，其為中性多糖，Msp-2 和Msp-3 為NaCl 溶液洗脫所得，均為酸性多糖，說明羊肚菌多糖里中性多糖占比最大，同時(shí)還含有一定的酸性多糖，這與張景等[27]研究一致。

圖1 羊肚菌多糖洗脫曲線Fig.1 Elution curve of Morchella esculenta polysaccharides

2.2 多糖的化學(xué)組成分析

從表1 可知，純化后的羊肚菌多糖（Msp-1）未檢出硒元素，而Msp-1 通過硒酸化得到的多糖（Se-Msp1）中硒含量達(dá)到9.56 mg/g，說明Msp-1 經(jīng)過硒酸化處理，Se 與多糖成功結(jié)合在一起；Msp-1和Se-Msp1 中多糖含量分別為53.67%和54.34%，Se-Msp1中多糖含量略高于Msp-1，但差異不顯著（P＞0.05）。兩種多糖中均檢測(cè)出了少量的蛋白質(zhì)，Msp-1 中蛋白質(zhì)含量顯著高于Se-Msp1（P＜0.05），這可能是多糖樣品結(jié)構(gòu)中存在少量糖蛋白，使得蛋白質(zhì)未清除干凈，而多糖經(jīng)過硒酸化改性后可能引起了糖蛋白的降解或新引入的Se 官能團(tuán)取代了糖蛋白分子，從而使得硒酸化改性后的Se-Msp1 中蛋白質(zhì)含量顯著降低（P＜0.05），這與楊燕敏等[28]、童微等[29]研究結(jié)果較一致。另外，多糖樣品中均含有糖醛酸，Msp-1 中糖醛酸含量較低，而Se-Msp1 中糖醛酸含量高達(dá)36.82%，Msp-1 主要為中性多糖，Se-Msp1 為酸性多糖，說明羊肚菌多糖經(jīng)硒酸化處理可將中性多糖轉(zhuǎn)變成酸性多糖，這與柯宏偉等[30]的研究結(jié)果一致。

表1 兩種多糖的化學(xué)組成Table 1 Chemical composition of two polysaccharides

2.3 多糖的紅外光譜分析

從圖2 可知，Msp-1 和Se-Msp1 兩種多糖在3358、2928、1633、1422、1118、889 cm-1處有相同的特征吸收峰，3358 cm-1處由羥基（O-H）伸縮振動(dòng)引起，2928 cm-1處由C-H 基團(tuán)（CH-、CH2-、CH3-）伸縮振動(dòng)引起，1633 cm-1處可能為C=O 不對(duì)稱拉伸振動(dòng)，亦或?yàn)轸然鶊F(tuán)中H 的去質(zhì)子化和酯化，1422 cm-1處為CH-的變形振動(dòng)引起、1118 cm-1處為C-O-C 的伸縮振動(dòng)引起，889 cm-1處為吡喃葡萄糖的特征吸收峰。這些特征吸收峰表明Msp-1 和Se-Msp1 為典型的多糖結(jié)構(gòu)，均存在吡喃糖環(huán)，其異頭碳為α構(gòu)型[31-32]。這與TENG 等[10]、LI 等[33]、KUANG 等[34]研究結(jié)果一致。同時(shí)也說明硒酸化處理得到的Se-Msp1，其紅外光譜圖與Msp-1 變化較小，硒酸化并未對(duì)多糖主鏈結(jié)構(gòu)引起較大的改變，Se-Msp1 依舊保留了多糖的原有構(gòu)型。然而，Se-Msp1的光譜圖中1189、765、604 cm-1處存在特有的吸收峰，研究表明1189 cm-1多由Se=O 伸縮振動(dòng)引起，765 cm-1多由O-Se-O 伸縮振動(dòng)引起，604 cm-1多由Se-O-C 伸縮振動(dòng)引起[35]。上述結(jié)果表明，Msp-1 的硒酸化處理較成功，無機(jī)硒（Na2SeO3）通過共價(jià)鍵與多糖較好的結(jié)合在一起。

圖2 Msp-1 和Se-Msp1 紅外光譜分析Fig.2 Infrared spectral analysis of Msp-1 and Se-Msp1

2.4 多糖的分子量、粒徑和電位分析

建立葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為lg Mw=0.025x+0.788；圖3 可知，Msp-1 的出峰時(shí)間為21.88 min，Se-Msp1的出峰時(shí)間為20.18 min，分別計(jì)算得到Msp-1、Se-Msp1 的Mw分別為1.574×106、3.482×105Da，Mn分別為1.337×106、3.397×105Da。表2 可知，Msp-1 分子量、分散系數(shù)（PDI）均大于Se-Msp1，Se-Msp1 的PDI 值接近1，說明硒化改性降低了多糖分子量，提高了多糖均一性和穩(wěn)定性[36]，該結(jié)果與柯宏偉等[30]研究結(jié)果一致，可能硒化處理破壞了多糖結(jié)構(gòu)，使其分子量變小，更易于與Se 基團(tuán)結(jié)合。研究表明，小分子量多糖在機(jī)體內(nèi)更易被吸收利用，其生物活性往往高于大分子量多糖[37]，據(jù)此推測(cè)Se-Msp1 的生物活性可能高于Msp-1。

表2 Msp-1 和Se-Msp1 的分子量、粒徑、電位分析Table 2 Molecular weight,particle size,and potential analysis of Msp-1 and Se-Msp1

圖3 Msp-1 和Se-Msp1 分子量分布Fig.3 Molecular weight distribution of Msp-1 and Se-Msp1

從表2 可知，Msp-1 的粒徑顯著大于Se-Msp1（P＜0.05），Se-Msp1 的粒徑降低了49.00%，而Se-Msp1 的絕對(duì)電位相比Msp-1 提高了191.22%（P＜0.05），可見Se-Msp1 的分散度較高，穩(wěn)定性好，說明硒酸化修飾使得多糖表面電荷絕對(duì)值顯著升高，進(jìn)一步提高了羊肚菌多糖在溶液體系中的穩(wěn)定性，本研究結(jié)果與古佩嫻等[38]、LIAO 等[39]研究結(jié)果一致。

2.5 多糖電鏡觀察

圖4 為Msp-1 和Se-Msp1 在2000 倍下的掃描電鏡圖。圖中顯示，Msp-1 形貌不規(guī)則，凹凸不平，緊密連系在一起，粘性較強(qiáng)，在溶液狀態(tài)下易凝結(jié)，剛性較強(qiáng)；Se-Msp1 表面同樣凹凸不平，但存在大量的溝壑，表面有很多裂紋，在溶液中易分散溶解，不凝結(jié)，穩(wěn)定性強(qiáng)。說明硒酸化改性使得多糖的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了較大的變化，提高了Se-Msp1 的穩(wěn)定性。劉韞滔等[19]、古佩嫻等[38]分別對(duì)牛肝菌和猴頭菇多糖硒化改性處理，均發(fā)現(xiàn)硒化改變了多糖的結(jié)構(gòu)，硒多糖的穩(wěn)定性更好，這與本研究結(jié)果較一致。

圖4 Msp-1 和Se-Msp1 的掃描電鏡圖（2000×）Fig.4 Scanning electron microscopy of Msp-1 and Se-Msp1(2000×)

2.6 多糖的單糖組成分析

Msp-1 和Se-Msp1 兩種多糖的單糖組成見圖5。與單糖標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Msp-1 主要由Man、Glc和Gal 組成，根據(jù)峰面積歸一法，Man:Glc:Gal=1:5.64:3.28。多糖經(jīng)硒酸化修飾后，發(fā)現(xiàn)Se-Msp1主要由Man、GlcUA、Glc、GalUA、Gal 組成，摩爾比1:0.42:3.57:3.34:1.86。Msp-1 未檢測(cè)到糖醛酸，可能由于含量較低未檢測(cè)出，說明Msp-1 的主鏈主要為中性多糖，Se-Msp1 中糖醛酸含量占比為36.91%，其主鏈可能為中性多糖側(cè)鏈則為酸性多糖。ZHANG 等[40]和LI 等[33]對(duì)羊肚菌多糖進(jìn)行單糖分析，其結(jié)果均顯示羊肚菌多糖主要由甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）和半乳糖（Gal）組成，葡萄糖含量均最高，這與本研究結(jié)果一致。楊燕敏等[28]和王麗波等[41]分別對(duì)紅棗多糖和蒲公英多糖進(jìn)行硒化改性，結(jié)果表明，硒化多糖會(huì)改變單糖的組成及摩爾比，且糖醛酸含量明顯增高，這與本研究結(jié)果相似。本研究中羊肚菌多糖硒酸化處理后，單糖組成中增加了葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，使得多糖從中性變成了酸性，出現(xiàn)這一原因可能是多糖在HNO3和Na2SeO3作用下破壞了糖苷鍵，多糖得到了修飾和加工[42]。

圖5 Msp-1 和Se-Msp1 的單糖組成Fig.5 Monosaccharide composition of Msp-1 and Se-Msp1

2.7 Se-Msp1 對(duì)大鼠力竭游泳時(shí)間的影響

從圖6 可知，在整個(gè)試驗(yàn)周期中，各組大鼠體重均呈現(xiàn)大幅升高，在試驗(yàn)前和試驗(yàn)的第1、2、3、4、5 周時(shí)，不同處理組間的大鼠體重均不存在顯著差異（P＞0.05），大鼠體重增加是正常的生長(zhǎng)發(fā)育引起，說明灌胃紅景天苷和Msp-1、Se-Msp1 均對(duì)大鼠生長(zhǎng)不存在顯著的促進(jìn)或抑制作用。與Con 相比，紅景天苷和兩種多糖均顯著提高了大鼠力竭游泳時(shí)間（P＜0.01）；與紅景天苷相比，Msp-1 和Se-Msp1-L 組大鼠力竭游泳時(shí)間顯著降低（P＜0.05），Se-Msp1-M 不存在顯著差異（P＞0.05），而Se-Msp1-H 組力竭游泳時(shí)間顯著提高了7.28%，另外，與Se-Msp1-L 相比，Se-Msp1-M、Se-Msp1-H 組力竭游泳時(shí)間分別顯著提高了9.25%（P＜0.05）和20.69%（P＜0.01），與Se-Msp1-M 相比，Se-Msp1-H 組大鼠力竭游泳時(shí)間顯著提高了10.47%（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，Msp-1、Se-Msp1 均具有較好的抗疲勞作用，兩者中Se-Msp1 效果更好。

圖6 Se-Msp1 對(duì)大鼠體重和力竭游泳時(shí)間的影響Fig.6 Effect of Se-Msp1 on the weight and exhaustive swimming time in rats

2.8 Se-Msp1 對(duì)大鼠肝糖原（HG）和肌糖原（MG）含量的影響

HG 和MG 是給機(jī)體提供能量的主要糖原形式，糖原儲(chǔ)備與機(jī)體的抗疲勞能力呈正相關(guān)，糖原儲(chǔ)備越多機(jī)體的抗疲勞能力越強(qiáng)[43]。從圖7 可知，與QCG 相比，E-CG、紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 組大鼠體內(nèi)HG、MG 含量均顯著降低（P＜0.01），說明力竭游泳運(yùn)動(dòng)消耗了體內(nèi)大量的糖原，運(yùn)動(dòng)疲勞模型建立較成功；與E-CG 相比，紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1的HG 和MG 含量均顯著提高（P＜0.01），與Se-Msp1-L 相比，Se-Msp1-M、Se-Msp1-H 組HG 含量分別顯著提高了18.05%（P＜0.05）、30.40%（P＜0.01），MG含量分別顯著提高了22.12%（P＜0.01）、30.91%（P＜0.01），說明紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 均提高了大鼠體內(nèi)糖原儲(chǔ)備，發(fā)揮了較好的抗疲勞作用，且Se-Msp1 的抗疲勞效果與劑量呈依賴關(guān)系，這與曹亮[25]的研究結(jié)果相一致。另外，在相同劑量下，與Msp-1 相比，Se-Msp1-M 的HG 和MG 含量分別提高了19.04%、8.89%，表明硒酸化得到的酸性多糖Se-Msp1 對(duì)提高糖原儲(chǔ)備具有更好的效果。SHAO等[44]、呂亞輝等[16]分別在研究茶葉硒多糖和靈芝硒多糖的抗疲勞作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)這兩種硒多糖均顯著提高了大鼠體內(nèi)糖原含量，本文研究的羊肚菌硒多糖具有同樣的效果。

圖7 Se-Msp1 對(duì)大鼠體內(nèi)HG、MG 含量的影響Fig.7 Effect of Se-Msp1 on HG and MG contents in rats

2.9 Se-Msp1 對(duì)大鼠血清乳酸（BLA）和尿素氮（BUN）含量的影響

機(jī)體在運(yùn)動(dòng)過程中會(huì)產(chǎn)生BLA 和BUN 等代謝產(chǎn)物，降低了機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力[6]。從圖8 可知，與QCG 相比，運(yùn)動(dòng)疲勞組的E-CG、紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 組大鼠血清內(nèi)BLA、BUN 含量均顯著升高（P＜0.01），且E-CG 組的增幅最大，說明大鼠在力竭游泳運(yùn)動(dòng)過程中體內(nèi)產(chǎn)生大量的乳酸和尿素氮，堆積的乳酸和尿素氮滲透到了血清中；與E-CG 相比，紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 低、中、高劑量組大鼠血清內(nèi)BLA 和BUN 含量均呈顯著降低（P＜0.01），在相同劑量下，與Msp-1 相比，Se-Msp1-M 組BLA 和BUN 分別顯著降低了8.83%、21.44%（P＜0.05、P＜0.01）；與Se-Msp1-L 相比，Se-Msp1-M、Se-Msp1-H 組BLA 含量分別顯著降低了21.45%、28.72%（P＜0.01），BUN 含量分別顯著降低了14.01%、21.56%（P＜0.05、P＜0.01）。上述結(jié)果說明，紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 均顯著降低了大鼠體內(nèi)BLA和BUN 含量，具有較好的抗疲勞效果，Se-Msp1 效果優(yōu)于Msp-1。QIAN 等[9]發(fā)現(xiàn)羊肚菌硒多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和提高機(jī)體的免疫力效果優(yōu)于普通羊肚菌多糖，這一研究結(jié)果與本研究結(jié)果共同表明硒化的羊肚菌多糖具有更高的生物活性。

圖8 羊肚菌多糖對(duì)大鼠血清中BLA 和BUN 含量的影響Fig.8 Effects of Morchella polysaccharide on BLA and BUN in rat serum

2.10 Se-Msp1 對(duì)大鼠骨骼肌線粒體內(nèi)丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性的影響

機(jī)體的運(yùn)動(dòng)主要靠骨骼肌完成，骨骼肌內(nèi)線粒體中氧化應(yīng)激水平升高會(huì)抑制線粒體的合成，進(jìn)而影響到ATP 的生成，降低機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力[45]。從圖9 可知，與Q-CG 相比，E-CG 組大鼠骨骼肌線粒體內(nèi)MDA 含量顯著升高（P＜0.01），SOD、CAT 和GSH-Px 活性均顯著降低（P＜0.01），說明大鼠在運(yùn)動(dòng)疲勞狀態(tài)下，骨骼肌線粒體內(nèi)積累了大量的MDA，使得抗氧化酶活性降低，細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平升高。與E-CG 相比，紅景天苷、Msp-1、Se-Msp1 低、中、高劑量組MDA 含量均顯著降低（P＜0.01），抗氧化酶活性均顯著升高（P＜0.01），與Se-Msp1-L 相比，Se-Msp1-M、Se-Msp1-H 組MDA 含量分別顯著降低了8.11%、15.02（P＜0.05），SOD、CAT、GSH-Px 活性分別顯著升高了24.52%、20.44%、26.45%和38.86%、37.34%、45.06%（P＜0.01）。綜上，Msp-1、Se-Msp1 在大鼠體內(nèi)均發(fā)揮了較好的抗氧化作用，顯著降低了大鼠骨骼肌線粒體的氧化應(yīng)激水平，從而發(fā)揮較好的抗疲勞作用。此外，相同劑量下，Se-Msp1-M 組MDA 含量和抗氧化酶活性均與紅景天苷組不存在顯著差異（P＞0.05），而Se-Msp1-M 組MDA 含量低于Msp-1 組，抗氧化酶活性則均高于Msp-1 組，進(jìn)一步提示羊肚菌硒化多糖的抗疲勞作用高于普通多糖，呂亞輝等[16]、姚萬玲[46]分別對(duì)靈芝多糖和黨參多糖進(jìn)行硒化修飾，所得到的硒多糖其清除自由基能力和提高抗氧化酶活性的能力均顯著高于普通多糖。

圖9 Se-Msp1 對(duì)大鼠骨骼肌MDA 含量和抗氧化酶活性的影響Fig.9 Effects of Se-Msp1 on MDA content and antioxidant enzyme activity in skeletal muscle of rats

3 結(jié)論

本研究從羊肚菌子實(shí)體中提取得到羊肚菌普通多糖，經(jīng)纖維素柱層析分離得到一個(gè)最大組分Msp1，其占比達(dá)到85.25%；將其通過硒酸化處理得到羊肚菌硒多糖（Se-Msp1），化學(xué)組分分析發(fā)現(xiàn)Se-Msp1 中硒含量達(dá)到9.56 mg/g，多糖含量為56.34%，紅外光譜分析表明，其異頭碳為α構(gòu)型，重均分子量為3.482×105Da。單糖組成分析結(jié)果顯示，Se-Msp1 由Man、GlcUA、Glc、GalUA、Gal 等單糖組成，具體的摩爾比為1:0.42:3.57:3.34:1.86，其中糖醛酸占比36.91%，推測(cè)Se-Msp1 的主鏈可能為中性多糖側(cè)鏈為酸性多糖。在大鼠的抗疲勞能力測(cè)定試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Msp-1 和Se-Msp1 均極顯著提高了大鼠力竭游泳時(shí)間（P＜0.01），表現(xiàn)出較好的抗疲勞效果，在大鼠的運(yùn)動(dòng)疲勞模型中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Se-Msp1 不僅極顯著提高了HG、MG含量（P＜0.01），還降低了BLA、BUN 含量（P＜0.01），同時(shí)還降低了骨骼肌中線粒體內(nèi)MDA 含量（P＜0.01），提高了線粒體內(nèi)抗氧化酶活性（P＜0.01），進(jìn)而表現(xiàn)出較好的抗疲勞作用。另外，經(jīng)過硒酸化得到的Se-Msp1 的抗疲勞作用效果顯著高于普通多糖Msp-1。本研究為羊肚菌多糖的深入開發(fā)利用提供了新思路，同時(shí)也為開發(fā)天然有機(jī)硒補(bǔ)充劑提供了理論參考，接下來將會(huì)繼續(xù)研究解析羊肚菌硒多糖結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步分析硒多糖的抗疲勞作用機(jī)制。