乳酸菌發(fā)酵對雞骨泥鈣釋放及代謝物的影響

王 明，夏 強，孫楊贏，何 俊，潘道東，曹錦軒，周昌瑜

（寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白精深加工重點實驗室，浙江寧波 315211）

中國是畜禽產品生產大國，2022 年全國豬牛羊禽屠宰產量達9227 萬噸，且呈逐年增長趨勢[1]。骨架是屠宰畜禽后的主要副產物之一，含有人體所需的氨基酸、維生素以及礦物質等。骨架中鈣磷比約為2:1[2]，與人體最佳吸收比例相當，可作為天然鈣源。豬牛羊骨架有80%以上用于生產煲湯類食品原料[3]，而禽類骨架則被視為廢棄物大量丟棄[4]。這不僅造成資源的浪費，而且對環(huán)境造成嚴重污染。因此，開發(fā)高值化利用禽骨的有效技術十分必要。

盡管生物兼容性與人體骨骼中鈣形態(tài)非常類似，但動物骨中的鈣以羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HAP）形式存在，無法被人體直接利用[5]。目前，通常采用酸解法和酶解法等方法溶出骨骼中的可溶性鈣，實現(xiàn)動物骨架回收。酸解法是利用強酸破壞骨膠原中的三螺旋結構，使HAP 裸露出來。然后，酸進一步與羥基磷灰石作用，將骨鈣轉化為可溶性鈣[6]。但酸解法通過破壞骨膠原高級結構進一步釋放磷酸鈣在中性或堿性條件下溶解度不高，而人體對鈣的吸收主要發(fā)生酸堿環(huán)境呈中性的小腸中，不利于人體的吸收。酶解法則是利用蛋白酶對骨膠原纖維的分解作用釋放骨鈣。然而，酶解法僅能作用于動物骨中的膠原纖維，骨鈣的轉化效果十分有限，僅為1/6[7]，仍有大量骨膠原蛋白和以骨礦形式的鈣磷存在于骨渣中，且酶解易使酶解液產生苦味肽，使酶解液呈苦味，不利于后期的開發(fā)利用[8]。

生物發(fā)酵法可通過微生物發(fā)酵作用促使骨泥中鈣的釋放[9]。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能夠利用碳水化合物發(fā)酵產生乳酸的細菌微生物，已有研究表明乳酸菌發(fā)酵得到的鈣離子含量顯著高于蛋白酶酶解得到的，并且發(fā)酵后的膠原蛋白可以被降解成小分子肽，更加有利于人體的吸收。閆凜等[8]利用植物乳桿菌發(fā)酵羊骨液發(fā)現(xiàn)鈣離子的釋放與植物乳桿菌的活菌數(shù)呈極顯著正相關。唐勇等[10]利用乳酸菌發(fā)酵豬骨顯著提升了骨架HAP 中游離鈣釋放。雞骨中蛋白質與脂肪的含量高于豬牛羊骨而灰分更低，具有更高的營養(yǎng)價值[11]。然而當前研究中，乳酸菌發(fā)酵雞骨泥釋放鈣的代謝機理尚未被研究。

因此，本研究構建了乳酸菌與雞骨泥的發(fā)酵體系，定量分析發(fā)酵產物中鈣釋放量及其形態(tài)分布、代謝產物組成及其含量變化，并通過多元統(tǒng)計和KEGG分析乳酸菌代謝通路，旨在揭示骨泥發(fā)酵過程中乳酸菌的代謝與鈣釋放的關聯(lián)途徑。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮雞骨架（骨上附少量雞肉）冷凍運輸至實驗室，河南大用實業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶（2000 U/mg）、六偏磷酸鈉、溴化鉀、鹽酸、氫氧化鈉、蔗糖均為分析級，生工生物工程有限公司；甲酸、乙腈均為色譜級，美國Fisher Chemical 公司；MRS 培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司；RIPA 細胞裂解液（強）碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為分析純；實驗用水均為超純水；植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarumA3，LP）、羅伊氏乳桿菌（Limosilactobacillus reuteriWQ-Y1，LR）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilusCICC6074，LA）均由浙江省動物蛋白食品加工技術重點實驗室菌種庫保存。

QM-3SP2 雙行星球磨機 南京南大儀器有限公司；Five Easy Plus 20 酸堿pH 計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SCIENTZ-IID 超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Allegra 64R 高速冷凍臺式離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；噴霧干燥機 上海派勒克儀器設備有限公司；ACQUITY UHPLC 系統(tǒng) 美國沃特世公司；三重TOF 5600 MS Xevo G2-XSQ-TOF 美國沃特世公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）美國沃特世公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞骨粉的制備 參考Zuo 等[12]的方法并稍做修改：去除雞骨架上的肉、血、脂肪和骨膜后，121 ℃滅菌15 min，冷卻后重新洗凈骨頭以去除脂肪和肉。然后將磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH=7）以質量比3:1 的比例加入骨塊中制備骨液。在骨液中加入木瓜蛋白酶（5000 U/g），50 ℃恒溫水浴中酶解4 h，煮沸10 min 使酶失活，再次清洗以去除雞骨表面的蛋白油脂等。將骨塊放入60 ℃烘箱中干燥12 h后，使用粉碎機粉碎再過200 目篩，用雙行星球磨機研磨2.5 h，其中鎬珠、骨粉與水的質量比為10:1:3。研磨后的骨顆粒在噴霧干燥機中干燥，得到雞骨粉。

1.2.2 發(fā)酵雞骨泥及凍干樣品的制備 雞骨泥培養(yǎng)基的制備：將雞骨粉、蔗糖與水按質量比5:7:88 混合，pH 調至6.5，121 ℃滅菌20 min 后，冷卻至室溫制備成骨泥培養(yǎng)基。

雞骨泥發(fā)酵液的制備：取活化后的LP、LR、LA 菌液3 mL 分別接種到100 mL 雞骨泥培養(yǎng)基中，空白組加3 mL 滅菌后的MRS 培養(yǎng)基記為CK，38 ℃下發(fā)酵。

發(fā)酵骨泥凍干樣品制備：取發(fā)酵完成的骨泥發(fā)酵液離心（300×g、4 ℃、5 min）后收集沉淀物，用去離子水反復洗滌三次，凍干后制成發(fā)酵骨泥樣品，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生長曲線的測定 分別取發(fā)酵0、12、24、30、36、42、46、50 和54 h 的雞骨泥發(fā)酵液，用無菌生理鹽水梯度稀釋，選取適宜的梯度，在MRS 固體培養(yǎng)基上進行涂布，38 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)24 h，記錄活菌菌落數(shù)，單位為CFU/mL，并繪制生長曲線。

1.2.4 乳酸菌發(fā)酵骨泥液pH 和總酸度的測定 取5 mL 發(fā)酵過程中的雞骨泥液，使用酸堿pH 計測定pH；參考Xu 等[13]的方法對發(fā)酵液的總酸度進行測定。

1.2.5 鈣的分布和含量的測定 取發(fā)酵完成的雞骨泥發(fā)酵液，離心（300×g、4 ℃、5 min）后保留上清液，得到發(fā)酵液A，-4 ℃冷藏備用。取發(fā)酵液A 經離心（4000×g、4 ℃、20 min）后，將上清液通過0.22 μm的水相濾膜以去除菌體及其他難溶性物質得到去菌體發(fā)酵液B。取10 mL 發(fā)酵液A 于試管中，加入細胞裂解液500 μL，混勻后在冰浴中超聲波（350 W、20 min、5 pulse）破碎，使細胞內容物釋放到發(fā)酵液中，離心（10000×g、4 ℃、20 min）后經過0.22 μm 水相濾膜過濾得到發(fā)酵液C，使用火焰原子吸收光譜法[14]分別測定發(fā)酵液A 中的總鈣含量ω，mg/kg；發(fā)酵液B 為乳酸菌胞外鈣含量ω1，mg/kg；發(fā)酵液C 游離態(tài)鈣含量ω2，mg/kg；計算化合態(tài)鈣含量ω3=ωω2[15]。

1.2.6 發(fā)酵骨泥的能量色散光譜（Energy Dispersive Spectroscopy，EDS）表征 利用能量色散光譜儀對發(fā)酵骨泥凍干樣品進行點掃。取每個樣品的不同位置測量鈣和磷含量，計算平均鈣磷比率和標準偏差。

1.2.7 發(fā)酵骨泥的傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）表征 取發(fā)酵骨泥凍干樣品與KBr 按1:50 的比例混合研磨，壓成薄膜，并在波長為4000～400 cm-1范圍之間進行傅里葉紅外光譜掃描。

1.2.8 發(fā)酵骨泥的X-射線衍射（X-ray diffractometer，XRD）表征 采用X 射線衍射儀測定發(fā)酵骨泥凍干樣品的相對結晶度。測試條件為電壓40 kV，管流20 mA，掃描區(qū)域20°～36°，掃描速度為2°/min。

1.2.9 發(fā)酵骨泥產物質譜分析 樣品的前處理[16]：取10 mL 骨泥發(fā)酵液，離心（4000×g、4 ℃、5 min）后收集上清液并通過0.22 μm 濾膜。取5 mL 上述濾液于EP 管中，加入20 μL 內標（1000 ng/mL 水楊酸溶液）混勻后，轉移至LC 進樣小瓶，進行LC-MS/MS 分析。

液相色譜和質譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱；柱溫為45 ℃；流速為0.4 mL/min；流動相為0.1%甲酸（A）和含0.1%甲酸的乙腈（B）的混合物。色譜梯度程序：0～2 min（A:B=98:2）、2～4 min（A:B=75:25）、4～7.5 min（A:B=40:60）、7.5～9.5 min（A:B=10:90）、9.5～12.7 min（A:B=1:99）、12.7～16 min（A:B=98:2）；掃描范圍為50～1000 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS 軟件包（Version 25.0）對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 差異顯著，P＜0.01 差異極顯著。質譜原始數(shù)據(jù)使用Progenesis QI（Version 2.3）處理并對比代謝組學數(shù)據(jù)庫（HMDB，https://www.hmdb.ca/）和Chemspider 數(shù)據(jù)庫（https://www.chemspider.com/）進行匹配獲得代謝物信息。通過聚類分析和PCA 分析確定差異代謝物。查找通路數(shù)據(jù)庫（https://www.metaboanalyst.ca/）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫確定差異代謝富集的代謝通路。

2 結果與分析

2.1 骨泥中菌落生長曲線、pH 及總酸變化

生長曲線反映了細菌數(shù)量、生長狀況和代謝情況。如圖1A 所示，LP、LR 和LA 的活菌數(shù)在0～12 h 呈對數(shù)型增長，12 h 后趨于平穩(wěn)，生長速度放緩，進入穩(wěn)定期；LA 組和LR 組的活菌數(shù)在12～30 h保持相對穩(wěn)定，發(fā)酵30 h 后逐漸下降，而LP 組的活菌數(shù)在12～50 h 保持相對穩(wěn)定，發(fā)酵50 h 后逐漸下降。在三個接菌處理組中，LA 處理組在發(fā)酵24、30、36 h 時活菌數(shù)量極顯著高于LP 和LR 處理組（P＜0.01），在發(fā)酵30 h 時，LP、LR 和LA 活菌數(shù)均達到最大值，分別為22.7、28.5 和33.2×107CFU/mL；而在整個發(fā)酵過程中LP處理組的活菌數(shù)極顯著低于LA 和LR 處理組（P＜0.01）。發(fā)酵過程的pH 和總酸能反映乳酸菌的產酸能力以及菌體耐受能力變化。如圖1B 所示，雞骨泥發(fā)酵液初始pH 約為6.1，在0～30 h 的發(fā)酵期間，3 個接菌處理組在發(fā)酵過程中pH 均下降，30 h 后逐漸穩(wěn)定；在發(fā)酵第30 h 時LA 組、LP 組、LR 組的pH 分別為4.43、4.68 和4.67，LA 組pH 最低說明LA 產酸能力最強。如圖1C 所示，3 個接菌處理組的發(fā)酵液初始總酸含量為0.81 g/L，在0～30 h 內，隨著發(fā)酵的進行，總酸含量迅速增加，30 h 后逐漸穩(wěn)定；發(fā)酵30 h 時，LA、LP 和LR 處理組的總酸含量分別為5.60、3.76 和3.75 g/L，其中LA 組的總酸含量顯著高于LP 組和LR 組（P＜0.05）。以上結果說明三株乳酸菌均能較好的利用骨泥進行生長繁殖并產生酸類物質，且嗜酸乳桿菌在骨泥中的生長繁殖能力和產酸能力優(yōu)于羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌。

圖1 乳酸菌的生長曲線（A）以及發(fā)酵過程中pH（B）和總酸（C）的變化Fig.1 Growth curve of lactic acid bacteria (A),and the changes in pH (B) and total acid (C) during bone paste fermentation

骨中含有豐富的礦物質和膠原蛋白，為乳酸菌的生長和繁殖提供了必要的營養(yǎng)物質[17]；而蔗糖可為乳酸菌提供能量[18]。在本研究中，三株乳酸菌的最大活菌數(shù)均超過了108CFU/mL，說明乳酸菌能夠利用骨泥中的營養(yǎng)物質進行生長繁殖并呈現(xiàn)良好的產酸能力和耐酸性。在發(fā)酵過程中，乳酸菌發(fā)酵產生的代謝物也會影響乳酸菌的活力；隨著發(fā)酵的進行，底物逐漸消耗、代謝產物不斷積累、總酸含量升高、pH下降，從而使得乳酸菌的生長繁殖受到抑制，發(fā)酵逐漸進入后期階段[19]。在發(fā)酵期間，三個處理組的pH 逐漸降低、總酸含量不斷上升；在30 h 時，pH 和總酸含量趨于穩(wěn)定，且活菌數(shù)達到最大值，因此，以30 h 作為發(fā)酵終點，進行后續(xù)理化指標分析。

2.2 骨泥液中鈣分布、鈣形態(tài)以及鈣磷比分析

三株乳酸菌發(fā)酵骨泥的鈣分布如圖2A 所示，發(fā)酵完成時（30 h），LP、LR 和LA 處理組的總鈣含量都顯著高于CK 組（P＜0.05）。與CK 組相比，LR 組、LP 組和LA 組總鈣含量分別從CK 組中181.33 mg/kg上升至1176.67、1310.00 和1916.67 mg/kg。在LA組和LR 組中，去除骨泥中乳酸菌菌體后，總鈣含量顯著下降（P＜0.05），說明這兩株乳酸菌具有一定的富集鈣的能力。骨泥發(fā)酵液中不同形態(tài)的鈣含量如圖2B 所示，三個處理組的游離鈣含量均顯著高于CK 組（P＜0.05）；CK 組中游離鈣含量為25.37 mg/kg，LR 組、LP 組和LA 組游離鈣含量分別是CK 組的40.60 倍、50.19 倍和74.62 倍。相比較于CK 組，LR組中化合態(tài)的鈣含量無顯著差異，而LA 組和LP 組的化合態(tài)鈣含量低于CK 組（P＜0.05）。在3 個處理組中，游離鈣含量均顯著高于化合態(tài)鈣含量（P＜0.05），說明游離鈣是骨泥發(fā)酵液中主要存在形態(tài)，其中LA 組中游離鈣含量（1893.33 mg/kg）顯著高于其他處理組。發(fā)酵骨泥鈣磷比如圖2C 所示，相比于CK 組（2.10±0.11），LA（1.68±0.17）和LR（1.82±0.19）組的鈣磷比值顯著降低（P＜0.05），這可能是由于乳酸菌的發(fā)酵使得骨泥中化合態(tài)的鈣轉變?yōu)橛坞x鈣。這些結果表明，經過乳酸菌的發(fā)酵，溶液中的游離鈣濃度顯著升高，且嗜酸乳桿菌鈣釋放能力最強。

圖2 乳酸菌發(fā)酵骨泥液中的鈣分布（A）、鈣形態(tài)（B）及發(fā)酵骨泥鈣磷比（C）Fig.2 Calcium distribution (A),calcium morphology (B) and calcium-phosphorus ratio (C) of fermented bone paste

乳酸菌可通過發(fā)酵作用分解骨泥來釋放游離鈣[20]。本研究中，各處理組的總鈣含量和游離鈣含量在發(fā)酵完成時均顯著高于CK 組（P＜0.05），其中LA 組總鈣含量和游離鈣含量最高，分別為對照組的10.57 倍和74.62 倍，其主要原因可能是LA 產酸能力最強，能分解更多HAP[21]。此外，相比于CK 組，LP 組和LA 組在發(fā)酵完成時的化合態(tài)的鈣顯著下降（P＜0.05），可能是因為骨泥中化合態(tài)的鈣等經過發(fā)酵轉化為游離鈣[9]。鈣磷比結果表明，LP、LR 和LA 組骨泥樣品表面的Ca/P 比值由CK 組的2.10 分別下降至1.93、1.82 和1.68，這進一步表明了發(fā)酵使得骨粉中的磷酸鈣轉變?yōu)橛坞x鈣。綜上所述，雞骨泥液中鈣的相對含量降低，而游離鈣含量增高，說明乳酸菌通過產酸使雞骨中的HAP 分解，使得鈣釋放到骨泥發(fā)酵液中。

2.3 傅里葉紅外光譜與X 射線衍射圖譜分析

傅里葉紅外光譜可以作為識別雞骨泥中化學鍵和官能團特征變化的工具[22]。紅外光譜如圖3A 所示，與CK 組相比，LA 組、LR 組和LP 組在3379、2926 和1050 cm-1波段處的特征帶峰強度減弱，在1109 cm-1波段出現(xiàn)新吸收峰，其中LA 組在1645 cm-1特征峰紅移至1593 cm-1處，這可能是由于發(fā)酵使得雞骨泥的官能團發(fā)生了改變[23]。圖3B為處理組和對照組骨泥樣品的X 射線衍射圖譜，對比JCPDS 卡號09-0432 可知，所有的樣品中HAP 都以無定型態(tài)形式存在。相比于CK 組，在衍射角2θ=23.8°（米勒指數(shù)111），LA 組衍射峰度降低，LP 組與LR 組特征峰分別藍移至23.4°和23.2°處；LA 組在衍射角2θ=25.8°（002）和2θ=32.0°（211）處較CK 組的衍射峰變小、變寬。這些結果表明乳酸菌發(fā)酵使得雞骨泥發(fā)生了化學結構變化。

紅外光譜中，在3379、2926 和1050 cm-1波段處的吸收峰分別與O-H、P-O 和PO43-有關。本研究中，相比于CK 組，處理組位于3379 cm-1峰強度減弱可能歸因于乳酸菌發(fā)酵使得骨中結合水減少[24]；2926 和1050 cm-1波段吸收強度減弱可能由于乳酸菌發(fā)酵作用使得HAP 分解從而促進鈣的釋放；位于1109 cm-1處的特征峰與P=O 有關，三組實驗組在此處產生新的峰值，可能是由于HAP 在分解過程中產生了新的含磷化合物。位于1600～1700 cm-1處的特征峰主要由C=O（酰胺I 帶）的拉伸振動產生，這與蛋白質的二級結構變化有關[25]，與LR 和LP 相比，LA 組在1645 cm-1發(fā)生紅移現(xiàn)象，這可能是發(fā)酵酶解作用使得雞骨膠原蛋白分解，促進了羥基磷灰石進一步分解，從而釋放更多離子鈣。X 射線衍射中，峰型的尖銳程度可反映HAP 結晶度大小[26]。圖3B中，整個光譜較粗糙，未出現(xiàn)完整的晶形結構，說明發(fā)酵底物呈無定形態(tài)[27]。衍射角2θ=23.8°處，相比于CK 組，LA 組峰度值降低、LP 組和LR 組在衍射峰發(fā)生藍移，說明由于乳酸菌發(fā)酵使HAP 分解，晶相純度降低，即發(fā)酵產生的酸中大量質子置換出了鈣，衍射峰減弱；與其他三組相比，LA 組在2θ=25.8 與2θ=32.0 處的衍射峰降低，說明LA 組骨鈣中HAP晶相變化最大，推測LA 組發(fā)酵作用釋放出更多可溶性鈣。Sharma 等[28]將二氧化鈦摻雜純度較高的HAP后發(fā)現(xiàn)，HAP 中的鈣被鈦取代純度降低，其XRD 圖譜也發(fā)生衍射峰偏移，峰值變低。以上結果表明，經乳酸菌發(fā)酵后，骨泥中化合物的官能團發(fā)生改變，HAP 晶相結晶度降低，鈣的化學形態(tài)發(fā)生改變，發(fā)酵體系中游離鈣含量增大。

2.4 主成分分析（PCA）、聚類熱圖分析以及代謝通路分析

采用LC-MS/MS 對發(fā)酵骨泥中的小分子物質進行分析，共鑒定到37 種發(fā)酵代謝物。主成分（PCA）分析這些代謝物在不同處理間的特征發(fā)現(xiàn)，如圖4A 可知PCA 共產生三個有效主成分，其中第一主成分（PC1）、第二主成分（PC2）和第三主成分（PC3）特征值分別為25.61、7.65 和1.93，方差貢獻率分別為69.2%、20.7%和5.2%，累計貢獻率為95.13%，表明前3 個主成分有效區(qū)分了不同處理組間發(fā)酵骨泥代謝物的特征；PCA 圖顯示，LP、LA、LR 組與CK 組完全分開，說明各處理組中代謝物的組成或含量與CK 組存在顯著差異。分析貢獻PCA模型前三個主成分的貢獻因子發(fā)現(xiàn)丙酮酸（Pyruvate）、CDP、核糖核酸（Riboxin）、5'-CMP 和木酮糖（L-Xylulose）是PC1 的重要貢獻因子；胸苷（Thymidine）、瓜氨酸（Citrulline）、脫氧肌苷（Deoxyinosine）、絲氨酸（L-Serine）、天冬氨酸（LAspartic Acid）、5-羥基-L-色氨 酸（5-Hydroxy-Ltryptophan）、精氨酸（L-Arginine）、精氨酸磷酸鹽（LArginine phosphate）、胞苷（Cytidine）和乳酸（Lactic acid）是PC2 的重要貢獻因子；甲?；?5-羥基犬尿胺（Formyl-5-hydroxykynurenamine）、L-甲?；虬彼幔↙-Formylkynurenine）、蔗糖（Sucrose）、dTMP 和乳清酸核苷（Orotidine）是PC3 的重要貢獻因子。為了更清楚地呈現(xiàn)這些貢獻因子在不同處理組間的差異變化，貢獻主成分分析中前三個主成分的代謝物的聚類熱圖如圖4B 所示，CK 組的樣本聚集為一大類，三個處理組的樣本聚集為另一大類，這與主成分分析的結果一致。相比于CK 組，三個處理組中木酮糖和蔗糖的含量顯著下降（P＜0.05），而丙酮酸和乳酸的含量顯著增加（P＜0.05）；相比于CK 組，三個處理組中游離氨基酸及衍生物如絲氨酸和5-羥基-L-色氨酸顯著增加，而精氨酸、精氨酸磷酸鹽、5'-CMP、dTMP和乳清酸核苷等顯著下降（P＜0.05）。PCA 分析和聚類熱圖分析共同表明，有機酸、游離氨基酸、糖類物質和核苷類物質是影響乳酸菌發(fā)酵骨泥重要代謝物。

圖4 發(fā)酵雞骨泥的代謝產物主成分分析（A）和聚類熱圖分析（B）Fig.4 Principle component analysis (A) and cluster analysis (B) of metabolites of fermented bone paste

為了進一步了解發(fā)酵骨泥中關鍵代謝物與乳酸菌的生物活性和發(fā)酵性能的關系，將關鍵代謝產物與乳酸菌的活菌數(shù)、pH、總酸度值以及游離鈣含量進行相關性分析（r＞0.5 或＜-0.5，P＜0.05）。如圖5 所示，有機酸（丙酮酸和乳酸）、核苷類物質（核糖核酸、脫氧肌苷、CDP 和胞苷）和氨基酸（絲氨酸、瓜氨酸）等與活菌數(shù)呈顯著正相關（P＜0.05），糖類（蔗糖和木酮糖）、核苷類物質（5'-CMP、dTMP 和乳清酸核苷）和氨基酸（精氨酸）等與活菌數(shù)呈顯著負相關P＜0.05）；有機酸（乳酸和丙酮酸）、核苷類物質（核糖核酸、脫氧肌苷、CDP 和胞苷）和氨基酸（絲氨酸、瓜氨酸）等與游離鈣含量呈顯著正相關P＜0.05），糖類（乳酸和丙酮酸）、核苷類物質（5'-CMP 和乳清酸核苷）和氨基酸（精氨酸）等與鈣釋放量呈顯著負相關P＜0.05）。這表明三株菌可以利用糖類物質發(fā)酵骨泥促進酸類物質的產生，從而促進游離鈣的釋放。

圖5 差異代謝物與主要生理指標關系網絡圖Fig.5 Network diagram of the relationship between differential metabolites and key physiological indicators

將上述差異代謝物導入至KEGG 數(shù)據(jù)庫進行匹配，獲取發(fā)酵過程中關鍵代謝物參與的代謝通路信息，進而評估關鍵代謝物的來源及其對鈣釋放的影響。如圖6 所示，通過通路影響因子＞0.08 和P＜0.05對代謝通路進行篩選發(fā)現(xiàn)，三個處理組（LA、LR、LP）的差異代謝物所富集到的代謝通路相似，主要有嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、糖酵解、丙酮酸代謝、?；撬岷痛闻；撬岽x和TCA 循環(huán)。這些富集的代謝通路表明，三個處理組的差異代謝物主要與菌體生長代謝有關。

圖6 植物乳桿菌組（A）、羅伊氏乳桿菌組（B）、嗜酸乳桿菌組（C）發(fā)酵雞骨泥代謝通路Fig.6 Metabolic pathways of fermented chicken bone paste by Lactobacillus plantarum group (A),Lactobacillus reuteri group (B),Lactobacillus acidophilus group (C)

乳酸菌利用蔗糖轉化為葡萄糖和果糖，再通過糖酵解將葡萄糖轉化為丙酮酸，繼而通過丙酮酸途徑合成乳酸[29]，乳酸菌也可將木酮糖通過丙酮酸等途徑轉化為乳酸[30]。蔗糖和木酮糖含量與活菌數(shù)呈負相關，而丙酮酸和乳酸含量與活菌數(shù)呈正相關，說明乳酸菌利用蔗糖和木酮糖作為碳源，通過糖酵解途徑和丙酮酸途徑等代謝途徑產生丙酮酸和乳酸等有機酸。熊濤等[31]在發(fā)酵泡菜時發(fā)現(xiàn)乳酸菌可通過異型乳酸發(fā)酵將蔗糖轉化為乳酸。劉洋[32]發(fā)現(xiàn)利用木酮糖代替蔗糖作為碳源發(fā)酵牛乳后產生大量乳酸。因此，乳酸菌可以將糖類物質經過糖酵解和丙酮酸途徑轉化為乳酸。

有機酸對動物骨骼中HAP 分解的機制主要包括：氫離子促進溶解（酸解）；配體控制的溶解（通過有機酸與磷灰石復合，從而打破金屬氧鍵）[33-35]。代謝物中，丙酮酸作為乳酸的前體物質，可通過糖酵解途徑和TCA 循環(huán)經乳酸脫氫酶（LDH）轉化為乳酸。在發(fā)酵完成時，乳酸菌代謝產生乳酸和丙酮酸與活菌數(shù)和鈣釋放量呈正相關，說明有機酸可能是鈣離子含量增高的關鍵性物質。其中三組乳酸菌發(fā)酵前后乳酸含量發(fā)生顯著變化，LP、LA 和LR 組中的乳酸含量分別是CK 組中的16.18、45.27、16.50 倍，說明乳酸是影響鈣離子釋放最重要的酸性物質。唐勇等[9]利用乳酸菌發(fā)酵豬骨后發(fā)現(xiàn)，豬骨發(fā)酵液中乳酸含量與游離鈣呈正相關。陳黎洪等[35]利用干酪乳桿菌CICC20296 菌株產生的乳酸可使骨泥中Ca2+濃度由0.10 mg/g 增加至10.12 mg/g。這說明乳酸菌在發(fā)酵雞骨泥過程中，通過糖酵解、TCA 等途徑產生乳酸，從而促進骨中HAP 分解并釋放出游離鈣。

核苷類物質和氨基酸在維持生物細胞正常生命活動中不可或缺。核苷類物質廣泛存在于乳酸菌中，如5'-CMP、dTMP 和胞苷主要通過參與嘧啶代謝和嘌呤代謝途徑影響DNA 和RNA 的合成[36]。氨基酸不僅作為蛋白質的組成單位，可以維持乳酸菌生命活動，也可通過酶轉化為乳酸。乳酸菌可利用脫氨酶、脫羧酶將絲氨酸和瓜氨酸等轉化為丙酮酸，丙酮酸繼而進入TCA 循環(huán)產生乳酸，促進鈣的釋放[37]。因此，核苷類物質和氨基酸類物質不僅可以維持菌株正常的生長繁殖過程，也可以為有機酸的產生提供前體物質。綜上，三株乳酸菌通過糖酵解途徑降解發(fā)酵骨泥中的糖類，并通過TCA 循環(huán)產生有機酸，從而提升雞骨泥液中游離鈣的含量。這可能是LA 組游離鈣和有機酸含量最高的重要原因。

3 結論

嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌均能較好的利用骨泥進行生長繁殖并產生大量的酸類物質，發(fā)酵結束時，嗜酸乳桿菌發(fā)酵組的總酸含量顯著高于其他處理組（P＜0.05）。與對照組相比，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵組、植物乳桿菌發(fā)酵組和嗜酸乳桿菌發(fā)酵組總鈣含量分別從對照組的181.33 mg/kg 增加至1176.67、1310.00 和1916.67 mg/kg；游離鈣含量分別是對照組的40.60 倍、50.19 倍和74.62 倍，且嗜酸乳桿菌發(fā)酵組的游離鈣含量顯著高于羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵組（P＜0.05），這表明乳酸菌發(fā)酵顯著增加了骨泥中鈣的釋放。紅外光譜和X 衍射結果表明，發(fā)酵骨泥中HAP 主要以無定型形態(tài)存在，與對照組相比，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵組、植物乳桿菌發(fā)酵組和嗜酸乳桿菌發(fā)酵組中HAP 的特征峰在2926 和1050 cm-1處的強度明顯降低。經乳酸菌發(fā)酵后，骨泥中共鑒定出37 種代謝物，乳酸、丙酮酸、蔗糖等是其關鍵代謝物。嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、糖酵解、丙酮酸代謝、牛磺酸代謝和TCA 循環(huán)是影響乳酸菌生長代謝及參與鈣釋放的關鍵通路。本文探究了乳酸菌發(fā)酵影響鈣釋放的關鍵代謝途徑，為利用生物發(fā)酵法制備補鈣劑進一步研究提供理論依據(jù)。